lncRNA MSC-AS1通過調(diào)節(jié)miR-429/RhoA軸對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響*

程莉雅,吳 潔,牛金明

濰坊市中醫(yī)院耳鼻喉科,山東濰坊 261000

鼻咽癌(NPC)是一種常見的上喉癌,高發(fā)于廣東、廣西等地區(qū)[1]。該疾病發(fā)病隱匿,不易被診斷,大部分鼻咽癌患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期,隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步,患者的長(zhǎng)期生存率雖然明顯增加,但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)依然會(huì)造成患者死亡[2]。因此,探索NPC的發(fā)病機(jī)制對(duì)于確定最佳治療方案至關(guān)重要。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)的特征是一組長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。有研究表明,lncRNA在人類癌癥發(fā)展中起癌基因或腫瘤抑制因子的作用[3]。lncRNA MSC-AS1作為lncRNA家族中的一員,在胰腺導(dǎo)管腺癌中顯著上調(diào),敲低MSC-AS1可明顯抑制癌細(xì)胞增殖,但對(duì)于其是否在NPC中發(fā)揮作用鮮有報(bào)道[4]。近年來的研究表明微小RNA(miRNA)參與癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移,miRNA是20～22個(gè)核苷酸的非編碼RNA,通過特異性結(jié)合和切割mRNA調(diào)節(jié)其同源靶基因的表達(dá)[5]。據(jù)報(bào)道m(xù)iR-429編碼基因位于人類染色體1p36.33上,與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),在大多數(shù)類型的腫瘤如乳腺癌細(xì)胞中,miR-429作為一種腫瘤抑制基因[6]。WANG等[7]研究發(fā)現(xiàn)miR-429過表達(dá)抑制了NPC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性、增殖和侵襲能力,但具體靶向基因尚不清楚。生物信息網(wǎng)站預(yù)測(cè)RhoA、MSC-AS1均與miR-429存在靶向關(guān)系。因此,本研究旨在探討lncRNA MSC-AS1通過調(diào)節(jié)miR-429/RhoA軸對(duì)NPC細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源 中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供人鼻咽上皮細(xì)胞系NP69細(xì)胞及3種NPC細(xì)胞系(CNE-1、HNE2、HONE-1)。

1.2主要試劑、儀器 RNA干擾MSC-AS1(si-MSC-AS1)、miR-429抑制物(miR-429 inhibitor)、miR-429模擬物(miR-429 mimics)及相應(yīng)陰性對(duì)照(si-NC、mimics NC、inhibitor NC)均由廣州市銳博生物科技有限公司提供;所有引物由上海生工合成;FBS、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;TRIzol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自MeRCK公司;Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自BD公司;Transwell小室購(gòu)自美國(guó)密理博公司;結(jié)晶紫染色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自翌圣生物科技有限公司;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司;CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自日本SANYO公司;酶標(biāo)儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司;RhoA、B淋巴細(xì)胞因子相關(guān)x蛋白(Bax)、上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)、細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、神經(jīng)鈣黏蛋白(N-cadherin)抗體及羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自Abcam公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將CNE-1、HNE2、HONE-1、NP69細(xì)胞在含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中孵育。并于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境(37℃、5% CO2)中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CNE-1細(xì)胞,利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒將si-MSC-AS1、miR-429 mimics、miR-429 inhibitor及相應(yīng)陰性對(duì)照si-NC、mimics NC、inhibitor NC分別轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染至CNE-1細(xì)胞,分組記為對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染)、si-NC組、si-MSC-AS1組、mimics NC組、miR-429 mimics組、si-MSC-AS1+inhibitor NC組、si-MSC-AS1+miR-429 inhibitor組。轉(zhuǎn)染48 h后,收集各組細(xì)胞進(jìn)行指標(biāo)分析。

1.4qPCR檢測(cè)MSC-AS1、miR-429、RhoA mRNA表達(dá)水平 使用TRIzol試劑提取各細(xì)胞中的總RNA,然后應(yīng)用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板,使用熒光定量試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以U6、GAPDH為內(nèi)源性對(duì)照,按照2-ΔΔCt公式計(jì)算MSC-AS1、miR-429、RhoA mRNA的相對(duì)表達(dá)量。見表1。

表1 qPCR引物序列

1.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 取各組細(xì)胞分別接種于96孔板中,培養(yǎng)48 h后,加入20 μL MTT溶液,4 h后棄上清液,加入150 μL DMSO,利用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的光密度值(A600值),計(jì)算增殖率,增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A600值-空白組A600值)/(對(duì)照組A600值-空白組A600值)×100%。

1.6Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲、遷移 侵襲實(shí)驗(yàn):在無血清培養(yǎng)基中,將各組CNE-1細(xì)胞接種在頂部的Transwell小室中,該小室涂有Matrigel基質(zhì)。底部室涂有含10% FBS的培養(yǎng)基。之后固定侵入的細(xì)胞,用1%結(jié)晶紫染色并最終通過倒置顯微鏡進(jìn)行評(píng)估。遷移實(shí)驗(yàn):操作步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)一致,但Transwell小室不涂Matrigel基質(zhì)。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞分別接種于24孔板中(2.5×105個(gè)/孔),PBS小心洗滌2次,離心棄上清。將FITC膜聯(lián)蛋白、碘化丙啶添加到每個(gè)樣品中以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。24℃下將這些細(xì)胞孵育10 min,然后通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率、左下角的象限是早期凋亡,右上角的是晚期凋亡。

1.8雙熒光素酶報(bào)告基因活性測(cè)定 分別構(gòu)建野生型(WT)和突變型(MUT)的MSC-AS1、RhoA 3′UTR熒光素酶報(bào)告載體,標(biāo)記為WT-MSC-AS1、MUT-MSC-AS1、WT-RhoA、MUT-RhoA,將熒光素酶報(bào)告載體分別與mimics NC或miR-429 mimics共轉(zhuǎn)染CNE-1細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后測(cè)定熒光素酶活性。

1.9免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平 用RIPA裂解緩沖液提取各細(xì)胞系的總蛋白,并用BCA試劑盒檢測(cè)其濃度。取樣10 μg蛋白質(zhì)上樣,并進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺電泳(PAGE),將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜,用5%脫脂牛奶封閉,并與RhoA、Bax、E-cadherin、CyclinD1、N-cadherin一抗在4 ℃下孵育過夜,然后與羊抗兔IgG二抗室溫孵育2 h。以β-actin為內(nèi)參,Image J軟件分析蛋白灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各細(xì)胞中MSC-AS1、miR-429、RhoA mRNA表達(dá)水平 與NP69細(xì)胞相比,CNE-1、HNE2、HONE-1細(xì)胞中miR-429表達(dá)水平顯著降低,MSC-AS1、RhoA mRNA表達(dá)水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且在CNE-1細(xì)胞中MSC-AS1、MCL1 mRNA表達(dá)水平最高,miR-429表達(dá)水平最低。見圖1。

注:與NP69細(xì)胞比較,aP<0.05。

2.2干擾MSC-AS1對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移、MSC-AS1表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組、si-NC組相比,si-MSC-AS1組細(xì)胞增殖率、侵襲與遷移數(shù)以及MSC-AS1表達(dá)均顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 各組細(xì)胞凋亡、遷移與侵襲圖(×400)

表2 干擾MSC-AS1對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移、MSC-AS1表達(dá)的影響

2.3過表達(dá)miR-429對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移及miR-429的影響 miR-429 mimics組細(xì)胞增殖率、侵襲與遷移數(shù)較對(duì)照組、mimics NC組均顯著降低,細(xì)胞凋亡率、miR-429表達(dá)水平較對(duì)照組、mimics NC組顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 各組細(xì)胞凋亡、遷移與侵襲圖(×400)

表3 過表達(dá)miR-429對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移、miR-429表達(dá)的影響

2.4抑制miR-429減弱了干擾MSC-AS1對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲、遷移的影響 與si-MSC-AS1+inhibitor NC組相比,si-MSC-AS1+miR-429 inhibitor組細(xì)胞增殖率、侵襲與遷移數(shù)均顯著增加,細(xì)胞凋亡率顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、表4。

表4 抑制miR-429減弱了干擾MSC-AS1對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲與遷移的影響

2.5驗(yàn)證miR-429與MSC-AS1、RhoA靶向關(guān)系 通過Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-429與MSC-AS1、RhoA均存在結(jié)合位點(diǎn),見圖5、圖7。

圖5 Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-429與MSC-AS1的結(jié)合位點(diǎn)

注:與mimics NC+WT-MSC-AS1組比較,aP<0.05。

圖7 Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-429與RhoA的結(jié)合位點(diǎn)

熒光素酶相對(duì)活性比較:miR-429 mimics+WT-MSC-AS1組較mimics NC+WT-MSC-AS1組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),miR-429 mimics+MUT-MSC-AS1組與mimics NC+MUT-MSC-AS1組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖6;miR-429 mimics+WT-RhoA組較mimics NC+WT-RhoA組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),miR-429 mimics+MUT-RhoA組較mimics NC+MUT-RhoA組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖8。

注:與mimics NC+WT-RhoA組比較,aP<0.05。

2.6免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組、si-NC組相比,si-MSC-AS1組細(xì)胞中RhoA、N-cadherin、CyclinD1表達(dá)水平顯著下降,Bax、E-cadherin表達(dá)顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與對(duì)照組、mimics NC組相比,miR-429 mimics組細(xì)胞中RhoA、N-cadherin、CyclinD1表達(dá)水平顯著下降,Bax、E-cadherin表達(dá)水平顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與si-MSC-AS1+inhibitor NC組相比,si-MSC-AS1+miR-429 inhibitor組RhoA、N-cadherin、CyclinD1表達(dá)水平顯著增加,Bax、E-cadherin表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖9、10。

圖9 各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果

注:與對(duì)照組比較,aP<0.05,與si-NC組比較,bP<0.05;與mimics NC組比較,cP<0.05;與si-MSC-AS1+inhibitor NC組比較,dP<0.05。

3 討 論

NPC被認(rèn)為是高發(fā)惡性腫瘤之一,常出現(xiàn)在鼻咽腔側(cè)壁或頂部,主要癥狀是鼻塞、聽力下降等[8]。目前的首選治療方法是放化療同步實(shí)施,但由于診斷時(shí)幾乎處于中晚期再加之惡性程度較高,故生存率低、預(yù)后不佳成為目前NPC關(guān)注的焦點(diǎn)[9]。因此明確NPC的發(fā)病機(jī)制對(duì)于找尋新靶點(diǎn)、改善NPC患者預(yù)后意義重大。

有研究發(fā)現(xiàn)某些lncRNA的表達(dá)水平改變與NPC的發(fā)展過程密切相關(guān),目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種lncRNA參與調(diào)節(jié)NPC細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、遷移和侵襲[10]。張余良等[11]研究發(fā)現(xiàn)在HONE-1細(xì)胞研究中l(wèi)ncRNA JPX處于高表達(dá),下調(diào)lncRNA JPX表達(dá)水平可以抑制HONE-1細(xì)胞增殖、侵襲。MSC-AS1是新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,但卻參與許多腫瘤進(jìn)展。HU等[12]報(bào)道MSC-AS1通過調(diào)節(jié)miR-3924/WNT5A/β-catenin軸參與腎透明細(xì)胞癌的增殖和遷移。在卵巢癌研究中[13],過表達(dá)MSC-AS1能夠顯著促進(jìn)A2780和SKOV3細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖。值得注意的是,在NPC組織和細(xì)胞中MSC-AS1表達(dá)水平呈現(xiàn)上調(diào)[14],促進(jìn)NPC細(xì)胞增殖,阻礙了細(xì)胞凋亡,并促進(jìn)了侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,提示MSC-AS1有望作為lncRNA靶向治療NPC的新靶點(diǎn)。YAO等[14]研究發(fā)現(xiàn)在NPC組織及癌細(xì)胞系中MSC-AS1表達(dá)水平上調(diào),可作為治療NPC的潛在靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)與NP69細(xì)胞相比,MSC-AS1表達(dá)水平在CNE-1細(xì)胞中最高,干擾MSC-AS1抑制了CNE-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲以及增殖相關(guān)蛋白CyclinD1、間質(zhì)標(biāo)記蛋白N-cadherin表達(dá)水平,提高細(xì)胞凋亡率以及上皮標(biāo)記蛋白E-cadherin、凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá),提示干擾MSC-AS1可在CNE-1細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用。

miRNA是一組具有約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA,通過與mRNA的堿基配對(duì),可作為基因表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。有研究已經(jīng)指出miRNA與NPC進(jìn)展的相關(guān)性[15]。miR-429是miRNA家族中一員,在膀胱癌、胃癌中均作為腫瘤抑制因子[16-17]。但ZHANG等[18]研究證明在鼻咽癌患者采集的鼻咽組織中發(fā)現(xiàn)miR-429下調(diào),miR-429增加有利于鼻咽癌預(yù)后。本研究發(fā)現(xiàn)miR-429在CNE-1細(xì)胞中表達(dá)水平顯著降低,過表達(dá)miR-429抑制了CNE-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及N-cadherin、CyclinD1表達(dá)水平,促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及E-cadherin、Bax表達(dá)水平,提示miR-429參與NPC的發(fā)展過程。RhoA是調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移最重要的蛋白質(zhì)之一,在調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、基質(zhì)黏附方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[19]。WU等[20]研究發(fā)現(xiàn)漢防己甲素可以通過抑制RhoA信號(hào)通路,降低鼻咽癌細(xì)胞遷移、侵襲。WANG等[21]發(fā)現(xiàn)NPC患者中,RhoA表達(dá)水平增加,與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)RhoA mRNA在CNE-1細(xì)胞中顯著增加,過表達(dá)miR-429或干擾MSC-AS1均使RhoA表達(dá)水平下降,提示抑制該蛋白表達(dá)可能有助于抑制CNE-1細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。本研究還發(fā)現(xiàn)miR-429與MSC-AS1、RhoA均存在靶向關(guān)系,為進(jìn)一步驗(yàn)證上述猜想,引入miR-429 inhibitor做回復(fù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制miR-429表達(dá)可減弱干擾MSC-AS1對(duì)CNE-1細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。

綜上所述,MSC-AS1在CNE-1細(xì)胞中呈高表達(dá),干擾MSC-AS1通過負(fù)調(diào)控miR-429,降低RhoA表達(dá)水平,抑制CNE-1細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,促進(jìn)其凋亡,為NPC防治的潛在有效靶點(diǎn),但缺少蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)靶向關(guān)系是文章的不足之處,后續(xù)研究中將會(huì)將添加該實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步證實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)論。