共培養(yǎng)狀態(tài)下金黃色葡萄球菌對銅綠假單胞菌多重耐藥性的影響

張圓圓,陳 坤

東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院江北院區(qū)檢驗科,江蘇南京 210048

銅綠假單胞菌是目前最重要的鼻腔內(nèi)病原體之一[1]。此外,這種微生物是囊性纖維化患者和慢性阻塞性肺部疾病患者慢性感染的一個普遍原因[2]。銅綠假單胞菌能在不同棲息地成功定植主要依賴于其代謝的多樣性和穩(wěn)健性[3]。此外,這種細(xì)菌病原體在其核心基因組中藏有大量毒力決定因素,使其能夠定植/感染各種宿主,從單細(xì)胞生物到人類。然而,這些不僅僅是在醫(yī)院感染患者所需的唯一條件[4]?？紤]到受感染的患者經(jīng)常接受抗菌藥物治療,還需要有避免抗菌藥物作用的能力。在這個意義上,銅綠假單胞菌對目前用于治療的幾種抗菌藥物表現(xiàn)出特有的低敏感性。事實上,銅綠假單胞菌在感染期間可能存在與其他細(xì)菌共感染的情況,并且可能面臨的條件或化合物誘導(dǎo)內(nèi)在抗性基因的表達(dá),會影響抗菌藥物治療這種感染的效果[5]。此外,在囊性纖維化患者的肺部、假體或?qū)Ч苤薪?jīng)常遇到的銅綠假單胞菌生物膜,對抗菌藥物的敏感性很低,與頑固性和疾病惡化有關(guān)?；诖?本研究旨在探討共培養(yǎng)狀態(tài)下金黃色葡萄球菌對銅綠假單胞菌多重耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 血平板購自上海朝瑞生物科技有限公司(貨號:024070)。BHI培養(yǎng)基購自北京克必隆分子診斷技術(shù)有限公司(貨號:23-0215)。MTT試劑購自廣州德為生物科技有限公司(貨號:B7777-500)。Amikacin購自北京欣盛百泰科技有限公司(貨號:39831-55-5)。ceftazidime購自深圳市文樂生物科技有限公司(貨號:B3539-1g)。imipenem購自上海陶術(shù)生物科技有限公司(貨號:T1505-25)。meropenem購自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司(貨號:HY-13678A)。piperacillin購自中山市銘順生物科技有限公司(貨號:HY-B1286)。aztreonam購自上海陶術(shù)生物科技有限公司(貨號:T1029-1)。minocycline購自廣州創(chuàng)融生物科技有限公司(貨號:S4226)。ciprofloxacin購自創(chuàng)融科技(廣州)有限公司(貨號:GC13550)。levofloxacin購自北京奇松生物科技有限公司(貨號:QS81005261)。trimethoprim購自廣州創(chuàng)融生物科技有限公司(貨號:S3129)。TRIzol試劑購自上海玻爾化學(xué)試劑有限公司(貨號:B645504)。Prime ScriptTMRT Master Mixture購自Takara公司(貨號:RR036Q)。SYBR Prime Script miRNA RT-PCR試劑盒購自Takara公司(貨號:H351A)。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌分離與培養(yǎng) 選擇2021年9月至2022年9月本院收集的153例標(biāo)本,包括痰、咽拭子、血液送檢標(biāo)本。使用血平板進(jìn)行細(xì)菌的分離,步驟如下:將標(biāo)本不同比例稀釋后涂布于血平板中,將血平板置于37 ℃培養(yǎng)箱共培養(yǎng)3 d,3 d內(nèi)每天挑取單克隆于BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng),隨后將菌液進(jìn)行16S測序,將測序結(jié)果比對NCBI典型菌株庫。分離得到的表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌均使用BHI培養(yǎng)基在37 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2生物膜細(xì)菌抑制實驗 細(xì)菌接種到BHI培養(yǎng)基中進(jìn)行過夜培養(yǎng),并在新鮮培養(yǎng)基中稀釋到1×107CFU/mL。生物膜在96孔聚苯乙烯微孔板中培養(yǎng)。在無菌平底96孔聚苯乙烯微孔板的每個孔中加入100 μL稀釋的細(xì)菌培養(yǎng)物,并在30 ℃下培養(yǎng)24 h。對于生物膜根除試驗,將微孔板在30 ℃下培養(yǎng)24 h,以使生物膜形成。然后將已建立的生物膜在30 ℃下補充了所示抗菌藥物的BHI中培養(yǎng)。生物膜中的細(xì)胞存活率通過MTT試驗進(jìn)行評估。所有的試驗都是在每個處理的6個重復(fù)中進(jìn)行的,所有的試驗都進(jìn)行了3次。

1.2.3浮游細(xì)菌抑制試驗 將BHI培養(yǎng)基中4 mL的細(xì)菌(105CFU/mL)與所示的抗菌藥物的連續(xù)稀釋液在30 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h。之后,將細(xì)胞懸浮液鋪在MRS平板上,在30 ℃下培養(yǎng)24 h。隨后通過MTT試驗進(jìn)行評估。所有的試驗都是在每個處理的6個重復(fù)中進(jìn)行的,所有的試驗都進(jìn)行了3次。

1.2.4RNA抽取與實時熒光定量PCR 使用TRIzol?試劑提取總RNA,并使用Prime ScriptTMRT Master Mixture合成cDNA。使用SYBR Prime Script miRNA RT-PCR試劑盒來檢測和定量相應(yīng)基因的表達(dá),以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,引物列表見表1。

表1 引物序列

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行。兩組比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1分離細(xì)菌共培養(yǎng)對多重耐藥性的影響 153例標(biāo)本共分離出細(xì)菌中比例超過10%的有6種:表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌,見表2。將這6種細(xì)菌以1∶1的比例共培養(yǎng)后,測試其對10種抗菌藥物混合物(抗菌藥物種類和混合后的濃度見表3)的耐藥性,發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌共培養(yǎng)可以顯著提升對抗菌藥物混合物的耐藥性(P<0.05),見圖1。

注:P<0.05。

表2 153例標(biāo)本分離細(xì)菌比例[n(%)]

表3 本研究所用的抗菌藥物和相應(yīng)功能

2.2金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌不同比例共培養(yǎng)后對多重耐藥性的影響 為了探討金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌不同比例共培養(yǎng)后對多重耐藥性的影響。使用1∶0、1∶0.1、1∶0.2、1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶5、1∶10這8種比例共培養(yǎng),隨后使用10種抗菌藥物進(jìn)行耐藥性的測試,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生生物膜的靜置培養(yǎng)時,1∶0.5、1∶1、1∶2共培養(yǎng)比例均能提升細(xì)菌對這10種抗菌藥物的耐藥性,比例為1∶1時耐藥性最高,見圖2A。當(dāng)搖菌培養(yǎng)時,1∶0.5和1∶2共培養(yǎng)比例能提升細(xì)菌對頭孢他啶、哌拉西林、二甲胺四環(huán)素、甲氧芐-氨嘧啶這4種抗菌藥物的耐藥性,而1∶1共培養(yǎng)比例均能提升細(xì)菌對這10種抗菌藥物的耐藥性,比例為1∶1時耐藥性最高,見圖2B。

圖2 金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌不同比例共培養(yǎng)后對多重耐藥性的影響

2.3金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)后對耐藥基因表達(dá)的影響 為了探討金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)對多重耐藥性提升的潛在機(jī)制,本研究檢測了銅綠假單胞菌關(guān)鍵耐藥基因FosA、AmpC和APH(3′)-Ⅱb的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后,無論是產(chǎn)生生物膜的靜置培養(yǎng)還是搖菌培養(yǎng),這10種抗菌藥物單獨處理后均能限制提升FosA、AmpC和APH(3′)-Ⅱb的表達(dá)水平(P<0.05),見圖3。

3 討 論

導(dǎo)致人類感染的細(xì)菌可以分為兩類:一類是能夠在任何人身上產(chǎn)生感染,不管他們的基本健康狀況如何;另一類是只在身體虛弱的人身上引起感染[6]。第一類可被視為“專業(yè) ”病原體。第二類是由機(jī)會性病原體組成的,它們很少感染社區(qū),但它們構(gòu)成了醫(yī)院感染的一個相關(guān)問題。在廣泛使用抗菌藥物之前,大多數(shù)機(jī)會性病原體是共生微生物組的成員[7]。這些細(xì)菌能很好地適應(yīng)與宿主組織接觸但生活在宿主組織之外,不會引起健康問題;然而,它們轉(zhuǎn)移到其他身體位置就會引起感染。一旦抗菌藥物開始被廣泛使用,第二類機(jī)會性病原體在醫(yī)院里的流行程度就會增加[8]。這一類由環(huán)境細(xì)菌組成,主要是非發(fā)酵性革蘭陰性菌,對目前診所使用的抗菌藥物敏感性低[9]。本研究從153例標(biāo)本共分離出多重細(xì)菌,其中比例超過10%的有6種:表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌,均為機(jī)會性病原體。

銅綠假單胞菌能夠定植于各種宿主,從單細(xì)胞生物到植物、線蟲或人類[10]。此外,它所具有的大多數(shù)毒力決定因素都在其核心基因組中編碼,表明在銅綠假單胞菌成為人類健康問題之前,它們已經(jīng)在自然界中進(jìn)化了[11]。有研究發(fā)現(xiàn)[12],抗菌藥物進(jìn)入的低膜滲透性在銅綠假單胞菌的內(nèi)在抗菌藥物耐藥性中起主要作用,是由大多數(shù)OprF孔蛋白的封閉構(gòu)象狀態(tài)造成的[13]。導(dǎo)致銅綠假單胞菌對抗菌藥物低敏感性的另一個因素是存在一組不同的抗菌藥物修飾酶,如FosA、AmpC和APH(3′)-Ⅱb[14]。本研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌共培養(yǎng)后,無論是產(chǎn)生生物膜的靜置培養(yǎng)還是搖菌培養(yǎng),這10種抗菌藥物單獨處理后均能限制提升FosA、AmpC和APH(3′)-Ⅱb的表達(dá)水平(P<0.05)。

金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌共培養(yǎng)可以顯著提升對抗菌藥物混合物的耐藥性(P<0.05)。相比于搖菌培養(yǎng),產(chǎn)生生物膜的靜置培養(yǎng)能夠獲得更高的多重耐藥性。在臨床實踐中,微生物生物膜與持續(xù)的慢性感染密切相關(guān)[15]。有研究表明[16],抗菌藥物耐藥性可以通過基因組變化或生物膜的形成獲得。生物膜通常被定義為附著在表面或界面上的微生物群落,并產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì),這些微生物被嵌入其中。有研究表明[17],抗菌藥物無法促使生物膜滅絕,歷史上被認(rèn)為是由于這些藥物在生物膜結(jié)構(gòu)中的滲透性降低。然而,即使在生物膜基質(zhì)中完全滲透的抗菌藥物也無法殺死所有易感的生物膜細(xì)菌,這表明抗菌藥物滲透性的降低并不能完全解釋生物膜對抗菌劑的頑固性在真實的人體環(huán)境中,許多其他微生物物種的可能存在顯然增加了多物種生物膜行為的復(fù)雜性,因為所有納入的微生物都能夠相互競爭、合作和交流,共同形成了生物膜對抗菌藥物的抗性。

綜上所述,金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)后,銅綠假單胞菌耐藥基因FosA、AmpC和APH(3′)-Ⅱb的表達(dá)水平上升,顯著增強其多重耐藥性。