miR-331-3p、miR-381-3p表達(dá)水平與乳腺癌組織上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物和預(yù)后的關(guān)系研究*

何 英,石先偉,劉臻臻,朱克鵬,尹均明,杜果城

南充市中心醫(yī)院:1.乳腺甲狀腺血管外科;2.腫瘤中心,四川南充 637000

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤,其2018年全球發(fā)病例數(shù)達(dá)209萬例,死亡例數(shù)達(dá)63萬例,嚴(yán)重威脅女性健康[1]。乳腺癌的臨床治療包括手術(shù)治療、內(nèi)分泌治療及靶向治療等,但20%～30%早期乳腺癌患者可出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,約10%患者初診時(shí)已存在腫瘤轉(zhuǎn)移[2-3]。對(duì)于轉(zhuǎn)移性乳腺癌,患者的5年生存率僅25%[3]。因此,深入研究乳腺癌的疾病機(jī)制,尋找影響乳腺癌預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物,具有重要意義。微小核糖核酸(miRNA)是長度為20～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA,參與人體生長發(fā)育、衰老、炎癥及腫瘤等生理病理學(xué)過程的調(diào)控[4]。miR-331-3p是近年來發(fā)現(xiàn)的具有腫瘤抑制作用的miRNA分子。有研究表明,miR-331-3p在宮頸癌[5]、胰腺癌[6]等惡性腫瘤中表達(dá)水平下調(diào),導(dǎo)致其下游靶基因如神經(jīng)纖毛蛋白2表達(dá)水平升高,進(jìn)而激活Wnt/β-連環(huán)蛋白通路,促進(jìn)腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。miR-381-3p編碼基因位于14q32.31。有研究表明,miR-381-3p在非小細(xì)胞肺癌[7]、宮頸癌[8]中表達(dá)水平下調(diào),通過激活成纖維細(xì)胞生長因子受體,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲。本研究分析乳腺癌組織中miR-331-3p及miR-381-3p的表達(dá)水平,分析兩者與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標(biāo)及臨床病理特征的關(guān)系,探討兩者的臨床預(yù)后價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2019年1月在本院診治的乳腺癌患者153例。年齡31～69歲,平均(62.30±5.91)歲;絕經(jīng)前52例,絕經(jīng)后101例;病理類型:浸潤型導(dǎo)管癌113例,非浸潤型導(dǎo)管癌40例,其中導(dǎo)管內(nèi)癌18例、小葉原位癌14例、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀癌8例;分化程度:高分化41例,中分化65例,低分化47例;根據(jù)美國癌癥研究聯(lián)合會(huì)第七版乳腺癌腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)[9]:Ⅰ期40例,Ⅱ期68例,Ⅲ期45例;經(jīng)病理檢查明確為三陰性乳腺癌者35例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)接受乳腺癌根治術(shù)治療,經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷為乳腺癌;(2)首次診治;(3)臨床病理和隨訪資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)伴乳腺增生、乳腺炎等乳腺良性疾病;(2)伴其他器官惡性腫瘤;(3)合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病;(4)合并精神性疾病。本研究經(jīng)本院倫理審核通過。

1.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測(cè) qPCR檢測(cè)檢測(cè)乳腺癌及癌旁組織(距離腫瘤組織邊緣2 cm以上,并經(jīng)病理學(xué)檢查明確為正常乳腺組織)中miR-331-3p、miR-381-3p及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物E-鈣黏素(E-cad)mRNA、N-鈣黏素(N-cad)mRNA及波形蛋白(Vim)mRNA表達(dá)水平。將組織在冰上研磨,離心去除組織碎片,取上清加入Trizol,提取組織總RNA,Narodrop1000(美國賽默飛)分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系10 μL,包括cDNA 0.2 μL,2×SYBR Green Premix 5 μL,上下游引物1 μL,ddH2O 3.8 μL。miR-381-3p、miR-331-3p及U6反應(yīng)程序:95 ℃ 預(yù)變性30 s,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,變性退火延伸35個(gè)循環(huán)。E-cad、N-cad、Vim及GAPDH反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,62 ℃退火40 s,72 ℃延伸30 s,變性退火延伸40個(gè)循環(huán)。miR-331-3p和miR-381-3p以U6為內(nèi)參,E-cad、N-cad、Vim以GAPDH為內(nèi)參。利用2-ΔΔCt法對(duì)組織中miR-331-3p、miR-381-3p及E-cad、N-cad、Vim 信使RNA (mRNA)相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

表1 引物序列

1.3分組與隨訪

1.3.1分組 以癌組織中miR-331-3p、miR-381-3p相對(duì)表達(dá)水平的平均值0.613、0.728為界,分為miR-331-3p低表達(dá)水平組(n=79)和高表達(dá)水平組(n=74),miR-381-3p低表達(dá)水平組(n=77)和高表達(dá)組(n=76)。

1.3.2隨訪 所有研究對(duì)象自確診之日起開始進(jìn)行隨訪,以電話或門診方式進(jìn)行,連續(xù)隨訪3年,第1年每3個(gè)月隨訪1次,第2～3年每半年隨訪1次,隨訪內(nèi)容為患者生存情況,隨訪截至2022年2月1日。隨訪終點(diǎn)為患者死亡或隨訪結(jié)束。

2 結(jié) 果

2.1組織中miR-331-3p、miR-381-3p及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標(biāo)表達(dá)水平 與癌旁組織相比,乳腺癌組織中miR-331-3p、miR-381-3p及E-cad mRNA表達(dá)水平顯著較低,而N-cad mRNA及Vim mRNA表達(dá)水平顯著較高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),見表2、圖1。

圖1 miR-331-3p、miR-381-3p、E-cad mRNA、N-cad mRNA及Vim mRNA散點(diǎn)圖

表2 miR-331-3p、miR-381-3p及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標(biāo)表達(dá)水平

2.2癌組織中miR-331-3p、miR-381-3p與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標(biāo)表達(dá)水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果,乳腺癌癌組織中miR-331-3p、miR-381-3p表達(dá)水平與E-cad mRNA呈正相關(guān)(r=0.611、0.612,均P<0.05),與N-cad mRNA、Vim mRNA呈負(fù)相關(guān)(r=-0.614、-0.612;-0.712、-0.678,均P<0.05)。

2.3miR-331-3p、miR-381-3p表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 乳腺癌組織中miR-331-3p、miR-381-3p表達(dá)水平與腫瘤TNM分期、分化程度有關(guān)(均P<0.05),與乳腺癌患者的年齡、月經(jīng)情況、病理類型及是否三陰性無關(guān)(均P>0.05)。見表3。

表3 miR-331-3p、miR-381-3p表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4miR-331-3p、miR-381-3p表達(dá)水平對(duì)乳腺癌患者生存預(yù)后的影響 所有患者最長隨訪36個(gè)月,平均隨訪時(shí)間(21.6±7.2)個(gè)月,僅2例在第3次隨訪時(shí)失訪(按截尾數(shù)據(jù)處理)。153例患者中,生存124例,生存率為81.05%,死亡29例,死亡率為18.95%。以最后的隨訪數(shù)據(jù)分別建立癌組織miR-331-3p、miR-381-3p不同表達(dá)水平組的Kaplan-Meier乘積限生存曲線模型見圖2。miR-331-3p低表達(dá)水平組及高表達(dá)水平組的3年生存率分別為72.15%、90.54%,兩組生存資料經(jīng)Log Rank檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-381-3p低表達(dá)水平組及高表達(dá)水平組的3年生存率分別為72.73%、89.47%,兩組生存資料經(jīng)Log Rank檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

圖2 miR-331-3p、miR-381-3p表達(dá)水平對(duì)乳腺癌患者生存預(yù)后的影響

表4 miR-331-3p、miR-381-3p表達(dá)水平對(duì)乳腺癌患者生存預(yù)后的影響[n(%)]

2.5單因素及多因素COX回歸分析影響乳腺癌生存預(yù)后的因素 進(jìn)一步探討乳腺癌生存預(yù)后的影響因素,以比例風(fēng)險(xiǎn)COX回歸,行單因素及多因素綜合分析。因變量為乳腺癌患者的預(yù)后,賦值:1=死亡,0=生存,t=生存期,其中多因素回歸為逐步后退法(α進(jìn)為<0.05,α退為≥0.10),其自變量為單因素回歸中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的各項(xiàng)因素?；貧w分析結(jié)果顯示,乳腺癌組織中miR-331-3p低表達(dá)水平、miR-381-3p低表達(dá)水平、腫瘤分期較高、低中分化程度是影響乳腺癌生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)。見表5、6。

表5 單因素COX回歸分析影響乳腺癌生存預(yù)后的因素

表6 多因素COX回歸分析影響乳腺癌生存預(yù)后的因素

3 討 論

乳腺癌是我國女性常見的惡性腫瘤,每年發(fā)病例數(shù)達(dá)35.76萬,發(fā)病率為35.62/100 000,死亡率為8.47/100 000,嚴(yán)重威脅我國女性健康[10]。近年來隨著如乳腺癌早期篩查技術(shù)、基因檢測(cè)、分子靶向及免疫治療等發(fā)展,一定程度上延長了患者的生存時(shí)間,但部分患者仍可發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。深入研究乳腺癌疾病機(jī)制,尋找能夠評(píng)估乳腺癌預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物,具有重要的臨床意義。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是細(xì)胞從上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程,不僅與個(gè)體生長發(fā)育等生物學(xué)過程有關(guān),其還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力,導(dǎo)致腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[11]。有研究發(fā)現(xiàn),腫瘤中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程受到非編碼RNA如miRNA的表達(dá)調(diào)控,miRNA能通過影響Wnt、Notch和Hedgehog等特定信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移[12]。因此,尋找參與調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的miRNA,可能有助于評(píng)估乳腺癌患者的臨床預(yù)后。

miR-331-3p編碼基因位于12q22,參與形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物,通過與mRNA 的不完全堿基配對(duì)影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯,參與多細(xì)胞生物基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,與阿爾茲海默病[13]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[14]等疾病關(guān)系密切。近年來有研究表明,在胰腺癌等惡性腫瘤中miR-331-3p表達(dá)水平下調(diào),導(dǎo)致下游Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路活化,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖,是新的腫瘤生物標(biāo)志物[6]。本研究中,乳腺癌組織中miR-331-3p表達(dá)水平下調(diào),提示miR-331-3p的表達(dá)水平降低可能參與乳腺癌的腫瘤發(fā)生。miR-331-3p的表達(dá)水平受長鏈非編碼RNA的調(diào)節(jié)。有研究表明,LncRNA XLOC_006390能夠作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA,抑制miR-331-3p的表達(dá)水平及功能,促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[5]。本研究中,miR-331-3p的表達(dá)水平與腫瘤TNM分期、分化程度有關(guān)。分析其原因,miR-331-3p的表達(dá)水平下調(diào)可通過促進(jìn)下游癌基因的表達(dá),促進(jìn)腫瘤發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致乳腺癌的腫瘤進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn),miR-331-3p通過抑制N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Ⅰ的表達(dá)水平,抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白通路,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,miR-331-3p表達(dá)水平下調(diào)還可通過激活Bcl-2/Bax 途徑,激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力[15]。本研究也證實(shí),乳腺癌組織中miR-331-3p表達(dá)水平與上皮型指標(biāo)E-cad mRNA呈正相關(guān),與間質(zhì)型指標(biāo)N-cad、Vim mRNA呈負(fù)相關(guān),表明miR-331-3p的表達(dá)水平下調(diào)可能通過促進(jìn)乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。因此,乳腺癌中miR-331-3p可能作為一種重要的腫瘤抑制因子,其表達(dá)水平下調(diào)參與促進(jìn)乳腺癌的腫瘤進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn),miR-331-3p低表達(dá)與乳腺癌患者的不良生存預(yù)后有關(guān),是影響患者不良預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有報(bào)道研究發(fā)現(xiàn),miR-331-3p的表達(dá)水平降低通過上調(diào)多藥耐藥基因1蛋白的表達(dá),增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物吉西他濱治療的抵抗性[6]。因此,檢測(cè)乳腺癌組織中miR-331-3p的表達(dá)水平有助于乳腺癌患者預(yù)后的判斷,指導(dǎo)臨床診治。

miR-381-3p基因位于14q32.31,近年來有研究發(fā)現(xiàn),miR-381-3p參與調(diào)節(jié)癌癥中包括增殖、凋亡、細(xì)胞周期、遷移和侵襲等各種細(xì)胞生物學(xué)行為,還參與血管生成和淋巴管生成,以及對(duì)化療和放療的抵抗[16]。本研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌組織中miR-381-3p的表達(dá)水平顯著下調(diào),提示miR-381-3p的表達(dá)水平降低可能參與乳腺癌的腫瘤發(fā)生。分析其機(jī)制,可能與長鏈非編碼RNA的表達(dá)水平調(diào)節(jié)有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),lncRNA CAT104作為分子海綿結(jié)合并抑制miR-381誘導(dǎo)ZEB1的表達(dá)水平,從而增加腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,抑制細(xì)胞凋亡[17]。本研究結(jié)果還顯示,乳腺癌組織中miR-381-3p的表達(dá)水平與腫瘤TNM分期、分化程度有關(guān),分析其機(jī)制,可能與miR-381-3p參與調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)有關(guān)。有研究報(bào)道,miR-381-3p的低表達(dá)通過上調(diào)Sox4和Twist1,激活轉(zhuǎn)化生長因子-β信號(hào)傳導(dǎo)通路,促進(jìn)乳腺癌腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲遷移能力[18]。本研究通過相關(guān)性分析,也證實(shí)miR-381-3p的表達(dá)水平與E-cad mRNA呈正相關(guān),與N-cad、Vim mRNA呈負(fù)相關(guān),表明乳腺癌中miR-381-3p的表達(dá)水平下調(diào)通過促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。此外,miR-381-3p能夠直接靶向煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶并抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的表達(dá),miR-381-3p的表達(dá)水平降低導(dǎo)致煙酰胺腺嘌呤二核苷酸過度表達(dá),從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡[19]。因此,miR-381-3p在乳腺癌中作為腫瘤抑制因子,發(fā)揮抑制腫瘤進(jìn)展的作用。本研究發(fā)現(xiàn),miR-381-3p低表達(dá)水平的乳腺癌患者生存預(yù)后較差,并且是乳腺癌患者不良生存預(yù)后的獨(dú)立因素。有研究表明,外泌體中長鏈非編碼RNA OIP5-AS1通過抑制miR-381-3p的表達(dá)水平,增強(qiáng)高遷移率族蛋白B3的表達(dá)水平,進(jìn)而增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞對(duì)曲妥珠單抗的耐藥性[20],導(dǎo)致患者不良預(yù)后。

綜上所述,乳腺癌組織中miR-331-3p、miR-381-3p表達(dá)水平下調(diào),兩者表達(dá)水平與E-cad mRNA呈正相關(guān),與N-cad、Vim mRNA呈負(fù)相關(guān),miR-331-3p、miR-381-3p可能通過促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,共同促進(jìn)乳腺癌腫瘤的惡性進(jìn)展。miR-331-3p、miR-381-3p低表達(dá)與乳腺癌患者不良預(yù)后有關(guān),是影響乳腺癌患者不良生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但本研究也存在不足之處,miR-331-3p、miR-381-3p對(duì)乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的具體機(jī)制尚不清楚,有待今后深入的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行探索。