血清NFP、MMP-2聯(lián)合mNGS在兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的臨床價(jià)值*

張曉蒙,蘇 秦,楊光路,賈俊玲,朝魯門其其格,李曉華

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科,內(nèi)蒙古呼和浩特 010000

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)感染性疾病是各種病原體通過顱內(nèi)感染而引起的,臨床常見細(xì)菌性腦膜炎、化膿性腦膜炎和病毒性腦膜炎[1-3]。兒童是CNS感染性疾病的高發(fā)人群,由于兒童的肢體感知能力及語言表達(dá)能力不足、早期不易獲得病原學(xué)結(jié)果、臨床表現(xiàn)特征不典型不利于進(jìn)行鑒別,因此確診時(shí)往往較為嚴(yán)重,有較高的致死率及致殘率[4]。目前CNS感染性疾病進(jìn)行病原學(xué)診斷主要依靠傳統(tǒng)微生物鑒定手段,不僅耗時(shí)較長而且其準(zhǔn)確率較低,臨床上急需一種新的檢測(cè)方法及指標(biāo)來提高診斷兒童CNS感染性疾病的靈敏度和準(zhǔn)確率[5-6]。神經(jīng)絲蛋白(NFP)作為神經(jīng)元特異性成分,對(duì)各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病如神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)元損傷有高度的靈敏度[7]?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)是一類依賴鈣、鋅離子的內(nèi)肽酶,具有降解細(xì)胞外基質(zhì)作用,以維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定作用[8]。有研究表明,MMP-2可降解腦血管基底膜的成分、破壞血腦屏障、誘導(dǎo)白細(xì)胞聚集,參與病毒性及細(xì)菌性腦膜炎病理生理過程,對(duì)CNS感染性疾病具有診斷意義[9]。近年來宏基因組二代測(cè)序技術(shù)(mNGS)的快速發(fā)展使準(zhǔn)確、高效的確定病原成為可能。mNGS特點(diǎn)可以不依賴于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng),靈敏度高,直接對(duì)臨床樣本進(jìn)行高通量測(cè)序[10],且mNGS可用于兒童各種感染性疾病病原診斷,尤其對(duì)于局灶感染病原診斷優(yōu)勢(shì)明顯,因此本研究通過檢測(cè)患兒血清中NFP、MMP-2表達(dá)水平并聯(lián)合mNGS檢測(cè)技術(shù)探討其在CNS感染性疾病中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年9月至2022年3月本院兒科收治的臨床初步診斷為CNS感染的120例患兒,采用隨機(jī)數(shù)表法分為傳統(tǒng)方法組及mNGS組,每組60例,其中,傳統(tǒng)方法組男37例,女23例,平均年齡(8.3±2.5)歲;mNGS組男35例,女25例,平均年齡(8.4±2.1)歲。另選取同期本院兒科門診收治的未患CNS感染疾病患兒60例為正常組,其中男32例,女28例,平均年齡(8.5±2.2)歲。兩組患兒的性別、年齡等一般資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)本院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(倫理審查批件號(hào):NMGYKDXLL052-2103),研究前獲得患兒監(jiān)護(hù)人書面知情同意。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)患兒年齡16歲以下,性別不限,均符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》(第八版)[11]中的CNS感染診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)患兒多具有發(fā)熱、頭痛、顱內(nèi)壓升高、腦膜刺激征等臨床表現(xiàn);(3)初步診斷為化膿性腦膜炎、病毒NFP及MMP-2性腦(膜)炎、結(jié)核性腦炎或真菌性腦炎;(4)臨床資料完整可溯源。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)病史資料不全者;(2)最終診斷為免疫性腦炎者;(3)拒絕腰椎穿刺者;(4)凝血功能障礙者;(5)高顱壓臨界腦疝者或生命體征不平穩(wěn)者。

1.3方法 抽取3組患兒外周靜脈血2～3 mL,加入肝素抗凝30 min后,以2 000 r/min,4 ℃離心10 min,吸取上層血清,利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(北京索萊寶有限公司)檢測(cè)NFP、MMP-2表達(dá)水平,操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

抽取3組患兒外周靜脈血2～3 mL,分離外周單核細(xì)胞,利用Trizol試劑(賽默飛世爾科技有限公司)提取總的DNA,逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA,采用SYBR Green PCR試劑盒(天根生化科技有限公司)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增條件:預(yù)變性95 ℃,10 min;循環(huán)(95 ℃變性15 s,60 ℃退火60 s)40次,參照試劑盒進(jìn)行分析。

參照李維等[12]對(duì)標(biāo)本采集要求進(jìn)行腦脊液的采集:正常組、傳統(tǒng)方法組及mNGS組患兒入院72 h內(nèi)抽取腦脊液3～5 mL,嚴(yán)格進(jìn)行皮膚清潔消毒,控制顱內(nèi)壓以及放液速度,標(biāo)本收集后立即分裝至無菌管中,保證每根無菌標(biāo)本管中的留取量≥1.2 mL,將mNGS組腦脊液放至干冰盒中立即進(jìn)行mNGS送檢,同時(shí)將傳統(tǒng)方法組送入本院檢驗(yàn)科進(jìn)行檢測(cè),包括:腦脊液涂片、培養(yǎng)、染色鏡檢、抗原檢測(cè)、PCR檢測(cè)。根據(jù)CNS 感染特征確定參考數(shù)據(jù)庫,所用數(shù)據(jù)庫包括細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲、支原體及結(jié)核分枝桿菌。

2 結(jié) 果

2.1各組患兒血清中NFP、MMP-2表達(dá)水平及外周血NFP mRNA、MMP-2 mRNA陽性率比較 傳統(tǒng)方法組及mNGS組血清中NFP、mNGS表達(dá)水平,外周血NFP mRNA、MMP-2 mRNA陽性率均高于正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組患兒血清中NFP、MMP-2表達(dá)水平及外周血NFP mRNA、MMP-2 mRNA陽性率比較或n(%)]

2.2兩種方法病原菌及病原檢測(cè)的陽性率進(jìn)行比較 檢出的病菌中,傳統(tǒng)檢測(cè)方法細(xì)菌檢測(cè)以肺炎鏈球菌最為常見,病毒檢測(cè)以單純皰疹病毒最為常見,真菌檢測(cè)中曲霉菌最為常見。mNGS檢測(cè)方法細(xì)菌檢測(cè)以肺炎鏈球菌最為常見,病毒檢測(cè)以單純皰疹病毒最常見,真菌檢測(cè)中曲霉菌最為常見,寄生蟲感染中弓形蟲最常見。mNGS檢出的總陽性率(71.67%)高于傳統(tǒng)方法組(43.33%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 正常組、傳統(tǒng)方法組、mNGS組檢測(cè)出的病菌及陽性率比較[n或n(%)]

2.3使用抗菌藥物對(duì)兩種檢測(cè)方法結(jié)果的比較 傳統(tǒng)方法組入組前是否使用抗菌藥物對(duì)比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 使用抗菌藥物對(duì)兩種檢測(cè)方法結(jié)果的比較[n(%)]

2.4兩種方法對(duì)抗感染方案痊愈率的影響 患兒住院14 d后痊愈出院方面,mNGS組痊愈率高于傳統(tǒng)方法組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 兩種方法對(duì)抗感染方案痊愈率的影響

2.5比較mNGS組中血清NFP、MMP-2與mNGS的陽性率一致性 60例患兒中,血清陽性率Kappa一致性檢驗(yàn)結(jié)果顯示,Kappa值分別為0.85、0.92(P<0.001),均具有較高一致性。見表5。

表5 NFP結(jié)果與mNGS結(jié)果的一致性(n)

2.6血清NFP、MMP-2與mNGS陽性率對(duì)診斷CNS感染性疾病的影響 以兒童是否診斷為CNS感染性疾病為因變量(mNGS組為病例組、正常組為對(duì)照組),以血清NFP、MMP-2、mNGS陽性率為自變量,在調(diào)整年齡、性別等因素后,血清NFP每上升1 ng/mL,兒童CNS感染的風(fēng)險(xiǎn)則增加0.054倍(OR=1.054,95%CI:1.006～1.103,P<0.001),血清MMP-2每上升1 ng/mL,兒童CNS感染的風(fēng)險(xiǎn)則增加0.022倍(OR=1.022,95%CI:1.010～1.035,P<0.001),mNGS陽性率每上升1%,兒童CNS感染的風(fēng)險(xiǎn)則增加0.387倍(OR=1.387,95%CI:1.023～1.412,P<0.001),見表6。

2.7血清NFP、MMP-2與mNGS陽性率對(duì)預(yù)測(cè)兒童CNS感染的價(jià)值 繪制ROC曲線,通過最大約登指數(shù)獲得各指標(biāo)最佳截?cái)嘀?結(jié)果提示兒童血清NFP、血清MMP-2、mNGS陽性率及聯(lián)合預(yù)測(cè)因子在預(yù)測(cè)兒童CNS感染中均具有一定的效能,聯(lián)合預(yù)測(cè)因子的靈敏度和特異度均高于單獨(dú)檢測(cè)(P<0.05)。見圖1、表7。

圖1 血清NFP、MMP-2與mNGS陽性率對(duì)預(yù)測(cè)兒童CNS感染的價(jià)值

表7 血清NFP、MMP-2與mNGS陽性率對(duì)預(yù)測(cè)兒童CNS感染的價(jià)值(n=120)

3 討 論

CNS感染具有發(fā)病率高、致殘致死率高、病情發(fā)展迅速等特點(diǎn),是由細(xì)菌、病毒、真菌、結(jié)核分枝桿菌、寄生蟲、螺旋體、衣原體等病原微生物侵犯CNS的實(shí)質(zhì)、被膜及血管等引起的急性或慢性炎癥性(或非炎癥性)疾病。及時(shí)進(jìn)行病因?qū)W診斷、明確具體病原微生物類型對(duì)疾病的治療及患者預(yù)后有至關(guān)重要的作用,但僅依靠傳統(tǒng)檢測(cè)方法確定病原學(xué)診斷往往比較局限且確診率也十分有限。腦脊液培養(yǎng)是細(xì)菌性腦膜炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但一般需要一定的培養(yǎng)周期[13],且進(jìn)行腰椎穿刺具有一定風(fēng)險(xiǎn),操作不當(dāng)易出現(xiàn)腦疝、引起低顱壓、顱內(nèi)感染及馬尾神經(jīng)受損等癥狀,患兒依從性較差加重腰椎穿刺風(fēng)險(xiǎn)。因此急需新的檢測(cè)手段及生物標(biāo)志物應(yīng)用到CNS感染的診斷中。

NFP作為蛋白質(zhì)聚合物可用于構(gòu)成神經(jīng)細(xì)胞軸突中間絲,使神經(jīng)纖維富有彈力易于伸展、防止斷裂。NFP活性一旦下降,將破壞神經(jīng)細(xì)胞的功能穩(wěn)定、正常形態(tài)結(jié)構(gòu)及神經(jīng)纖維彈性[14],當(dāng)神經(jīng)元受損或軸突退化時(shí),NFP蛋白被釋放入血或腦脊液中,因此腦脊液和血漿中對(duì)NFP進(jìn)行檢測(cè)可用作神經(jīng)疾病中軸突損傷的指標(biāo)。劉建宏等[15]研究表明在窒息新生兒血清中NFP及Nrf2表達(dá)水平明顯升高,與新生兒窒息早期腦損傷具有相關(guān)性,且對(duì)診斷患兒窒息早期腦損傷具有診斷意義。有研究表明急性感染單純病毒1型腦炎后45 d內(nèi),除NFP外,細(xì)胞損傷標(biāo)志物濃度下降[16-17]。MMP家族由成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、吞噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞合成及分泌。MMP-2作為MMPs家族中一員由星形膠質(zhì)細(xì)胞合成在宿主受損時(shí)被激活,且MMP-2、MMP-3、MMP-9等可切割緊密連接蛋白,導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞從實(shí)質(zhì)基底膜分離,從而破壞血腦屏障。ASHLEY等[18]認(rèn)為MMP-2濃度增加與星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等受感染的腦細(xì)胞之間存在關(guān)聯(lián)性。LIND等[19]研究表明MMP-2參與到由水痘-帶狀皰疹病毒引起的CNS感染當(dāng)中,且腦脊液及血清中MMP-2含量與腦炎患者的嚴(yán)重程度呈正相關(guān),并且發(fā)現(xiàn)在腦炎、腦膜炎及亨特綜合征患者的腦脊液中MMP-2增加了10 000倍。本研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法組及mNGS組患兒血清中NFP及MMP-2的表達(dá)水平顯著高于正常組,且NFP mRNA及MMP-2 mRNA陽性檢測(cè)率顯著高于正常組,提示通過檢測(cè)血清中NFP及MMP-2表達(dá)水平可對(duì)CNS感染的初步篩查具有積極意義。

mNGS作為一種新興的分子診斷技術(shù)廣泛運(yùn)用到微生物研究及檢測(cè)領(lǐng)域,具有無需對(duì)病原體進(jìn)行分離培養(yǎng)、檢測(cè)范圍廣、無需靶向擴(kuò)增、靈敏度高等特點(diǎn),可一次性直接對(duì)樣本所包含的細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲乃至未知的病原體等微生物進(jìn)行高精度、高維度地分析研究,打破了傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)的局限。當(dāng)前,mNGS是有望滿足臨床對(duì)感染性疾病診療“快速、準(zhǔn)確、全面”需求的技術(shù)路線之一。GRANEROD等[20]對(duì)203例CNS病例綜合采用各種傳統(tǒng)方法對(duì)病原學(xué)進(jìn)行診斷,確診率相對(duì)較高但仍僅為63%。近年來mNGS在感染領(lǐng)域體現(xiàn)出的突出作用而備受關(guān)注,不但在目前已知可導(dǎo)致CNS感染的病原體方面發(fā)揮重要的診斷價(jià)值,而且在罕見病原體和跨物種傳播病原體檢測(cè)方面也發(fā)揮了無可替代的作用。本研究發(fā)現(xiàn)使用mNGS技術(shù)檢測(cè)CNS感染性疾病患兒腦脊液中的病原菌總有效率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)技術(shù);mNGS陽性檢出率不受抗菌藥物治療的影響且經(jīng)mNGS檢測(cè)指導(dǎo)進(jìn)行抗菌藥物方案調(diào)整,mNGS組痊愈率高于傳統(tǒng)方法組;血清中NFP及MMP-2陽性率與mNGS陽性率均具有高度一致性。二元Logistic回歸分析顯示,血清NFP、MMP-2、mNGS陽性率升高均是兒童發(fā)生CNS感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。 ROC曲線分析顯示,血清NFP、MMP-2與mNGS的聯(lián)合預(yù)測(cè)因子在預(yù)測(cè)兒童CNS感染中具有較高的靈敏度和特異度,提示聯(lián)合應(yīng)用血清NFP、MMP-2與mNGS可增加兒童CNS感染的診斷的效能。

血清NFP、MMP-2與mNGS的聯(lián)合診斷兒童CNS感染具有一定的先進(jìn)性,但其局限性也不容忽視。首先,mNGS檢測(cè)需采集患兒入院72 h內(nèi)腦脊液標(biāo)本,采集操作較為復(fù)雜,患兒與家長的配合度不高;其次,對(duì)于血清NFP、MMP-2與mNGS的檢測(cè)需購買專業(yè)試劑盒和配套檢測(cè)儀器,目前檢測(cè)成本較高,經(jīng)濟(jì)方面限制其在臨床應(yīng)用的進(jìn)一步推廣。

綜上所述,CNS感染性疾病的患兒血清中NFP及MMP-2水平可對(duì)CNS感染的初步篩查具有積極意義;mNGS檢測(cè)靈敏度高于傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法、不受抗菌藥物治療影響,可指導(dǎo)抗菌藥物方案調(diào)整,有效提高患兒痊愈率;血清中NFP及MMP-2陽性率與mNGS陽性率均具有高度一致性,聯(lián)合應(yīng)用血清中NFP、MMP-2與mNGS在預(yù)測(cè)兒童CNS感染中具有良好的效能,可用于兒童CNS感染的初步篩查,具有較高的臨床價(jià)值。