急性缺血性卒中患者血清JKAP表達(dá)的臨床意義及與Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性分析*

唐 蓉,顏 彥,廖 琳,夏 川△,李海鵬

郴州市第一人民醫(yī)院:1.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心;2.神經(jīng)內(nèi)科,湖南郴州 423000

急性缺血性卒中(AIS)是由腦血管閉塞引起的局灶性神經(jīng)功能缺損性腦血管意外事件,目前主要包括靜脈溶栓、血管內(nèi)治療、抗血小板治療、抗凝劑等綜合治療,雖然治療技術(shù)在不斷地改善和提高,但是AIS患者殘疾率和死亡率依然較高[1]。為改善AIS臨床管理,探索識(shí)別高危AIS患者并監(jiān)測(cè)其預(yù)后的生物標(biāo)志物具有重要意義。有研究顯示免疫系統(tǒng)在AIS病理生理變化中發(fā)揮著關(guān)鍵且復(fù)雜的作用,先天免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞激活可加劇炎癥細(xì)胞因子釋放和腦組織損傷,影響AIS患者的病情進(jìn)展、嚴(yán)重程度和神經(jīng)預(yù)后[2]。輔助性T細(xì)胞(Th)具有調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)的作用,還可調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化以及腦血管疾病,有研究顯示Th1/Th2失衡,Th2受抑制可能促使動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程,AIS患者存在Th1/Th2向Th1漂移的現(xiàn)象[3]。Jun N-末端激酶通路相關(guān)磷酸酶(JKAP)具有調(diào)節(jié)Th1、Th2、Th17 細(xì)胞分化和炎癥反應(yīng)的作用,JKAP表達(dá)下調(diào)可促使Th1、Th17過(guò)度活化,與膿毒癥[4]、慢性阻塞性肺疾病[5]患者疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。JKAP在AIS的報(bào)道十分有限,本研究擬檢測(cè)AIS患者血清中JKAP表達(dá),分析其與AIS病情以及Th1/Th2細(xì)胞因子的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年2月至2021年6月本院神經(jīng)內(nèi)科收治的175例AIS患者作為AIS組,其中男119例,女56例,年齡55～75歲,平均(65.43±3.09)歲,體質(zhì)量指數(shù)(BMI)21～29 kg/m2,平均(25.39±3.69)kg/m2。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》診斷標(biāo)準(zhǔn)[6];(2)癥狀發(fā)作后24 h內(nèi)入院;(3)年齡50～80歲。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)顱內(nèi)出血;(2)既往有腦卒中史、顱腦手術(shù)史;(3)惡性腫瘤、感染或免疫疾病;(4)近1個(gè)月內(nèi)使用免疫抑制劑;(5)妊娠或哺乳患者。另選擇同期于本院進(jìn)行體檢的103例健康者作為對(duì)照組,其中男69例,女34例,年齡52～76歲,平均(64.96±3.26)歲,BMI 21～28 kg/m2,平均(24.89±3.51)kg/m2。兩組年齡、性別、BMI比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究已經(jīng)獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(M2018-056)。

1.2血清JKAP檢測(cè) AIS 患者入組次日,治療前采集空腹肘靜脈血3 mL,取血液凝固后上層液離心(相對(duì)離心力1 000×g,時(shí)間5 min)分離血清,采用Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)提取總 RNA,5×All-In-One RT MasterMix 試劑盒(Applied Biological Materials,Canada)將總 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:15 ℃ 30 min,45 ℃ 30 min,85 ℃ 5 min 滅活。CFX96實(shí)時(shí)熒光PCR儀(qPCR,美國(guó)Bio-Rad),SYPR Green PCR 試劑盒(日本TaKaRa公司)進(jìn)行qPCR檢測(cè),2-ΔΔCt法以 GAPDH 為內(nèi)參分析 JKAP相對(duì)表達(dá)水平。將2 μL cDNA樣品加入qPCR反應(yīng)體系(DNA模板2 μL,上下游引物各1 μL,Premix Ex Taq DNA 聚合酶25 μL,RNase-Free ddH2O 21 μL),反應(yīng)條件:95 ℃變性15 s,65 ℃退火20 s;75 ℃延伸15 s,共40個(gè)循環(huán)。引物序列:JKAP上游引物,5′-AGC AGC GGA TTC ACC ATC TC-3′,下游引物,5′-TGA TGT ATG CGA TCA CCA GTG T-3′。GADPH 上游引物:5′-TGA CGT GCC GCC TGG AGA AAC-3′,下游引物:5′-CCG GGC ATC GAA GGT GGA AGA G-3′。

1.3血清Th1/Th2細(xì)胞因子檢測(cè) 取血清樣本,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)水平,FK-SY96S全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自山東方科儀器有限公司,IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物公司,IFN-γ試劑盒購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司。

1.4神經(jīng)缺損和預(yù)后評(píng)估 入院當(dāng)日采用美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)[7]評(píng)估AIS患者神經(jīng)缺損程度,出院90 d后改良Rankin量表(mRS)[8]評(píng)估患神經(jīng)預(yù)后。NHISS評(píng)分從意識(shí)、視野、凝視、面癱等共9項(xiàng)評(píng)分,評(píng)分越高神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重,根據(jù)NIHSS評(píng)分將患者分為輕度組(<6分,51例)、中度組(6～<13分,68例)、重度組(≥13分,56例)。mRS分為0～6共7個(gè)等級(jí),等級(jí)越高預(yù)后越差,根據(jù)mRS將患者分為預(yù)后良好組(0～<3分)和預(yù)后不良組(≥3分)。收集患者年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史、基礎(chǔ)疾病、梗死部位(皮質(zhì)區(qū),皮質(zhì)下,腦干)、梗死原因(大動(dòng)脈硬化,小血管閉塞,心源性栓塞,其他)、NIHSS評(píng)分。

2 結(jié) 果

2.1AIS組和對(duì)照組血清JKAP表達(dá)、Th1/Th2細(xì)胞因子比較 AIS組血清JKAP表達(dá)、IL-4、IL-6、IL-10水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),IL-2、TNF-α、IFN-γ、IFN-γ/IL-4高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 AIS組和對(duì)照組血清JKAP表達(dá)、Th1/Th2細(xì)胞因子比較

2.2不同神經(jīng)缺損程度血清JKAP表達(dá)、Th1/Th2細(xì)胞因子比較 重度組血清JKAP表達(dá)、IL-4、IL-6、IL-10水平低于中度組和輕度組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),IL-2、TNF-α、IFN-γ、IFN-γ/IL-4高于中度組和輕度組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 不同神經(jīng)缺損程度血清JKAP表達(dá)、Th1/Th2細(xì)胞因子比較

2.3AIS患者JKAP表達(dá)與Th1/Th2細(xì)胞因子的相關(guān)性分析 AIS患者血清JKAP表達(dá)與IL-4、IL-6、IL-10呈正相關(guān)(P<0.05),與IL-2、TNF-α、IFN-γ、IFN-γ/IL-4呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 AIS患者JKAP表達(dá)與Th1/Th2細(xì)胞因子的相關(guān)性分析

2.4不同神經(jīng)預(yù)后患者血清JKAP表達(dá)、Th1/Th2細(xì)胞因子比較 175例患者中失訪3例,預(yù)后不良45例,預(yù)后良好127例。預(yù)后不良組血清JKAP表達(dá)、IL-4、IL-6、IL-10水平低于預(yù)后良好組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),IL-2、TNF-α、IFN-γ、IFN-γ/IL-4水平高于預(yù)后良好組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表4。

表4 不同神經(jīng)預(yù)后患者血清JKAP表達(dá)、Th1/Th2細(xì)胞因子比較

2.5影響AIS患者神經(jīng)預(yù)后的因素分析 預(yù)后不良組年齡、高血壓比例、糖尿病比例、入院時(shí)NIHSS評(píng)分均高于預(yù)后良好組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),兩組性別、BMI、吸煙史、飲酒史、高脂血癥、梗死部位、梗死病因比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表5。以AIS患者預(yù)后為因變量(預(yù)后良好=0,預(yù)后不良=1),年齡、高血壓、糖尿病、入院時(shí)NIHSS評(píng)分、JKAP、IL-4、IL-6、IL-10、 IL-2、TNF-α、IFN-γ、IFN-γ/IL-4為自變量(連續(xù)性變量以原值輸入;無(wú)高血壓=0、有高血壓=1;無(wú)糖尿病=0、有糖尿病=1),建立Logistic回歸模型,向后逐步法排除無(wú)關(guān)變量,最終高NIHSS評(píng)分,高IFN-γ/IL-4是AIS預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素(P<0.05),高JKAP是保護(hù)因素(P<0.05),見(jiàn)表6。

表5 不同預(yù)后患者的臨床資料比較或n(%)]

表6 AIS患者預(yù)后影響因素的Logistic回歸分析

3 討 論

AIS是世界上第三大死亡原因和最常見(jiàn)的致殘?jiān)?每年全球約有1 500萬(wàn)人發(fā)生AIS,其中500萬(wàn)人死亡,另1 000萬(wàn)人遺留永久殘疾,AIS發(fā)病與年齡、性別、糖尿病、高血壓、高血脂、遺傳等有關(guān)[2],其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前認(rèn)為興奮性毒性、氧化應(yīng)激和炎癥參與缺血引起的腦損傷,炎癥過(guò)程介導(dǎo)的血腦屏障破裂使激活的血源性免疫細(xì)胞(中性粒細(xì)胞和 T 細(xì)胞)到達(dá)腦梗死組織中積聚和浸潤(rùn),進(jìn)一步激活小膠質(zhì)細(xì)胞,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子、活性氧和一氧化氮,加劇神經(jīng)炎癥反應(yīng),神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增加,從而導(dǎo)致發(fā)生更大的梗死面積和更差的神經(jīng)結(jié)果[9]。Th細(xì)胞失調(diào)在動(dòng)脈粥樣硬化和心腦血管疾病的發(fā)展中起重要作用,Th1被認(rèn)為是動(dòng)脈硬化斑塊中含量最高的Th細(xì)胞亞群,Th1通過(guò)分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α和淋巴毒素激活巨噬細(xì)胞并促使巨噬細(xì)胞炎癥表型轉(zhuǎn)化,加劇炎癥反應(yīng),促使動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成,降低斑塊穩(wěn)定性[10-11]。在AIS發(fā)病過(guò)程中,Th1細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子,加劇神經(jīng)炎癥,Th2細(xì)胞可通過(guò)合成IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等抗炎細(xì)胞因子發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,Th1/Th2向Th1漂移可介導(dǎo)神經(jīng)炎癥和毒性,與神經(jīng)功能缺損程度之間存在顯著關(guān)聯(lián)性[12-13]。

JKAP是一種特異性作用于C-Jun N-末端激酶(JNK)的酪氨酸磷酸酶,也稱為雙特異性磷酸酶22,屬于低分子非典型雙特異性磷酸酶家族,在T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá),其主要作用為使JNK、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和p38激酶失活[14]。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)JKAP是調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素,可直接滅活Lck激活T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo),抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和炎癥細(xì)胞因子表達(dá),誘導(dǎo)炎癥疾病和自身免疫疾病[14]。研究顯示系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血T細(xì)胞中JKAP蛋白表達(dá)顯著降低,外周血T細(xì)胞中JKAP蛋白表達(dá)與系統(tǒng)性紅斑狼疾病活動(dòng)指數(shù)和抗dsDNA抗體水平呈負(fù)相關(guān)[15],JKAP 在活動(dòng)性炎癥性腸病患者炎癥黏膜中表達(dá)降低,并且與疾病活動(dòng)性、IL-17和腫瘤壞死因子呈負(fù)相關(guān),JKAP表達(dá)受抑制可促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞活化增殖,Th1、Th17分化,從而誘導(dǎo)炎癥性腸病發(fā)生[16]。膿毒癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中JKAP表達(dá)下調(diào),Th1、Th17 細(xì)胞占比增高,JKAP表達(dá)與膿毒癥患Th1、Th17細(xì)胞占比呈負(fù)相關(guān)[17]。JKAP增加可降低炎癥反應(yīng),增加類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎風(fēng)險(xiǎn)[18]。

JKAP與神經(jīng)系統(tǒng)疾病也存在密切關(guān)系,相關(guān)報(bào)道指出帕金森病患者JKAP表達(dá)下調(diào),且與Th1、Th17細(xì)胞占比呈負(fù)相關(guān)[19],JKAP介導(dǎo)的Th1、Th17過(guò)度分化與帕金森患者認(rèn)知障礙有關(guān)[20]。目前JKAP與AIS的關(guān)系尚不清楚,本研究發(fā)現(xiàn)AIS組血清JKAP表達(dá)低于對(duì)照組,且重度組低于輕、中度組,表明JKAP表達(dá)與AIS嚴(yán)重程度有關(guān)。有研究顯示,JNK信號(hào)通路激活可放大Toll樣受體4 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),并可易位到細(xì)胞核中誘導(dǎo)編碼促炎細(xì)胞因子的基因表達(dá)正調(diào)節(jié)活化的核因子-κB,JNK還被認(rèn)為是一種主要的應(yīng)激激活蛋白激酶,在缺血再灌注損傷刺激下激活小膠質(zhì)細(xì)胞,誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)[21]。鑒于JKAP在JNK通路的抑制作用,推測(cè)其表達(dá)缺失可能降低其抑制JNK信號(hào)通路的功能,進(jìn)而促使JNK信號(hào)通路激活和神經(jīng)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示AIS患者血清JKAP表達(dá)與Th1細(xì)胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ水平呈負(fù)相關(guān),與Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10呈正相關(guān),表明JKAP水平降低可能促使Th1細(xì)胞因子釋放,抑制Th2細(xì)胞因子合成,誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng),繼而參與AIS發(fā)病過(guò)程。YANG等[19]研究也顯示JKAP 過(guò)表達(dá)可抑制CD4+T細(xì)胞活化及其向Th1和Th17細(xì)胞分化,其表達(dá)缺失則相反。通過(guò)隨訪發(fā)現(xiàn)高JKAP是AIS患者預(yù)后不良的保護(hù)因素,高NIHSS評(píng)分,高IFN-γ/IL-4是AIS預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素,推測(cè)JKAP缺乏介導(dǎo)的Th1/Th2失衡,以Th1為主的免疫炎癥反應(yīng)可加重神經(jīng)損傷,導(dǎo)致AIS患者神經(jīng)預(yù)后不良。

綜上所述,AIS患者血清JKAP表達(dá)降低,JKAP低表達(dá)與神經(jīng)缺損加重和神經(jīng)預(yù)后不良有關(guān),JKAP表達(dá)缺失可能促使Th1細(xì)胞因子釋放,抑制Th2細(xì)胞因子合成,促使AIS發(fā)病進(jìn)程。本研究創(chuàng)新在于首次證實(shí)JKAP與AIS的關(guān)系,為臨床診斷和治療提供了新的思路和參考。不足之處在于僅納入AIS患者,JKAP在其他腦卒中類型中的臨床作用尚不清楚,JKAP調(diào)節(jié)Th細(xì)胞分化、神經(jīng)功能的潛在機(jī)制有待進(jìn)一步開(kāi)展基礎(chǔ)研究加以證實(shí)。