血清NLRP3、HMG-1、IL-10表達(dá)水平與膿毒癥患者病情及預(yù)后的關(guān)系探究*

李 楠,江 娜,寧可娟,張明明,緱豪兵,候永生,同亞妮

兵器工業(yè)五二一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,陜西西安 710065

膿毒癥是一種臨床上較常見的繼發(fā)于創(chuàng)傷、燒傷、手術(shù)、感染等的全身炎癥綜合征,隨著病情的加重,可導(dǎo)致患者臟器功能障礙、休克,死亡率較高,調(diào)查顯示,大約20%～50%的膿毒癥患者全因死亡,預(yù)后大多不良[1-2]。近年來,世界范圍內(nèi)膿毒癥的發(fā)病率和死亡率呈逐年升高趨勢(shì),多數(shù)患者預(yù)后不良,嚴(yán)重影響著患者的生命安全,因此如何早期評(píng)估患者病情和預(yù)后轉(zhuǎn)歸格外重要[3]。有研究發(fā)現(xiàn)[4],炎癥貫穿膿毒癥整個(gè)發(fā)展過程,核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)是細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體,在機(jī)體受到外界刺激后NLRP3被激活,經(jīng)募集炎癥因子,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。高遷移率族蛋白1(HMG-1)與膿毒癥炎癥反應(yīng)狀態(tài)相關(guān),可誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞游離至細(xì)胞外,對(duì)細(xì)胞核內(nèi)DNA結(jié)合蛋白具有活化作用,其表達(dá)水平升高往往標(biāo)志著膿毒癥患者局部炎癥級(jí)聯(lián)[5]。白細(xì)胞介素-10(IL-10)屬于一種抗炎癥發(fā)生介質(zhì),具有抑制炎性介質(zhì)分泌,增強(qiáng)免疫球蛋白功能的作用,有研究發(fā)現(xiàn)[6],在促炎因子過度分泌下,機(jī)體免疫系統(tǒng)失衡,而IL-10為維持抗炎和促炎平衡而大量合成,進(jìn)而表現(xiàn)為高表達(dá)于膿毒癥患者外周血中。雖然目前部分研究已經(jīng)證實(shí)NLRP3、HMG-1、IL-10均與膿毒癥發(fā)生有關(guān),但有關(guān)三者與患者預(yù)后的研究較少,鑒于此,本文為了探討三者對(duì)患者預(yù)后的影響,分析了血清NLRP3、HMG-1、IL-10與膿毒癥患者預(yù)后的關(guān)系,為臨床上膿毒癥的診治提供依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2022年1-12月于本院就診的180例膿毒癥患者作為膿毒癥組,其中男92例,女88例,年齡35～77歲,平均(56.95±9.87)歲,疾病嚴(yán)重程度:輕度78例,重度50例,膿毒性休克52例;另選同期于本院體檢的體檢健康者180例作為對(duì)照組,其中男100例,女80例,年齡34～76歲,平均(57.23±10.15)歲。兩組一般資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。研究對(duì)象均知情本次研究,簽署了知情同意書,且獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)膿毒癥組符合文獻(xiàn)[7]中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),即存在原發(fā)感染或者菌血癥,同時(shí)具備以下其中兩項(xiàng)即可確診,①體溫異常(<36 ℃或>38.5 ℃);②呼吸頻率改變(>40次/分鐘);③心率改變(<100次/分鐘或>180次/分鐘);④白細(xì)胞計(jì)數(shù)>19.5×109L或<5.0×109L。(2)疾病嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):無器官衰竭定義為輕度膿毒癥,伴有多器官衰竭、低血壓或組織灌注不良定義為重度膿毒癥;經(jīng)足量液體復(fù)蘇干預(yù)后仍存在難以糾正的持續(xù)性低血壓定義為膿毒性休克。(3)對(duì)照組體檢正常,自愿參與。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)自身免疫缺陷者;(2)有血液系統(tǒng)嚴(yán)重病變者;(3)心血管、腦血管病變者;(4)非膿毒癥導(dǎo)致死亡者;(5)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)服用免疫抑制劑者;(5)惡性腫瘤者;(6)溝通、精神異常者。

1.2方法

1.2.1血清NLRP3、HMG-1、IL-10表達(dá)水平檢測(cè) 在所有研究對(duì)象入組后,抽取3 mL空腹靜脈血,分離血清,使用美谷分子儀器(上海)有限公司的SpectraMax Mini 多功能酶標(biāo)儀利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清NLRP3、HMG-1、IL-10表達(dá)水平。取血清NLRP3 ELISA試劑盒、HMG-1 ELISA試劑盒、IL-10 ELISA試劑盒復(fù)溫處理,分別設(shè)置樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白對(duì)照組孔,將100 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品、蒸餾水加入酶標(biāo)板的樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白對(duì)照組孔內(nèi),樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔分別加入酶標(biāo)液50 μL,封板,恒溫環(huán)境下孵育120 min,清洗反應(yīng)板,加入NLRP3、HMG-1、IL-10抗體工作液、加50 μL顯色劑A、50 μL顯色劑B,室溫下10 min,加入50 μL終止液,在波長(zhǎng)為450 mm處測(cè)定獲得的吸光度值(A值),做標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制,獲得獲得血清NLRP3、HMG-1、IL-10表達(dá)水平。NLRP3 ELISA試劑盒(參考區(qū)間286.90±20.50 ng/mL)、HMG-1 ELISA試劑盒(參考區(qū)間5.10±1.00 ng/L)、IL-10 ELISA試劑盒(參考區(qū)間38.6±10.6 μg/L)及相關(guān)試劑均由北京義翹神州科技股份有限公司(Sino Biological Inc.)提供。

1.2.2預(yù)后結(jié)局評(píng)價(jià) 膿毒癥患者入院后均行常規(guī)抗膿毒癥治療,統(tǒng)計(jì)28 d短期預(yù)后狀況,根據(jù)患者預(yù)后狀況分為生存組、死亡組兩組。

1.3指標(biāo)觀察 (1)對(duì)比NLRP3、HMG-1、IL-10在對(duì)照組、膿毒癥組血清中的表達(dá)水平比較,并分析不同病程膿毒癥患者血清NLRP3、HMG-1、IL-10表達(dá)水平的差異;(2)統(tǒng)計(jì)生存組、死亡組患者的臨床資料,包括性別、年齡、血培養(yǎng)結(jié)果、有無合并癥、感染部位、感染部位個(gè)數(shù)、有無膿毒性休克、器官功能障礙、病原菌類型、機(jī)械通氣、快速膿毒癥相關(guān)序貫器官衰竭(qSOFA)評(píng)分[8]、急性生理學(xué)與慢性健康狀況評(píng)分系統(tǒng)Ⅱ(APACHEⅡ)評(píng)分[9]、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、降鈣素原、總膽紅素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血肌酐、活化部分凝血酶時(shí)間、凝血酶原時(shí)間)等,明確膿毒癥患者預(yù)后結(jié)局的影響因素;(3)比較不同預(yù)后患者血清NLRP3、HMG-1、IL-10表達(dá)水平的差異;(4)分析血清NLRP3、HMG-1、IL-10表達(dá)水平預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后結(jié)局的效能,分析不同表達(dá)水平患者28 d生存率;(6)分析NLRP3、HMG-1、IL-10之間在膿毒癥中的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1NLRP3、HMG-1、IL-10在對(duì)照組、膿毒癥組血清中的表達(dá)水平比較 膿毒癥組血清NLRP3、HMG-1、IL-10水平較對(duì)照組顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 NLRP3、HMG-1、IL-10在對(duì)照組、膿毒癥組血清中的表達(dá)水平比較

2.2血清NLRP3、HMG-1、IL-10表達(dá)水平在不同病情膿毒癥患者中的比較 經(jīng)分析不同病情患者血清NLRP3、HMG-1、IL-10表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),病情越重血清NLRP3、HMG-1、IL-10表達(dá)水平越高,膿毒性休克患者血清NLRP3、HMG-1、IL-10表達(dá)水平高于重度患者高于輕度患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 血清NLRP3、HMG-1、IL-10表達(dá)水平在不同病情膿毒癥患者中的比較

2.3不同預(yù)后膿毒癥患者臨床資料比較 與生存組比較,死亡組血培養(yǎng)陽性率、有合并癥、感染部位個(gè)數(shù)≥3個(gè)、膿毒性休克、器官功能障礙≥2種、機(jī)械通氣占比升高,qSOFA評(píng)分、APACHEⅡ評(píng)分、降鈣素原、活化部分凝血酶時(shí)間、凝血酶原時(shí)間升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同預(yù)后膿毒癥患者臨床資料比較[n/n或或n/n/n]

2.4不同預(yù)后膿毒癥患者血清NLRP3、HMG-1、IL-10的表達(dá)水平差異分析 死亡組血清NLRP3、HMG-1、IL-10較生存組患者顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同預(yù)后膿毒癥患者血清NLRP3、HMG-1、IL-10的表達(dá)水平差異分析

2.5膿毒癥患者預(yù)后結(jié)局的影響因素分析 以膿毒癥患者預(yù)后結(jié)局作為因變量(生存=0,死亡=1),將血培養(yǎng)陽性、有無合并癥、感染部位個(gè)數(shù)、有無膿毒性休克、器官功能障礙狀況、有無機(jī)械通氣、qSOFA評(píng)分、APACHEⅡ評(píng)分、降鈣素原、活化部分凝血酶時(shí)間、凝血酶原時(shí)間、NLRP3、HMG-1、IL-10作為自變量,進(jìn)行多因素Logistic分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),膿毒癥患者預(yù)后結(jié)局受膿毒性休克、qSOFA評(píng)分、APACHEⅡ評(píng)分、降鈣素原、NLRP3、HMG-1、IL-10等因素的影響,是導(dǎo)致患者預(yù)后結(jié)局不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表5。

表5 膿毒癥患者預(yù)后結(jié)局的影響因素分析

2.6血清NLRP3、HMG-1、IL-10預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后結(jié)局的效能分析 ROC曲線顯示,血清NLRP3、HMG-1、IL-10預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后的曲線下面積(AUC)分別為0.811、0.875、0.830,三者聯(lián)合預(yù)測(cè)AUC為0.910,與單一指標(biāo)相比,三者聯(lián)合預(yù)測(cè)效更優(yōu)。見表6。

表6 血清NLRP3、HMG-1、IL-10預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后結(jié)局的效能分析

2.7血清NLRP3、HMG-1、IL-10之間的相關(guān)性分析 經(jīng)分析膿毒癥患者血清NLRP3、HMG-1、IL-10之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn),三者在膿毒癥中呈正相關(guān)(r=0.453、0.460、0.472,P<0.05)。見圖1。

圖1 血清NLRP3、HMG-1、IL-10之間的相關(guān)性分析圖

2.8膿毒癥患者28 d生存狀況分析 根據(jù)ROC曲線分析,將膿毒癥患者分為兩組,結(jié)果發(fā)現(xiàn),NLRP3、HMG-1、IL-10高表達(dá)組患者較低表達(dá)組生存率明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表7。

圖2 生存曲線圖

表7 膿毒癥患者28 d生存狀況分析[n(%)]

3 討 論

多種內(nèi)源性因子表達(dá)水平異常所致的全身炎癥反應(yīng)是膿毒癥發(fā)生的重要病理機(jī)制,在疾病發(fā)生初期,炎癥誘導(dǎo)全身應(yīng)激,誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞分泌毒素,隨著病程的延長(zhǎng),病情逐漸加重,機(jī)體產(chǎn)生進(jìn)階反應(yīng),最終導(dǎo)致組織損傷、臟器功能障礙、膿毒性休克的發(fā)生[10-12]。目前膿毒癥已經(jīng)成為臨床上感染致死的主要原因,膿毒癥的發(fā)生給患者、社會(huì)產(chǎn)生巨大負(fù)擔(dān),因此早期評(píng)估患者病情和預(yù)后對(duì)改善預(yù)后影響巨大。

NLRP3屬于一種與機(jī)體先天免疫相關(guān)的蛋白質(zhì),主要在巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞中表達(dá),參與機(jī)體先天免疫應(yīng)答,NLRP3激活后其末端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域經(jīng)募集半胱氨酸蛋白酶-1和凋亡相關(guān)基因,形成炎癥小體,誘導(dǎo)炎癥和細(xì)胞凋亡[13-15]。有研究顯示[16-17],在膿毒癥發(fā)生后NLRP3活性增加,炎癥小體活化,通過促進(jìn)炎癥介質(zhì)分泌而刺激器官炎癥級(jí)聯(lián)。在本研究中分析膿毒癥患者與健康志愿者血清NLRP3表達(dá)水平的差異顯示,與健康者比較,膿毒癥患者血清NLRP3表達(dá)水平明顯升高,且隨著患者病情的加重,NLRP3高表達(dá)逐漸加劇,此結(jié)果提示著,NLRP3可能參與膿毒癥的發(fā)生進(jìn)展,機(jī)制可能為膿毒癥發(fā)生后,機(jī)體免疫系統(tǒng)為抵抗外界侵襲,免疫細(xì)胞活性增加,從而導(dǎo)致大量NLRP3釋放,過量的NLRP3通過促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放誘導(dǎo)疾病惡化,此結(jié)果與上述報(bào)道結(jié)果保持一致。NLRP3經(jīng)通過擴(kuò)大炎癥反應(yīng)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡促進(jìn)膿毒癥進(jìn)展,動(dòng)物研究證實(shí)[18],在敲除NLRP3基因后,膿毒癥小鼠炎癥反應(yīng)被抑制,免疫力顯著提高,生存率升高。本研究進(jìn)一步分析NLRP3與膿毒癥患者預(yù)后結(jié)局的相關(guān)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),預(yù)后死亡的患者血清NLRP3表達(dá)處于較高水平,高表達(dá)的患者生存率較低,此結(jié)果提示著,NLRP3與膿毒癥患者預(yù)后相關(guān),分析其原因可能與病情越來越嚴(yán)重,NLRP3所介導(dǎo)的免疫炎癥更加強(qiáng)烈,對(duì)免疫細(xì)胞凋亡的影響越來越大,進(jìn)而導(dǎo)致不良預(yù)后相關(guān)。

HMG-1作為HMG家族中含量最多的蛋白,內(nèi)含219個(gè)氨基酸殘基,廣泛分布于淋巴結(jié)、心、肝、腎、腦等組織中,定位于細(xì)胞核[19-20]。既往有報(bào)道顯示[21],脂多糖和炎癥介質(zhì)可刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生HMG-1的蛋白質(zhì),在內(nèi)毒素的致病過程中可能具有潛在作用,認(rèn)為在內(nèi)毒素攻擊后8 h,HMG-1在外周血中的含量明顯生升高,且隨著內(nèi)毒素攻擊程度的加劇而逐漸升高,被稱為膿毒癥的晚期介質(zhì)。馬偉科等[22]在其報(bào)道中顯示,HMG-1分泌量與膿毒癥炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)。另外隨著臨床上對(duì)HMG-1在膿毒癥中的作用發(fā)現(xiàn),在膿毒癥發(fā)生早期,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性介質(zhì)的過度釋放,經(jīng)活化細(xì)胞核內(nèi)DNA結(jié)合蛋白,誘導(dǎo)HMG-1合成分泌,HMG-1又反向誘導(dǎo)TNF-α分泌,從而形成惡性循環(huán)[23-24]。在本研究中分析血清HMG-1在膿毒癥中的表達(dá)水平及與患者預(yù)后結(jié)局的關(guān)系發(fā)現(xiàn),膿毒癥患者血清HMG-1表達(dá)水平顯著高于健康者,且以病情較嚴(yán)重的膿毒性休克患者表達(dá)水平最高,進(jìn)一步明確HMG-1與患者預(yù)后結(jié)局的關(guān)系,結(jié)果顯示,預(yù)后死亡患者血清HMG-1表達(dá)水平明顯升高,HMG-1高表達(dá)水平是導(dǎo)致患者預(yù)后死亡的危險(xiǎn)因素,此結(jié)果提示著HMG-1可能參與膿毒癥的發(fā)生進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸,分析其原因可能與在內(nèi)毒素和TNF-α等炎性介質(zhì)的刺激下,HMG-1分泌增加,而對(duì)于預(yù)后死亡的患者來說,病情較嚴(yán)重,體內(nèi)內(nèi)毒素表達(dá)水平和炎癥反應(yīng)程度明顯高于存活患者,因此導(dǎo)致HMG-1處于較高水平相關(guān)。

IL-10是一種常見的抗炎相關(guān)因子,主要由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌,具有抑制炎癥級(jí)聯(lián)的作用,有研究顯示[25-26],膿毒癥同時(shí)存在免疫抑制和炎癥激活,而在此過程中IL-10為了平衡機(jī)體抗炎/抑炎和免疫應(yīng)答平衡,大量分泌IL-10在抵抗機(jī)體感染中具有重要作用。閆雪梅[27]研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥患者血清IL-10處于異常高表達(dá)水平狀態(tài),其研究認(rèn)為,發(fā)生此現(xiàn)象的原因可能為膿毒癥發(fā)生后,患者血管內(nèi)皮損傷,炎癥相關(guān)因子出現(xiàn)失控釋放,促炎、抗炎失衡有關(guān)。另外有報(bào)道稱[28-29],IL-10參與膿毒癥整個(gè)發(fā)生過程。本研究顯示,隨著病情的加重膿毒癥患者血清IL-10表達(dá)水平逐漸升高,以膿毒性休克患者表達(dá)最高,此結(jié)果與王婷等[30]報(bào)道結(jié)果一致。本研究進(jìn)一步分析IL-10與膿毒癥患者預(yù)后的關(guān)系,結(jié)果顯示,死亡組血清IL-10水平較生存組患者顯著升高,且IL-10升高是影響膿毒癥患者預(yù)后結(jié)局的重要因素之一,此結(jié)果提示IL-10可能參與膿毒癥的發(fā)生進(jìn)展及預(yù)后轉(zhuǎn)歸過程,分析IL-10在死亡患者血清中升高的機(jī)制肯可能為膿毒癥發(fā)生后,為抑制促炎介質(zhì)過度釋放所致的免疫抑制IL-10合成增加,IL-10過量升高抑制機(jī)體清除致病菌能力,甚至引起免疫麻痹,增加全身感染風(fēng)險(xiǎn),進(jìn)而導(dǎo)致死亡。

本研究進(jìn)一步經(jīng)多因素Logistic分析發(fā)現(xiàn),患者預(yù)后結(jié)局不良除了受膿毒性休克、qSOFA評(píng)分、APACHEⅡ評(píng)分、降鈣素原的影響外,NLRP3、HMG-1、IL-10升高同樣是導(dǎo)致患者預(yù)后結(jié)局不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,且三者在膿毒癥中呈正相關(guān),本研究推測(cè),NLRP3、HMG-1、IL-10可能在某一共同機(jī)制中參與膿毒癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸,但其具體機(jī)制尚不知曉,還需后續(xù)研究進(jìn)一步深入挖掘。另外本研究結(jié)果顯示,NLRP3、HMG-1、IL-10聯(lián)合預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后結(jié)局的價(jià)值最優(yōu),優(yōu)于單一指標(biāo),提示臨床可根據(jù)血清NLRP3、HMG-1、IL-10表達(dá)水平早期預(yù)測(cè)患者預(yù)后。并根據(jù)ROC曲線分析所獲得的最佳截?cái)嘀颠M(jìn)行分組,根據(jù)NLRP3、HMG-1、IL-10表達(dá)水平高低分為高表達(dá)水平和低表達(dá)水平兩組,比較兩組存活率,結(jié)果顯示,高表達(dá)水平患者生存率較低,此結(jié)果進(jìn)一步說明了NLRP3、HMG-1、IL-10表達(dá)水平越高患者生存率越低,死亡率越高,與患者預(yù)后相關(guān)。

綜上所述,NLRP3、HMG-1、IL-10高表達(dá)水平于膿毒癥中,三者可能經(jīng)促進(jìn)炎癥和細(xì)胞凋亡促進(jìn)病情進(jìn)展,導(dǎo)致預(yù)后不良,與患者病情和預(yù)后死亡相關(guān),可作為臨床評(píng)估膿毒癥患者預(yù)后的敏感指標(biāo)。