lncRNA FAM83H-AS1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲遷移的影響*

張 彪,朱慶芳

1.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院/福建省立醫(yī)院檢驗(yàn)科,福建福州 350001;2.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院,福建福州 350001

結(jié)直腸癌(CRC)是一種常見的消化道腫瘤,在世界上大多數(shù)國家的發(fā)病率和死亡率顯著增加[1]。目前認(rèn)為CRC的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段、多基因改變的協(xié)同過程,癌基因和抑癌基因的表達(dá)水平失調(diào)是CRC發(fā)生的分子基礎(chǔ)[2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)可以參與許多生物反應(yīng),主要在基因表達(dá)水平上發(fā)揮對(duì)原癌基因或抑癌基因的表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用,進(jìn)而參與多種腫瘤和其他疾病的發(fā)生和發(fā)展[3]。有研究表明,lncRNA與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。lncRNA TBILA可通過轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFB1)調(diào)節(jié)和加速肺癌細(xì)胞的增殖[4]。肌動(dòng)蛋白絲相關(guān)蛋1-反義RNA1(AFAP1-AS1)是一種在CRC組織中表達(dá)水平顯著升高的lncRNA,通過調(diào)節(jié)EZH2增強(qiáng)子的表達(dá)水平來增加細(xì)胞的增殖和侵襲[5]。同時(shí),lncRNA已被報(bào)道作為一種新的診斷或診斷預(yù)后的生物標(biāo)志物。本課題組在前期應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)CRC組織和癌旁組織進(jìn)行測(cè)序分析,篩選出了表達(dá)水平具有明顯差異的長鏈非編碼RNA序列相似性家族83成員H反義RNA 1(lncRNA FAM83H-AS1)。早期的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA FAM83H-AS1在膠質(zhì)瘤腫瘤組織中呈高表達(dá)水平[6]。在肺腺癌中,lncRNA FAM83H-AS1呈高表達(dá)水平的患者提示生存率較差,而下調(diào)該基因可通過調(diào)控MET/EGFR信號(hào)通路減弱細(xì)胞增殖和侵襲作用[7]。之前的RNA測(cè)序研究顯示,lncRNA FAM83H-AS1在CRC組織中表達(dá)水平上調(diào)[8],然而目前關(guān)于lncRNA FAM83H-AS1在CRC中的功能和作用機(jī)制報(bào)道較少。本研究旨在分析lncRNA FAM83H-AS1在CRC組織、細(xì)胞和血漿中的表達(dá)水平情況,并探究其表達(dá)水平敲低對(duì)CRC細(xì)胞增殖和侵襲遷移作用的影響及其潛在的分子機(jī)制,以期為CRC的分子診療提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性選取2017年5月至2019年12月于福建省立醫(yī)院(下稱本院)胃腸外科和腫瘤外科接受CRC手術(shù)切除的53例CRC患者的腫瘤組織,以及距癌灶5 cm以上的正常黏膜,放入液氮保存。所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查證實(shí),所有入選患者術(shù)前均未接受放化療治療。另收集2020年8月至2022年2月本院88例CRC患者和32例體檢健康者的血漿樣本。每位受試者收集5 mL抗凝血液,3 000 r/min分離血漿5 min,-80 ℃保存至使用。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn),入選患者均知情同意。

1.2儀器與試劑 FHC(正常結(jié)腸黏膜細(xì)胞系)和Caco-2(CRC細(xì)胞系)購自美國ATCC。SW480(CRC細(xì)胞系)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。SW620、HCT116、LoVo和HT29(CRC細(xì)胞系)來源于本實(shí)驗(yàn)室。DMEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清購自Gibco公司,Transwell小室購自美國Corning公司,CCK8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,L-15培養(yǎng)基購自南京凱基生物公司,SYBR Green PCR Mix試劑盒購自日本TaKaRa公司,抗基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9抗體購自美國Santa Cruz公司。Trizol試劑、抗GAPDH和二抗購自北京康為生物技術(shù)公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) SW480和SW620接種于L-15培養(yǎng)基,其他細(xì)胞系接種于DMEM培養(yǎng)基;培養(yǎng)液均含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和鏈霉素,在細(xì)胞培養(yǎng)箱于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng),待細(xì)胞融合度達(dá)約90%時(shí),用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照1×105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),待細(xì)胞達(dá)約80%匯合時(shí),按照轉(zhuǎn)染操作說明書將3個(gè)靶shRNA和陰性對(duì)照(上海吉瑪公司)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞,最終濃度為10 nmol/L。12 h后吸棄病毒培養(yǎng)液,加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況,采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)分析方法檢測(cè)干擾效率。

1.3.3qPCR檢測(cè) 使用Trizol試劑提取總RNA,使用NanoDrop分光光度計(jì)檢測(cè) RNA 濃度和純度。取1 μg RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后,根據(jù)說明書進(jìn)行qPCR反應(yīng),采用2×SYBR Green PCR Mix進(jìn)行。總反應(yīng)體系25 μL,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火、延伸30 s,共45個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt公式計(jì)算表達(dá)水平。引物序列如下,lncRNA FAM83H-AS1正向?yàn)?′-TAG GAA ACG AGC GAG CCC-3′;反向?yàn)?′-GCT TTG GGT CTC CCC TTC TT-3′;GAPDH正向?yàn)?′-ATG GAA ATC CCA TCA CCA TCT T-3′;反向?yàn)?′-ACG TAC TCA GCG CCA GCA T-3′;MMP-2正向?yàn)?′-CCA TCA TCA AGT TCC CCG GC-3′;反向?yàn)?′-CTG GGG CAG TCC AAA GAA CT-3′;MMP-9正向?yàn)?′-ACG ATG ACG AGT TGT GGT CC-3′;反向?yàn)?′-AGA AGC CGA AGA GCT TGT CC-3′。

1.3.4細(xì)胞增殖試驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后,收集每組的對(duì)數(shù)期細(xì)胞,在96孔板的5 000個(gè)細(xì)胞/孔中接種,然后在5%CO2和37 ℃條件下培養(yǎng)。在細(xì)胞接種后的24、48、72 h,向每孔加入10 μL的CCK-8試劑,細(xì)胞在37 ℃下再孵育2 h。用酶標(biāo)儀以630 nm為參考波長,以450 nm波長測(cè)定各孔內(nèi)吸光度(A)值。

1.3.5細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 遷移實(shí)驗(yàn):將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞消化后重懸于無血清培養(yǎng)液,調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/毫升,在Transwell上層小室中按每孔100 μL加入無血清細(xì)胞懸液(5×104個(gè)細(xì)胞),下室加入600 μL 含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基,于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出小室,用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞,經(jīng)4%多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染液染色后,用顯微鏡觀察和拍照,隨機(jī)選取8個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn):需在 Transwell小室上室預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠后備用,其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3.6免疫印跡法 收集各組細(xì)胞裂解后提取蛋白,BCA法定量。取15 μg蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜,使用5%脫脂奶粉封閉2 h,加一抗孵育過夜。TBST洗膜3次后分別與HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育1 h,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯影并拍照。以GAPDH為內(nèi)參,用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA FAM83H-AS1在CRC患者中的表達(dá)水平 lncRNA FAM83H-AS1在CRC組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),在CRC細(xì)胞株中的表達(dá)水平也顯著高于正常結(jié)腸黏膜細(xì)胞FHC,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。lncRNA FAM83H-AS1在CRC患者血漿中的表達(dá)水平明顯高于健康者血漿,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。lncRNA FAM83H-AS1對(duì)CRC患者的AUC為0.751,靈敏度為76%,特異度為66%。見圖1。

注:A為lncRNA FAM83H-AS1在CRC組織和癌旁組織中的表達(dá)水平;B為lncRNA FAM83H-AS1在CRC細(xì)胞與正常結(jié)腸黏膜細(xì)胞的表達(dá)水平;C為lncRNA FAM83H-AS1在CRC患者和健康者血漿中的表達(dá)水平;D為CRC患者血漿表達(dá)水平的ROC曲線。與健康者比較,*P<0.05。

2.2lncRNA FAM83H-AS1的表達(dá)水平與CRC臨床病理特征的關(guān)系 lncRNA FAM83H-AS1表達(dá)水平升高與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.019)和TNM分期(P=0.044)有關(guān),但與患者的性別、年齡、腫瘤部位、浸潤深度等均無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 lncRNA FAM83H-AS1表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.3敲低lncRNA FAM83H-AS1的表達(dá)水平對(duì)SW620細(xì)胞增殖的影響 將sh-FAM83H-AS1慢病毒轉(zhuǎn)染入表達(dá)水平最高的SW620細(xì)胞后,熒光顯微鏡下觀察各組轉(zhuǎn)染效率均為80%以上。qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,sh-FAM83H-AS1轉(zhuǎn)染組FAM83H-AS1的表達(dá)水平明顯低于轉(zhuǎn)染陽性對(duì)照(NC)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且在3個(gè)sh-FAM83H-AS1轉(zhuǎn)染組中sh-FAM83H-AS1-1表現(xiàn)出最高的干擾效率。CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示,與NC組相比,sh-FAM83H-AS1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖被明顯抑制(P<0.05),說明FAM83H-AS1可促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖。見圖2。

注:A為轉(zhuǎn)染后各組中l(wèi)ncRNA FAM83H-AS1的表達(dá)水平情況;B為CCK8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。blank表示空白對(duì)照,sh-FAM83H-AS1表示轉(zhuǎn)染lncRNA FAM83H-AS1。與NC組比較,*P<0.05。

2.4敲低lncRNA FAM83H-AS1的表達(dá)水平對(duì)SW620細(xì)胞遷移和侵襲的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NC組相比,sh-FAM83H-AS1轉(zhuǎn)染組平均每個(gè)視野穿至小室外的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯受到抑制,說明FAM83H-AS1可促進(jìn)CRC細(xì)胞遷移和侵襲。見圖3。

注:A為Transwell遷移實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞結(jié)果和統(tǒng)計(jì)圖;B為Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞結(jié)果和統(tǒng)計(jì)圖。blank表示空白對(duì)照,sh-FAM83H-AS1表示轉(zhuǎn)染lncRNA FAM83H-AS1。與NC組比較,*P<0.05。

2.5敲低lncRNA FAM83H-AS1的表達(dá)水平對(duì)MMP-2、MMP-9表達(dá)水平的影響 qPCR和免疫印跡法結(jié)果顯示,與NC組相比,sh-FAM83H-AS1轉(zhuǎn)染組MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注:A為qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞MMP-2、MMP-9的mRNA相對(duì)表達(dá)水平;B為免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)水平。blank表示空白對(duì)照,sh-FAM83H-AS1表示轉(zhuǎn)染lncRNA FAM83H-AS1。與NC組比較,*P<0.05。

3 討 論

CRC是我國常見的胃腸道惡性腫瘤,是癌癥相關(guān)死亡的第八大原因[8]。然而,癌癥診斷技術(shù)和治療方面的巨大進(jìn)步并不能顯著延長CRC患者的總生存時(shí)間[9],其最重要的原因是臨床確診CRC缺乏足夠的生物標(biāo)志物,從而使患者無法得到有效地治療。因此,尋找新的CRC分子診斷和治療靶點(diǎn),分析腫瘤進(jìn)展的相關(guān)機(jī)制,對(duì)CRC預(yù)后改善和生存率的提高具有重要意義。

lncRNA是RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的、由200多個(gè)核苷酸組成一組RNA,它是一種具有編碼蛋白潛能的基因,在腫瘤生物學(xué)中扮演著舉足輕重的角色[10]。腫瘤患者中l(wèi)ncRNA的異常在腫瘤發(fā)生中起著重要作用,目前越來越多的研究表明,多種異常表達(dá)的 lncRNAs 與包括CRC在內(nèi)的多種惡性腫瘤有關(guān)[11-13],其功能也包括了調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[14-15]。MA等[16]研究表明,lncRNA FAM83H-AS1的上調(diào)通過Wnt/β-連環(huán)蛋白通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。lncRNA FAM83H-AS1也通過表觀遺傳學(xué)沉默CDKN1A(p21)在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮致癌作用[6]。

在本研究中,本文首先檢測(cè)了lncRNA FAM83H-AS1在CRC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,lncRNA FAM83H-AS1在CRC組織中的表達(dá)水平明顯高于鄰近的癌旁組織,且在CRC細(xì)胞系中的表達(dá)水平也高于正常結(jié)腸黏膜細(xì)胞。此外,本文還檢測(cè)了lncRNA FAM83H-AS1在CRC患者血漿和健康者血漿中的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)其在CRC患者血漿中的表達(dá)水平明顯高于健康者血漿。本文分析了lncRNA FAM83H-AS1的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系,結(jié)果顯示lncRNA FAM83H-AS1的高表達(dá)與CRC患者的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)。由此可以推斷出lncRNA FAM83H-AS1有望成為CRC的早期篩查、早期診斷和預(yù)后判斷的潛在分子標(biāo)志。繼而,本文以lncRNA FAM83H-AS1表達(dá)水平相對(duì)較高的 SW620細(xì)胞為研究對(duì)象,探討lncRNA FAM83H-AS1對(duì)于CRC 細(xì)胞侵襲遷移能力的影響。本研究將sh-FAM83H-AS1慢病毒轉(zhuǎn)染入SW620細(xì)胞,敲低其表達(dá)水平,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖受到明顯抑制;同時(shí),Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲低lncRNA FAM83H-AS1可顯著抑制SW620細(xì)胞的遷移和侵襲能力,提示在CRC細(xì)胞中l(wèi)ncRNA FAM83H-AS1起促癌的作用。

腫瘤的轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是CRC患者的重要死因之一,抑制腫瘤的侵襲和遷移可有效遏制腫瘤的進(jìn)展。細(xì)胞外基質(zhì)和基底一起構(gòu)成腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的第一道屏障,其降解是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。MMPs是一類鋅離子和鈣離子依賴的蛋白酶家族,參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移過程。腫瘤細(xì)胞通過合成和分泌 MMPs降解細(xì)胞外基質(zhì)的各種蛋白質(zhì)底物,包括膠原蛋白和彈性蛋白,破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障,從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[17],并在血管生成、細(xì)胞凋亡和組織修復(fù)中發(fā)揮作用。多項(xiàng)研究證實(shí),MMP-2和MMP-9激活后的異常高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移的多樣性和預(yù)后不良密切相關(guān)[18-19]。本研究在證實(shí)了lncRNA FAM83H-AS1參與對(duì)CRC細(xì)胞侵襲遷移能力的調(diào)控后,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其可能通過上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平,加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解,從而促進(jìn)CRC細(xì)胞的侵襲遷移過程。

綜上所述,lncRNA FAM83H-AS1在CRC組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)且發(fā)揮促癌作用,通過外源 shRNA手段下調(diào)其表達(dá)可抑制其增殖和遷移侵襲能力,可能與抑制MMP-2和MMP-9表達(dá)水平有關(guān),有望成為CRC分子診斷和治療的生物標(biāo)志物和潛在靶點(diǎn)。