血漿Aβ、Aβ1-40、Aβ1-42水平及其比值對(duì)阿爾茲海默病診斷價(jià)值的研究*

劉茜輝,張 禾,陳奕君,銀夢(mèng)婷,李平云,馮 彬,熊 英,唐 玲,賀 勇△

1.四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科,四川成都 610041;2.四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院,四川成都 610041

阿爾茲海默病(AD)是造成癡呆最常見(jiàn)的原因[1],是一種進(jìn)行性、致命性的神經(jīng)退行性疾病,主要的臨床表現(xiàn)為記憶進(jìn)行性喪失以及認(rèn)知能力下降[2]。AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,主要的病理學(xué)特征有細(xì)胞外淀粉樣蛋白β(Aβ)聚集、細(xì)胞內(nèi)過(guò)度磷酸化tau蛋白形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)和進(jìn)行性神經(jīng)細(xì)胞死亡[3]。通常,AD是根據(jù)臨床表現(xiàn)如神經(jīng)心理測(cè)試和神經(jīng)影像學(xué)檢查來(lái)診斷。這種診斷模式可以較好地區(qū)分出AD的癡呆期和影響到日常生活交際的認(rèn)知障礙期[4],但對(duì)于AD早期的診斷效能較低。為了提高AD診斷模式的準(zhǔn)確性,國(guó)際工作小組(IWG)建議使用診斷標(biāo)志物如神經(jīng)影像學(xué)——用于評(píng)估大腦淀粉樣蛋白沉積的淀粉樣蛋白-PET(Amyloid-PET)、用于評(píng)估葡萄糖代謝的18F-氟脫氧葡萄糖(18F-FDG),以及測(cè)定腦脊液生物標(biāo)志物來(lái)進(jìn)行評(píng)估[5]。

長(zhǎng)期以來(lái),Aβ的積累及其在淀粉樣斑塊中的聚集和沉積被認(rèn)為是AD發(fā)生的關(guān)鍵致病機(jī)制[6]。Aβ1-40和Aβ1-42是不同長(zhǎng)度的Aβ片段肽,其中Aβ1-42因更易于聚集和形成斑塊而具有更強(qiáng)的神經(jīng)毒性[7]。有研究證實(shí),AD患者腦脊液中Aβ1-42減少,Aβ1-42水平與腦內(nèi)淀粉樣斑塊數(shù)量之間呈負(fù)相關(guān)[8]。通過(guò)對(duì)腦脊液中生物標(biāo)志物的檢測(cè),AD診斷的正確率已經(jīng)提升到了80%[9]。然而,要想實(shí)現(xiàn)AD的早期篩查和廣泛的人群普查,采用神經(jīng)影像學(xué)和腦脊液生物標(biāo)志物檢測(cè)并不切合實(shí)際。因此,開發(fā)基于血液檢測(cè)的AD生物標(biāo)志物是非常有必要的。國(guó)內(nèi)外部分研究著眼于血漿Aβ及其片段水平對(duì)AD的診斷效能,李娜等[10]針對(duì)天津市北辰地區(qū)105例AD患者的研究發(fā)現(xiàn),AD患者外周血Aβ1-42水平降低,Aβ1-40水平升高,Aβ1-42/Aβ1-40比值降低;VERBERK等[11]報(bào)道血漿Aβ1-42/Aβ1-40比值和Aβ1-42水平可以區(qū)分健康者和腦脊液淀粉樣蛋白異常的患者;VERGALLO等[12]報(bào)道血漿Aβ1-40/Aβ1-42比值具有較好的預(yù)測(cè)腦Aβ正電子發(fā)射斷層掃描狀態(tài)的作用。

本文基于在四川大學(xué)華西醫(yī)院診斷為AD的89例患者及89例健康對(duì)照人群,研究Aβ、Aβ1-40、Aβ1-42及其比值在兩組人群中表達(dá)水平的差異及各指標(biāo)對(duì)AD的診斷效能。

1 資料與方法

1.1一般資料 AD組納入2020年6月至2021年7月于四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的89例AD患者,納入標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)IWG及美國(guó)國(guó)家老齡問(wèn)題研究所阿爾茲海默病協(xié)會(huì)推出的診斷標(biāo)準(zhǔn)(任何時(shí)期的A加B兩方面):A為特異臨床表現(xiàn)為存在早期及顯著情景記憶障礙(孤立或與暗示癡呆綜合征或輕度認(rèn)知障礙相關(guān)的其他認(rèn)知、行為改變),包括(1)患者或知情者訴有超過(guò)6個(gè)月、逐步進(jìn)展的記憶能力下降;(2)海馬類型遺忘綜合征的客觀證據(jù),基于AD特異檢測(cè)方法——通過(guò)線索回憶測(cè)試等發(fā)現(xiàn)情景記憶能力顯著下降。B為體內(nèi)AD病理改變的證據(jù)(下述之一),(1)腦脊液中Aβ1-42表達(dá)水平的下降及T-tau或P-tau蛋白表達(dá)水平的上升;(2)淀粉樣PET成像,示蹤劑滯留增加;(3)AD常染色體顯性突變的存在(常攜有PSEN1、PSEN2、APP基因突變)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)非AD性癡呆;(2)重度抑郁;(3)腦血管疾病;(4)中毒、炎癥、代謝紊亂;(5)診斷為混合型AD,同時(shí)患有其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。對(duì)照組選取同一時(shí)期四川大學(xué)華西醫(yī)院健康體檢中心無(wú)任何疾病診斷,以及年齡、性別與AD組比例一致的89例體檢健康者。本研究得到四川大學(xué)華西醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 血漿Aβ、Aβ1-40、Aβ1-42檢測(cè)均采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),試劑盒購(gòu)于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司,分別為Aβ ELISA試劑盒(貨號(hào):MM-1669H1)、Aβ1-40 ELISA試劑盒(MM-0201H2)、Aβ1-42 ELISA試劑盒(MM-0562H2),采用最低檢測(cè)限均為1.0 ng/mL,檢測(cè)范圍分別為15～480 ng/mL、10～320 ng/mL、7.5～240.0 ng/mL。以上3種試劑的批內(nèi)精密度和批間精密度的變異系數(shù)CV均≤15%。酶標(biāo)儀采用Thermo Scientific Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀,波長(zhǎng)范圍200～1 000 nm。

1.3方法 AD組和健康對(duì)照組患者靜脈采血后,3 500 r/min離心10 min,分離出上層血漿,于-80 ℃冰箱保存,測(cè)試當(dāng)日取出于4 ℃溶解,測(cè)試前復(fù)溫至室溫。試劑盒于室溫平衡15～30 min,于96孔板前6孔分別加入50 μL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品,最后1孔不加樣品為空白孔,其余89孔均先加入稀釋液40 μL、后加入相應(yīng)樣品10 μL,除空白孔外每孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗100 μL,37 ℃水浴箱溫育60 min,每次浸泡30 s反復(fù)洗滌5次,拍干后加入顯色液A、B各50 μL,37 ℃水浴箱溫育15 min,加入終止液50 μL,15 min內(nèi)于Thermo Scientific Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(A)值,波長(zhǎng)設(shè)置為450 nm,每孔測(cè)量3次。計(jì)算每板標(biāo)準(zhǔn)曲線,換算A值為濃度值,3次濃度值的平均值作為該孔的濃度值。

2 結(jié) 果

2.1一般資料及Aβ指標(biāo)比較 AD組和健康對(duì)照組均為89例,其中AD組男性占41.67%,年齡48～98歲,中位年齡77歲;健康對(duì)照組男性占46.07%,年齡68～93歲,中位年齡79歲。兩組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。兩組Aβ表達(dá)水平分別為121.225(70.92～232.24) pg/mL、114.021(79.70～901.95) pg/mL,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.907,P=0.057)。AD組Aβ1-40、Aβ1-40/Aβ表達(dá)水平高于健康對(duì)照組Aβ1-40、Aβ1-40/Aβ表達(dá)水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-9.506,-9.704,P<0.001)。AD組Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ1-40、Aβ1-42/Aβ表達(dá)水平低于健康對(duì)照組Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ1-40、Aβ1-42/Aβ表達(dá)水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-9.968,-10.507,-10.958,P<0.001)。見(jiàn)表1。

表1 健康對(duì)照組和AD組一般資料及Aβ指標(biāo)比較[n(%)或M(P25～P75)]

2.2Aβ各指標(biāo)對(duì)AD的診斷效能 分別建立Aβ、Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ1-40、Aβ1-42/Aβ和Aβ1-40/Aβ的ROC曲線,其中,Aβ1-42/Aβ曲線下面積(AUC)最大,為0.977 5(95%CI:95.78%～99.32%),比值以0.58為最佳截?cái)嘀殿A(yù)測(cè)患AD時(shí),約登指數(shù)最大,對(duì)應(yīng)的靈敏度和特異度分別為91.0%和95.5%,準(zhǔn)確度為93.3%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)為95.3%,陰性預(yù)測(cè)值(NPV)為91.4%;其次AUC最大的是Aβ1-42/Aβ1-40,為0.955 9(95%CI:91.82%～99.37%),以0.82為最佳截?cái)嘀禃r(shí),約登指數(shù)最大為0.910,靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、PPV和NPV均為95.5%。其余指標(biāo)對(duì)AD的診斷效能參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 各Aβ指標(biāo)對(duì)AD診斷效能評(píng)價(jià)

2.3逐步回歸建立回歸方程 為排除變量間共線性干擾,以是否患AD為因變量,患者的年齡、性別、Aβ、Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ1-40、Aβ1-42/Aβ和Aβ1-40/Aβ為因變量,進(jìn)行逐步回歸分析,模型摘要見(jiàn)表3,其中模型5 R值最大,模型擬合效果最好。模型5參數(shù)檢驗(yàn)見(jiàn)表4,其中Aβ1-42/Aβ和Aβ1-40/Aβ對(duì)是否患AD的影響最大,B值分別為-2.982、2.57。預(yù)測(cè)AD患病風(fēng)險(xiǎn)的模型為Y=1.44-(2.982×Aβ1-42/Aβ)+(2.57×Aβ1-40/Aβ)+(0.009×Aβ)-(0.014×Aβ1-40)+(0.086×Aβ1-42/Aβ1-40)。

表3 逐步回歸分析模型摘要

表4 模型5參數(shù)表

3 討 論

對(duì)于AD患者,臨床的診斷多基于神經(jīng)心理測(cè)試和神經(jīng)影像學(xué)檢查,這些傳統(tǒng)的診斷模式受患者和測(cè)試者的主觀影響較大,因此開發(fā)更多的生物診斷標(biāo)志物是非常有必要的。針對(duì)AD的發(fā)病機(jī)制——大腦Aβ沉積等,測(cè)定腦脊液中的Aβ、tau蛋白等指標(biāo)水平,可以更好地診斷出早期AD及非典型AD[4]。鑒于腦脊液獲取的有創(chuàng)性以及在人群中廣泛進(jìn)行AD早期篩查的經(jīng)濟(jì)效益,以及據(jù)報(bào)道[13]30%～50%的Aβ蛋白肽段從中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至外周血進(jìn)行清除,因此血漿中AD生物診斷標(biāo)志物的開發(fā)近年來(lái)成為研究的熱點(diǎn)[14-15]。很多研究表明血漿生物標(biāo)志物與大腦中Aβ沉積程度有顯著關(guān)聯(lián),AKINORI 等[16]在一項(xiàng)多中心研究中證實(shí)基于血漿檢測(cè)的Aβ生物標(biāo)志物水平對(duì)大腦Aβ負(fù)擔(dān)具有較好的預(yù)測(cè)作用。OVOD 等[17]發(fā)現(xiàn)Aβ1-42在血漿中Aβ相關(guān)的改變與其在腦脊液中的改變具有相似性,血漿中Aβ的測(cè)量顯示出良好的穩(wěn)定性及靈敏度?；谝陨锨疤?本文旨在探究血漿Aβ、Aβ1-40、Aβ1-42水平及其比值在AD人群和健康人群中的差異及各指標(biāo)對(duì)AD的診斷效能。

在本研究中,AD組和健康對(duì)照兩組中位Aβ水平分別為114.021 pg/mL、121.225 pg/mL,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.907,P=0.057)。Aβ是AD病程發(fā)展中的一個(gè)重要蛋白質(zhì),它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的聚集誘導(dǎo)了一系列復(fù)雜的病理過(guò)程[18]。近年有研究發(fā)現(xiàn)Aβ不僅產(chǎn)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng),也產(chǎn)生于外周系統(tǒng)如腎上腺、腎臟、心臟、肝臟、脾臟、胰腺和肌肉等[19],這些混雜因素可能是血漿總Aβ對(duì)AD診斷效能較弱的原因。而Aβ的片段肽Aβ1-40和Aβ1-42更受到廣泛關(guān)注,Aβ1-42更容易聚集為原纖維,而Aβ1-40會(huì)阻礙Aβ1-42的聚集,所以Aβ1-42/Aβ1-40的比值更具有臨床意義[20-21]。在本文中,AD組中位Aβ1-40(94.586 pg/mL)、Aβ1-40/Aβ(0.825)高于健康對(duì)照組中位Aβ1-40(73.419 pg/mL)、Aβ1-40/Aβ(0.609),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-9.506,-9.704,P<0.001)。AD組中位Aβ1-42(56.536 pg/mL)、Aβ1-42/Aβ1-40(0.588)、Aβ1-42/Aβ(0.491)低于健康對(duì)照組中位Aβ1-42(82.653 pg/mL)、Aβ1-42/Aβ1-40(1.141)、Aβ1-42/Aβ(0.680),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-9.968,-10.507,-10.958,P<0.001)。

Aβ1-42和Aβ1-40單個(gè)指標(biāo)顯示出良好的診斷效能,Aβ1-42比Aβ1-40的診斷效能更優(yōu),與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究[11,22-23]結(jié)論一致。這一結(jié)果可能與AD的病理發(fā)病機(jī)制有關(guān),Aβ1-42較Aβ1-40疏水性更強(qiáng),更易聚集和導(dǎo)致阿爾茲海默老年斑(ADSP)形成。Aβ各個(gè)指標(biāo)的比值比單個(gè)Aβ指標(biāo)顯示出更好的診斷效能,Aβ1-42/Aβ、Aβ1-42/Aβ1-40 AUC超過(guò)0.95,這與PALMQVIST等[24]報(bào)道一致。近年來(lái),Aβ指標(biāo)比值成為AD診斷標(biāo)志物中研究的熱點(diǎn),有研究表明Aβ1-42/Aβ1-40具有篩查普通人群中腦Aβ沉積水平升高的臨床應(yīng)用潛能[25]。將患者的年齡、性別、Aβ、Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ1-40、Aβ1-42/Aβ和Aβ1-40/Aβ為因變量進(jìn)行逐步回歸分析,發(fā)現(xiàn)Aβ1-42/Aβ、Aβ1-40/Aβ、Aβ、Aβ1-40、Aβ1-42/Aβ1-40為預(yù)測(cè)變量構(gòu)建的模型對(duì)是否患AD的擬合度最優(yōu),其中Aβ1-42/Aβ、Aβ1-40/Aβ兩個(gè)比值對(duì)結(jié)局的影響最大,這也進(jìn)一步印證了血漿Aβ1-42/Aβ和Aβ1-40/Aβ對(duì)AD的良好診斷效能。

開發(fā)血漿中的AD生物診斷標(biāo)志物,不僅可以診斷早期AD和臨床表現(xiàn)不特異的AD,具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值和人群篩查價(jià)值,還可以監(jiān)測(cè)AD的疾病進(jìn)展情況,促進(jìn)治療手段的發(fā)展。在針對(duì)AD生物標(biāo)志物軌跡的研究中[26-27],發(fā)現(xiàn)Aβ水平的變化發(fā)生在Tau、NfL之前,說(shuō)明Aβ較其他AD生物標(biāo)志物更有早期診斷價(jià)值。但是對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病而言,開發(fā)基于血漿檢測(cè)的生物標(biāo)志物仍存在很多困難,如血腦屏障使得血漿中生物標(biāo)志物的水平遠(yuǎn)低于腦脊液[28],導(dǎo)致檢測(cè)的靈敏度降低;Aβ在血漿中與多種蛋白結(jié)合[29],導(dǎo)致檢測(cè)的特異度降低。但在本文中,血漿Aβ1-42及相關(guān)比值顯示出了對(duì)于AD良好的診斷效能,為開發(fā)基于血漿檢測(cè)的AD生物標(biāo)志物打下了一定的基礎(chǔ)。本研究的局限性在于樣本來(lái)自單中心,具有一定的選擇偏差,因此下一步筆者將收集更多醫(yī)療中心的患者血樣,擴(kuò)大樣本量進(jìn)行檢測(cè),并設(shè)計(jì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。