DOK6、TBC1D16聯(lián)合檢測(cè)對(duì)急性髓系白血病患者的化療敏感性和預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值*

呂曉偉,肖燕杰,李 琳,董華麗,焉兆玥,王 超

1.淄博市第一醫(yī)院血液科,山東淄博 255200;2.臨沂市人民醫(yī)院血液內(nèi)科,山東臨沂 276000

急性髓系白血病(AML)是一種惡性血液疾病,以造血干細(xì)胞不受控制的增殖為特征[1]。目前,阿糖胞苷(Ara-C)和蒽環(huán)類藥物,如米托蒽醌(MIT)仍然是幾十年來AML初始治療的主要手段[2]。然而,60%的患者在達(dá)到完全緩解后會(huì)復(fù)發(fā)并進(jìn)展為難治性AML[3]。由化療抵抗引起的最小殘留病(MRD)是導(dǎo)致AML復(fù)發(fā)和不良預(yù)后的主要原因之一[4]。因此,識(shí)別可能影響藥物反應(yīng)和預(yù)后的AML患者的風(fēng)險(xiǎn)因素是治療的關(guān)鍵手段。有研究發(fā)現(xiàn)[5],酪氨酸蛋白激酶6下游(DOK6)的表達(dá)水平和啟動(dòng)子高甲基化水平在AML患者中可以作為一個(gè)獨(dú)立的、綜合的預(yù)后生物標(biāo)志物。同時(shí),LIU 等[6]發(fā)現(xiàn)TBC1D16是成人AML患者化療敏感性和預(yù)后的一個(gè)潛在預(yù)測(cè)因子。然而,單個(gè)標(biāo)志物的檢測(cè)具有低靈敏度和低特異度的弊端?；诖?本研究旨在探討DOK6、TBC1D16聯(lián)合檢測(cè)對(duì)AML患者的化療敏感性和預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2015年4月至2018年4月淄博市第一醫(yī)院(下稱本院)收治的AML患者152例。其中,M0型2例,M1型8例,M2型70例,M3型6例,M4型36例,M5型30例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)參照世界衛(wèi)生組織造血和淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)(2008年版)相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];(2)未接受任何治療,包括放療、化療、靶向治療或內(nèi)分泌治療;(3)患者無血液系統(tǒng)疾病者;(4)患者自愿簽署知情同意書。 排除標(biāo)準(zhǔn):(1)AML復(fù)治者;(2)明確有中樞神經(jīng)系統(tǒng)侵犯者;(3)患有其他腫瘤者;(4)心、肝、腎等機(jī)體主要器官功能障礙者;(5)嚴(yán)重感染者;(6)具有自身免疫系統(tǒng)疾病史者。納入的AML病例中無伴重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常和特殊分類的AML病例?；熐安杉疉ML患者骨髓和/或外周靜脈血,分離單核細(xì)胞。所有AML患者均接受類似的阿糖胞苷誘導(dǎo)和鞏固治療方案。所有患者都接受了“7+3”誘導(dǎo)方案,包括Ara-C(100～200 mg/m2,第1～7天)和蒽環(huán)類藥物(米托蒽醌8～16 mg/m2,或柔紅霉素45～60 mg/m2,或阿柔紅霉素20 mg/m2,或吡柔紅霉素30 mg/m2,或去柔紅霉素10～20 mg/m2,第1～3天)。AML患者完全緩解的標(biāo)準(zhǔn)是按照國(guó)際推薦標(biāo)準(zhǔn)定義的:骨髓中細(xì)胞數(shù)量<5%;無髓外疾病;中性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)>1×109/L,血小板計(jì)數(shù)≥100×109/L。同時(shí),納入同時(shí)期于本院體檢的健康志愿者99例為健康對(duì)照組,并以相同方式分離志愿者的單核細(xì)胞。本研究獲得了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。在入組前,從每位參與者獲得書面知情同意,包括與研究人員共享遺傳信息。

1.2隨訪 通過查閱醫(yī)院電子病歷和定期電話隨訪,獲取患者的臨床資料和預(yù)后信息。臨床資料主要包括患者年齡、性別、血常規(guī)檢查、危險(xiǎn)分層、化療方案、分子特征。以總生存期(OS)作為預(yù)后指標(biāo)。復(fù)發(fā)定義為骨髓中存在> 5%的母細(xì)胞或外周血中出現(xiàn)母細(xì)胞或發(fā)生髓外疾病。OS從AML診斷之日起計(jì)算至因任何原因死亡之日。隨訪截止日期為2023年4月30日。

1.3DOK6和TBC1D16表達(dá)水平和甲基化水平的檢測(cè) 使用Trizol試劑從預(yù)提取的骨髓單核細(xì)胞中分離總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)由10 mmol/L 脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、5×10 mmol/L緩沖液、80 U RNAsin、10 μmol/L隨機(jī)六聚體和200 U MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶組成,反應(yīng)體積為40 μL。反應(yīng)條件在25 ℃下孵育10 min,42 ℃下孵育60 min,然后在-20 ℃下保存。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)方法對(duì)AML標(biāo)本中的DOK6和TBC1D16基因表達(dá)進(jìn)行分析。使用基因組DNA純化試劑盒分離AML患者的基因組DNA。使用CpGenome DNA修飾試劑盒根據(jù)制造商的建議修改基因組DNA。用于SYBR Premix Ex TaqII 的甲基化引物檢測(cè)DOK6或TBC1D16的甲基化狀態(tài)。反應(yīng)條件為95 ℃持續(xù)30 s,95 ℃持續(xù)5 s,62 ℃持續(xù)30 s,72 ℃持續(xù)30 s,78 ℃持續(xù)32 s。DNA亞硫酸氫鹽修飾使用CpGenomeTMDNA修飾試劑盒進(jìn)行。使用與DOK6或TBC1D16表達(dá)水平相同的模型計(jì)算DOK6或TBC1D16甲基化的定量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0和GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Fisher精確檢驗(yàn)用于比較兩組分類變量。兩組比較采用t檢驗(yàn)。使用Kaplan-Meier分析和COX回歸模型(單因素和多因素分析)評(píng)估DOK6或TBC1D16表達(dá)水平或甲基化對(duì)OS的影響。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1DOK6、TBC1D16不同表達(dá)水平AML患者的臨床和分子特征比較 AML的臨床和分子特征如表1所示,在DOK6低表達(dá)或高表達(dá)的AML患者中,相比于DOK6低表達(dá),DOK6高表達(dá)的AML患者固有核型分類的不良風(fēng)險(xiǎn)更高、未完全緩解比例更低(P<0.05);在TBC1D16低表達(dá)或高表達(dá)的AML患者中,相比于TBC1D16低表達(dá),TBC1D16高表達(dá)的AML患者固有核型分類的不良風(fēng)險(xiǎn)更高、未完全緩解比例更低(P<0.05),見表1。

表1 DOK6、TBC1D16不同表達(dá)水平AML患者的臨床和分子特征比較或n(%)]

2.2未完全化緩解和完全緩解AML患者DOK6、TBC1D16表達(dá)水平和甲基化水平 DOK6在啟動(dòng)子區(qū)域存在甲基化位點(diǎn),而TBC1D16在3′-UTR存在甲基化位點(diǎn),見圖1。相比于未完全緩解的AML患者,完全緩解的AML患者具有更高的DOK6和TBC1D16表達(dá)水平、更高的TBC1D16甲基化水平和較低的DOK6甲基化表達(dá)水平(P<0.05),見表2。相比于健康對(duì)照組,AML組具有更高的DOK6、TBC1D16表達(dá)水平、更高的TBC1D16甲基化表達(dá)水平和較低的DOK6甲基化表達(dá)水平(P<0.05),見表3。

圖1 DOK6和TBC1D16的甲基化位點(diǎn)

表2 未完全化緩解和完全緩解AML患者DOK6、TBC1D16表達(dá)水平和甲基化水平

表3 健康對(duì)照組與AML組DOK6、TBC1D16表達(dá)水平和甲基化水平

2.3AML患者中DOK6、TBC1D16表達(dá)水平和甲基化水平的相關(guān)性 AML患者中DOK6的表達(dá)水平與TBC1D16表達(dá)水平(r=0.484,P<0.05)和TBC1D16甲基化水平(r=0.262,P<0.05)呈正相關(guān),與DOK6甲基化水平(r=-0.651,P<0.05)呈負(fù)相關(guān)(r=0.573,P<0.05);TBC1D16表達(dá)水平與TBC1D16甲基化水平呈正相關(guān)(r=-0.279,P<0.05),與DOK6甲基化水平呈負(fù)相關(guān);DOK6甲基化水平與TBC1D16甲基化水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.183,P<0.05)。

2.4TBC1D16 、DOK6表達(dá)水平與AML的OS的單因素和多因素COX回歸分析 相比于DOK6低表達(dá)的AML患者,DOK6高表達(dá)的AML患者的OS更低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);相比于TBC1D16低表達(dá)的AML患者,TBC1D16高表達(dá)的AML患者的OS更低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);相比于DOK6低甲基化的AML患者,DOK6高甲基化的AML患者的OS更高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);相比于TBC1D16低甲基化的AML患者,TBC1D16高甲基化的AML患者的OS更低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí),TBC1D16和DOK6同時(shí)高表達(dá)的AML患者的OS更低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);TBC1D16高甲基化和DOK6低甲基化的AML患者的OS更低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。單因素和多因素分析發(fā)現(xiàn)TBC1D16 或DOK6表達(dá)越高,AML的OS越差,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表4。

圖2 TBC1D16 或DOK6表達(dá)水平和甲基化水平與AML的OS

表4 TBC1D16 、DOK6表達(dá)水平與AML的OS的多因素COX回歸分析

2.5DOK6、TBC1D16對(duì)AML患者化療敏感性的預(yù)測(cè)分析 為了評(píng)估DOK6或TBC1D16對(duì)AML患者化療敏感性的預(yù)測(cè)價(jià)值,繪制54例未緩解AML患者和45例緩解AML患者的受試者工作特征(ROC)曲線。DOK6的ROC曲線的曲線下面積(AUC)為0.94(95%CI:0.824～0.988),以DOK6的預(yù)測(cè)最佳截?cái)嘀禐?.469,其診斷靈敏度為96.98%,特異度為98.47%;TBC1D16的ROC曲線的AUC為0.95(95%CI:0.857～0.993),以TBC1D16的預(yù)測(cè)最佳截?cái)嘀禐?.265,其診斷靈敏度為98.32%,特異度為97.59%。AML未緩解為化療不敏感,AML緩解為化療敏感。以DOK6和TBC1D16預(yù)測(cè)最佳截?cái)嘀禐樵\斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測(cè),二者滿足其一者為聯(lián)合預(yù)測(cè)化療敏感,反之則為聯(lián)合預(yù)測(cè)化療不敏感。DOK6和TBC1616聯(lián)合檢測(cè)對(duì)AML患者化療敏感性預(yù)測(cè)的靈敏度為97.10%(67/69),特異度為96.39%(80/83),準(zhǔn)確度為96.71%(147/152)。見圖3、表5、6。

圖3 DOK6或TBC1D16對(duì)AML患者化療敏感性預(yù)測(cè)的ROC曲線

表5 DOK6或TBC1D16對(duì)AML患者化療敏感性預(yù)測(cè)的AUC、靈敏度和特異度

表6 DOK6與TBC1D16聯(lián)合檢測(cè)對(duì)預(yù)測(cè)AML患者的化療敏感性(n)

3 討 論

本研究通過分析未完全緩解和完全緩解的AML患者化療前單核細(xì)胞的DOK6、TBC1D16的表達(dá)水平以及其與預(yù)后的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)DOK6、TBC1D16單向預(yù)測(cè)AML患者化療敏感性的靈敏度分別為96.98%和98.32%、特異度分別為98.47%和97.59%。WU等[8]通過外周血單個(gè)miR-132預(yù)測(cè)AML預(yù)后的靈敏度為90.36%,特異度為85.56%。在本研究中,DOK6和TBC1616聯(lián)合檢測(cè)對(duì)AML患者化療敏感性預(yù)測(cè)的靈敏度為97.10%,特異度為96.39%,準(zhǔn)確度為96.71%,具有較好的預(yù)測(cè)效能。

在本研究中,DOK6高表達(dá)的AML患者的OS更低(P<0.05)。DOK6作為一種具有多個(gè)信號(hào)蛋白對(duì)接位點(diǎn)的適配器,可以與多種信號(hào)通路的不同步驟中的不同成分結(jié)合,如血小板衍生生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子受體、大鼠內(nèi)瘤蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和RAF/MAP激酶。重要的是,它們大多已被證實(shí)是胃癌的致癌蛋白和不良預(yù)后因素[8]。有研究表明[9-10],DOK6通過與多種不同的信號(hào)蛋白和受體相互作用,增強(qiáng)了許多致癌信號(hào)通路。因此,隨著DOK6表達(dá)水平的增高,必然會(huì)影響多種致癌信號(hào)通路,這不利于AML患者的預(yù)后。

近年來,TBC1D16甲基化和表達(dá)水平在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的臨床意義引起了人們的關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)[11],TBC1D可能是黑色素瘤轉(zhuǎn)移的潛在外源性驅(qū)動(dòng)因子,基因體的低甲基化導(dǎo)致TBC1D16轉(zhuǎn)錄的激活,促進(jìn)黑色素瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。此外,TBC1D16蛋白在上皮性卵巢癌(EOC)中表達(dá)增加,尤其是在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子低表達(dá)的EOC標(biāo)本中[12]。本研究發(fā)現(xiàn)TBC1D16高表達(dá)的AML患者固有核型分類的不良風(fēng)險(xiǎn)更高、未完全緩解比例更低(P<0.05)。因此,TBC1D16作為特異性AML預(yù)后生物標(biāo)志物,有助于開發(fā)新的治療策略和治療反應(yīng)預(yù)測(cè)。

作為研究最多的表觀遺傳改變,DNA甲基化參與了多種調(diào)控過程,如基因組完整性、印跡缺失、基因組完整性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等[11]。相比于完全緩解的AML患者,未完全緩解的AML患者DOK6的甲基化水平更低、TBC1D16的甲基化水平更高。由于啟動(dòng)子中的DNA甲基化對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)大影響,已被廣泛接受為基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控[13-14]。這些CpG島含有甲基化敏感轉(zhuǎn)錄因子(如CTCF)的結(jié)合位點(diǎn),導(dǎo)致基因表達(dá)增加或減少。通過JASPAR數(shù)據(jù)庫,本文發(fā)現(xiàn)CTCF轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合在TBC1D16甲基化位點(diǎn)上游為141～159 bp,因此推測(cè)TBC1D16 3’-UTR的高甲基化可能通過抑制CTCF的結(jié)合而影響基因表達(dá)。

綜上所述,單核細(xì)胞中DOK6和TBC1D16聯(lián)合檢測(cè)可作為AML患者化療敏感性和預(yù)后的潛在預(yù)測(cè)因子。