基于MAPK/NF-κB 通路探究苦參堿對酒精性脂肪性肝炎大鼠的影響

黃 丹，周素芳，蔡 金，張淇華，王 毅，張?zhí)┪?/p>

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)經(jīng)典科，貴州 貴陽 550001； 2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)微生態(tài)研究中心，貴州 貴陽 550001）

酒精性脂肪性肝炎 （alcoholic fatty liver disease，AFLD） 是一種因長期大量飲酒引起的肝臟疾病，可能導(dǎo)致非常嚴(yán)重的健康問題，如肝硬化、肝癌等［1］。炎癥、脂質(zhì)沉積、肝細(xì)胞凋亡等因素促進(jìn)了AFLD 的發(fā)展［2］。目前，限制飲酒仍然是最有效的治療AFLD 的方法，而直接治療AFLD 的有效藥物很少［3］。因此，迫切需要開發(fā)新的有效藥物來治療AFLD?？鄥A是從苦參中提取的生物活性成分，其具有治療慢性肝病、抗病毒、抗炎等作用，而不會(huì)引起明顯的毒性或副作用［4］。已有研究報(bào)道，苦參堿可減輕肝組織病理損傷，進(jìn)而對非酒精性脂肪性肝炎大鼠發(fā)揮保護(hù)作用［5］。而苦參堿對AFLD 大鼠炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)沉積、肝細(xì)胞凋亡的影響尚不明確。相關(guān)研究顯示，抑制絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK） /核轉(zhuǎn)錄因子κB （nuclear factor kappa B，NF-κB） 通路可改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠炎癥反應(yīng)［6］。而苦參堿能否通過調(diào)控MAPK/NF-κB 通路抑制AFLD 大鼠炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)沉積、肝細(xì)胞凋亡尚不可知。因此，本研究主要探究苦參堿對AFLD 大鼠炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)沉積、肝細(xì)胞凋亡的影響以及其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 8 周齡雄性SD 大鼠144 只，體質(zhì)量310 ～320 g，均購自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （渝） 2022-0002］，飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK （黔）2021-0005］，且所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲得貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)20210003）。

1.2 試劑與藥物 苦參堿（規(guī)格5 g，批號(hào)20220506）、TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號(hào)20220209） 購自北京伊塔生物科技有限公司； 強(qiáng)肝膠囊（批號(hào)20211213） 購自石家莊東方藥業(yè)股份有限公司； MAPK 激動(dòng)劑Anisomycin（批號(hào)20211125） 購自武漢博歐特生物科技有限公司。谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST） （批號(hào)20221003）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase，ALT） （批號(hào)20220925） 檢測試劑盒均購自上海晶抗生物工程有限公司；白細(xì)胞介素（interleukin，IL） -1β （批號(hào)20221114）、IL-6（批號(hào)20220306）、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor α，TNF-α） （批號(hào)20220806） ELISA 試劑盒均購自伊艾博（武漢） 科技股份有限公司； 油紅O 溶液（批號(hào)20211228）購自浙江麥飛生物科技有限公司； 兔源一抗甲狀腺激素反應(yīng)基因（thyroid hormone response gene，THRSP）（批號(hào)ab156982）、BCL2 相關(guān)X 蛋白（BCL2-associated X protein，Bax）（批號(hào)ab32503）、應(yīng)激活化蛋白激酶 （c-Jun Nterminal kinase，JNK） （批號(hào)ab112501）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2 （extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2） （批號(hào)ab184699）、p38 （批號(hào)ab59461）、NF-κB p65（批號(hào)ab239882）、p-JNK （批號(hào) ab131499）、p-ERK1/2（批號(hào)ab126445）、p-p38 （批號(hào)ab4822）、p-NF-κB p65（批號(hào)ab239882）、GAPDH （批號(hào)ab8245）、辣根過氧化物酶（HRP） 標(biāo)記的羊抗兔二抗（批號(hào)ab289875） 均購自英國Abcam 公司。

2 方法

2.1 AFLD 大鼠模型的構(gòu)建及分組 給予大鼠正常飲食8周，按照每天15 mL/kg 的劑量灌胃給予40% 乙醇，構(gòu)建AFLD 模型［7］。按照隨機(jī)數(shù)字表法將SD 大鼠隨機(jī)分為對照組，模型組，苦參堿低、中、高劑量組，強(qiáng)肝膠囊組，Anisomycin 組，苦參堿+Anisomycin 組，每組18 只。除對照組大鼠給予正常飲食且灌胃等體積的生理鹽水外，其余各組大鼠均構(gòu)建AFLD 大鼠模型。建模成功后，苦參堿低、中、高劑量組和強(qiáng)肝膠囊組大鼠分別灌胃給予22.22、44.44、66.66 mg/kg 苦參堿［8］及0.35 g/kg 強(qiáng)肝膠囊［9］，且腹腔注射等體積生理鹽水； Anisomycin 組［10］大鼠腹腔注射10 μL 5 μmol/L Anisomycin，且灌胃給予等量生理鹽水；苦參堿+Anisomycin 組大鼠灌胃66.66 mg/kg 苦參堿且腹腔注射10 μL 5 μmol/L Anisomycin； 對照組和模型組大鼠均灌胃等量生理鹽水，且腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次，持續(xù)6 周。

2.2 標(biāo)本收集 末次處理24 h 后，麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，離心，血清用于AST、ALT、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的檢測； 血清收集完畢后，2%戊巴比妥鈉麻醉并處死大鼠，收集大鼠肝臟組織，將肝臟組織分為3 份（每份包含每組6 只大鼠的肝臟組織），一份固定于4%多聚甲醛中用于HE、TUNEL 染色，一份凍存于-80 ℃中用于蛋白表達(dá)的檢測，一份制作冰凍切片用于油紅O 染色。

2.3 血清AST、ALT、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平檢測 嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說明書檢測大鼠血清AST、ALT、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。

2.4 HE 染色觀察大鼠肝組織病理變化 肝組織在4% 多聚甲醛中固定過夜后，脫水并包埋在石蠟中，將包埋的肝組織切成5 μm 的薄片，切片經(jīng)脫石蠟、再水化后行HE 染色，于BX51 顯微鏡下觀察肝臟組織病理變化。

2.5 油紅O 染色觀察大鼠肝臟脂質(zhì)沉積情況 將制備的冷凍肝組織切片在丙二醇中室溫孵育2 min，油紅O 溶液染色5 min，在85%丙二醇水溶液中進(jìn)行調(diào)色，漂洗2 次并用蘇木精染色1 min，沖洗后，于BX51 顯微鏡下對染色的組織進(jìn)行觀察。通過Image Pro Plus 6.0 軟件評(píng)估油紅O 染色吸光度值。

2.6 TUNEL 染色檢測大鼠肝組織凋亡情況 將肝組織切片與TUNEL 試劑在37 ℃下避光孵育1 h。洗滌后用DAPI染色，于熒光顯微鏡下對切片進(jìn)行觀察。

2.7 Western blot 法檢測大鼠肝組織THRSP、Bax、p-p38、p-JNK、p-ERK1/2、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá) 使用RIPA 緩沖液在冰上裂解肝組織30 min，提取總蛋白，BCA 法檢測總蛋白濃度。將蛋白樣本經(jīng)SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，將PVDF 膜與一抗THRSP、Bax、p-p38、p-JNK、p-ERK1/2、p-NF-κB p65、p38、JNK、ERK1/2、NF-κB p65、GAPDH 在4 ℃下孵育過夜，加入對應(yīng)二抗在室溫下孵育1 h。通過Image Lab 5.0 軟件測量蛋白條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩差異比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 苦參堿對AFLD 大鼠血清AST、ALT 水平的影響 表1 顯示，與對照組比較，模型組大鼠血清AST、ALT 水平升高（P＜0.05）； 與模型組比較，苦參堿各劑量組和強(qiáng)肝膠囊組大鼠血清AST、ALT 水平降低（P＜0.05），且苦參堿的作用呈劑量依賴性，Anisomycin 組大鼠血清AST、ALT 水平升高（P＜0.05）； 與苦參堿高劑量組比較，苦參堿+Anisomycin 組大鼠血清AST、ALT 水平升高 （P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清AST、ALT 水平比較（U/L，±s，n＝18）

表1 各組大鼠血清AST、ALT 水平比較（U/L，±s，n＝18）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與苦參堿高劑量組比較，△P＜0.05。

組別ASTALT對照組33.52±1.6725.54±1.13模型組94.43±4.15*73.36±3.27*苦參堿低劑量組82.27±3.69＃62.28±3.14?？鄥A中劑量組65.58±3.11＃49.66±2.75＃苦參堿高劑量組46.67±2.25＃36.62±1.74＃強(qiáng)肝膠囊組47.73±2.34＃37.73±1.69＃Anisomycin 組123.35±6.04＃86.88±3.78?？鄥A+Anisomycin 組76.69±3.44△55.45±2.63△

3.2 苦參堿對AFLD 大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響 表2 顯示，與對照組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05）； 與模型組比較，苦參堿各劑量組和強(qiáng)肝膠囊組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平降低 （P＜0.05），且苦參堿的作用呈劑量依賴性，Anisomycin 組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05）； 與苦參堿高劑量組比較，苦參堿+Anisomycin 組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較（pg/mL，±s，n＝18）

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較（pg/mL，±s，n＝18）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與苦參堿高劑量組比較，△P＜0.05。

組別IL-1βIL-6TNF-α對照組81.15±3.5442.27±1.7931.15±1.87模型組357.72±15.59*161.28±7.33*205.58±11.34*苦參堿低劑量組303.42±12.28＃123.36±4.59＃169.65±7.33＃苦參堿中劑量組216.65±10.14＃94.45±3.86＃103.67±4.88?？鄥A高劑量組123.34±5.77＃57.78±2.63＃59.84±2.54＃強(qiáng)肝膠囊組125.03±5.69＃58.85±2.53＃60.62±3.01＃Anisomycin 組429.96±18.82＃219.94±10.34＃264.45±12.26?？鄥A+Anisomycin 組255.67±10.36△115.52±4.66△138.39±6.18△

3.3 苦參堿對AFLD 大鼠肝組織病理變化的影響 圖1 顯示，對照組肝臟結(jié)構(gòu)正常，無病理征象； 模型組肝組織呈現(xiàn)明顯的脂肪變性，主要表現(xiàn)為脂肪滴增多，肝細(xì)胞變大，且存在大量炎性細(xì)胞浸潤； 與模型組比較，苦參堿各劑量組和強(qiáng)肝膠囊組肝組織脂肪變性程度有不同程度減輕，Anisomycin 組大鼠肝組織脂肪變性程度加重； 與苦參堿高劑量組比較，苦參堿+Anisomycin 組大鼠肝組織脂肪變性程度加重。

圖1 各組大鼠肝組織HE 染色（×200）

3.4 苦參堿對AFLD 大鼠肝臟脂質(zhì)沉積的影響 圖2、表3顯示，與對照組比較，模型組大鼠油紅O 染色面積增加，吸光度值升高（P＜0.05），表明肝組織脂質(zhì)沉積加??； 與模型組比較，苦參堿各劑量組和強(qiáng)肝膠囊組大鼠油紅O 染色面積有不同程度減少，吸光度值降低（P＜0.05），表明肝組織脂質(zhì)沉積減輕，且苦參堿的作用呈劑量依賴性，Anisomycin 組大鼠油紅O 染色面積增加，吸光度值升高（P＜0.05）； 與苦參堿高劑量組比較，苦參堿+Anisomycin組大鼠油紅O 染色面積增加，吸光度值升高（P＜0.05）。

圖2 大鼠肝組織油紅O 染色（×200）

表3 各組大鼠油紅O 染色吸光度值比較（±s，n＝6）

表3 各組大鼠油紅O 染色吸光度值比較（±s，n＝6）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與苦參堿高劑量組比較，△P＜0.05。

組別油紅O 染色吸光度值對照組0.003±0.001模型組0.310±0.020*苦參堿低劑量組0.260±0.010?？鄥A中劑量組0.180±0.010?？鄥A高劑量組0.100±0.010＃強(qiáng)肝膠囊組0.110±0.020＃Anisomycin 組0.370±0.020?？鄥A+Anisomycin 組0.220±0.010△

3.5 苦參堿對AFLD 大鼠肝組織細(xì)胞凋亡的影響 圖3、表4 顯示，與對照組比較，模型組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）； 與模型組比較，苦參堿各劑量組和強(qiáng)肝膠囊組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），且苦參堿的作用呈劑量依賴性，Anisomycin 組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡率升高 （P＜0.05）； 與苦參堿高劑量組比較，苦參堿+Anisomycin 組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。

圖3 大鼠肝組織細(xì)胞凋亡TUNEL 染色（×200）

表4 各組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡率比較（±s，n＝6）

表4 各組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡率比較（±s，n＝6）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與苦參堿高劑量組比較，△P＜0.05。

組別細(xì)胞凋亡率/%對照組3.25±0.12模型組20.53±0.54*苦參堿低劑量組16.64±0.62＃苦參堿中劑量組11.45±0.53?？鄥A高劑量組6.72±0.31＃強(qiáng)肝膠囊組6.79±0.28＃Anisomycin 組27.72±1.24＃苦參堿+Anisomycin 組13.35±0.53△

3.6 苦參堿對AFLD 大鼠肝組織THRSP、Bax 及MAPK/NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 圖4、表5 顯示，與對照組比較，模型組大鼠肝組織THRSP、Bax、p-p38、p-JNK、p-ERK1/2、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）； 與模型組比較，苦參堿各劑量組和強(qiáng)肝膠囊組大鼠肝組織THRSP、Bax、p-p38、p-JNK、p-ERK1/2、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），且苦參堿的作用呈劑量依賴性，Anisomycin組THRSP、Bax、p-p38、p-JNK、p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）； 與苦參堿高劑量組比較，苦參堿+Anisomycin 組大鼠肝組織THRSP、Bax、p-p38、p-JNK、p-ERK1/2、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠肝組織THRSP、Bax、p-p38、p-JNK、p-ERK1/2、p-NF-κB p65 蛋白條帶圖

表5 各組大鼠肝組織THRSP、Bax 及MAPK/NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s，n＝6）

表5 各組大鼠肝組織THRSP、Bax 及MAPK/NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s，n＝6）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與苦參堿高劑量組比較，△P＜0.05。

組別THRSP/GAPDHBax/GAPDHp-p38/p38p-JNK/JNKp-ERK1/2/ERK1/2p-NF-κB p65/NF-κB p65對照組0.52±0.040.34±0.030.42±0.030.33±0.030.24±0.020.11±0.01模型組1.52±0.13*1.28±0.11*0.86±0.03* 0.74±0.06*0.69±0.06*0.78±0.06*苦參堿低劑量組1.24±0.11＃1.05±0.10＃0.72±0.06＃0.65±0.06＃0.57±0.05＃0.65±0.05?？鄥A中劑量組1.01±0.08＃0.78±0.08＃0.63±0.05＃0.57±0.05＃0.41±0.05＃0.57±0.05?？鄥A高劑量組0.68±0.06＃0.46±0.04＃0.55±0.05＃0.42±0.04＃0.33±0.04＃0.26±0.02＃強(qiáng)肝膠囊組0.70±0.05＃0.45±0.05＃0.56±0.05＃0.43±0.05＃0.34±0.03＃0.27±0.03＃Anisomycin 組1.83±0.25＃1.68±0.21＃0.94±0.05＃0.88±0.07＃0.85±0.07＃0.93±0.08?？鄥A+Anisomycin 組1.17±0.12△0.83±0.07△0.68±0.06△ 0.60±0.06△0.44±0.04△0.61±0.05△

4 討論

過量飲酒會(huì)導(dǎo)致代謝紊亂、肝臟脂質(zhì)沉積和炎癥，最終導(dǎo)致AFLD 的發(fā)展［11］。AST、ALT 是目前最常用的肝功能檢測指標(biāo)，其升高的程度與肝細(xì)胞受損的程度成正比［12］； 酒精可引起促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的分泌，進(jìn)而加重肝損傷［13］； 飲酒會(huì)增加脂肪酸的攝取和脂肪生成，并減少脂肪酸氧化，從而導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積，THRSP 是一種重要的脂肪生成基因，它調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞和肝臟中脂肪的生成，促進(jìn)脂肪堆積［14-15］； 此外，肝細(xì)胞凋亡參與了AFLD 的進(jìn)展，Bax 作為細(xì)胞凋亡相關(guān)標(biāo)記物，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用［16-17］。本研究成功誘導(dǎo)建立AFLD 大鼠模型，結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠肝功能異常、存在炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)沉積及肝細(xì)胞大量凋亡等現(xiàn)象。提示開發(fā)能夠抑制炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)沉積及肝細(xì)胞大量凋亡的藥物可能是治療AFLD 的有效策略之一。

苦參堿是一種天然存在的生物堿，是苦參和山豆根等中草藥的生物活性成分，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗纖維化、保肝等特性［18］?？鄥A注射液可以改善肝功能，進(jìn)而對急性酒精性肝損傷小鼠發(fā)揮保護(hù)作用［19］； 苦參堿可抑制硫代乙酰胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，改善其肝功能［20］。本研究顯示，苦參堿可改善AFLD 大鼠肝功能，抑制炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)沉積及肝細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性。強(qiáng)肝膠囊是一種能夠改善慢性肝炎的中成藥，本研究以此作為陽性藥物，結(jié)果顯示苦參堿高劑量組與強(qiáng)肝膠囊組對應(yīng)指標(biāo)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示苦參堿有可能成為治療AFLD 的潛在有效藥物。

MAPK 通路的激活涉及p38、ERK1/2 和JNK 的磷酸化。多項(xiàng)研究表明，MAPK 信號(hào)通路參與了NF-κB 的激活［21-22］。最新研究顯示，抑制MAPK/NF-κB 通路可保護(hù)小鼠肝臟免受缺血/再灌注損傷［23］； 抑制MAPK/NF-κB 通路可改善對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷［24］。本研究顯示，與模型組比較，Anisomycin 組MAPK/NF-κB 通路蛋白表達(dá)升高，大鼠炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)沉積、肝細(xì)胞凋亡及肝組織病理損傷加劇，表明MAPK/NF-κB 信號(hào)通路確實(shí)參與了AFLD 的進(jìn)展。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，苦參堿可呈劑量依賴性地抑制p-p38、p-JNK、p-ERK1/2、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)，推測苦參堿可能通過抑制MAPK/NF-κB 信號(hào)通路抑制AFLD 大鼠炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)沉積及肝細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證該推測，本研究在高劑量苦參堿作用的基礎(chǔ)上給予MAPK 激動(dòng)劑Anisomycin 干預(yù)AFLD 大鼠，結(jié)果顯示Anisomycin 減弱了高劑量苦參堿對AFLD 大鼠炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)沉積及肝細(xì)胞凋亡的抑制作用。

綜上所述，苦參堿可能通過抑制MAPK/NF-κB 信號(hào)通路抑制AFLD 大鼠炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)沉積及肝細(xì)胞凋亡?？鄥A對AFLD 大鼠的保護(hù)作用可能還涉及其他通路，本研究尚未探討，這是本研究的不足之處，后期將會(huì)進(jìn)一步深入探究。