UPLC 法結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析及化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地枳殼質(zhì)量

屈彬清，劉隆基，楊婧瀟，羅 堃，王元清，劉瑞連，3*，嚴(yán)建業(yè)，4*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410208； 2.中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004； 3.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410006； 4.湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

枳殼為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)，具有理氣寬中、行滯消脹的功效［1］，主要栽培于江西、四川、湖南等?。?］。現(xiàn)代研究表明，枳殼主要含有黃酮類、香豆素、揮發(fā)油類、生物堿等成分［3］。以柚皮苷、新橙皮苷為代表的二氫黃酮化合物具有抗氧化、抗炎抑菌、改善腸胃動(dòng)力障礙［4］等作用； 枳殼中檸檬烯等揮發(fā)油類具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤等作用［5］； 枳殼中香豆素類成分對(duì)調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)的乙酰膽堿酯酶有抑制作用［6］。2020 年版 《中國(guó)藥典》 僅以柚皮苷、新橙皮苷的含量來控制枳殼的質(zhì)量，不能反映其質(zhì)量的全貌，有待進(jìn)一步完善。

枳殼的含量測(cè)定多用HPLC 法［7-9］，該方法耗時(shí)長(zhǎng)靈敏度較低，而UPLC 法具有更高的柱效，能大大縮短分析時(shí)間?；疑P(guān)聯(lián)度分析法是根據(jù)因素之間發(fā)展趨勢(shì)的相似或相異程度，衡量因素間關(guān)聯(lián)程度的一種方法［10］，可充分利用較少的原始數(shù)據(jù)去挖掘規(guī)律，作為模糊系統(tǒng)研究手段已應(yīng)用于中藥藥效評(píng)價(jià)［11］、炮制對(duì)譜效關(guān)系的影響研究［12-13］及不同產(chǎn)地和商品規(guī)格藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)［14］等。化學(xué)計(jì)量學(xué)是利用數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法系統(tǒng)研究化學(xué)測(cè)量值內(nèi)涵的科學(xué)［15］。本實(shí)驗(yàn)首次將UPLC 法和灰色關(guān)聯(lián)度分析、化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合起來對(duì)不同產(chǎn)地枳殼進(jìn)行綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)，以期為客觀評(píng)價(jià)與控制枳殼的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters ACQUITY 超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）； XS205DU 十萬(wàn)分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； KQ5200DV 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； Option R7 utra AN 超純水系統(tǒng) （英國(guó)ELGA LabWater公司）。

1.2 試劑與藥物 蕓香柚皮苷 （批號(hào)MUST-16030408）、川陳皮素（批號(hào)MUST-16070901） 對(duì)照品均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司； 柚皮苷（批號(hào) 10552-201301）、橙皮苷 （批號(hào) 10089-201203）、新橙皮苷（批號(hào)10477-201203） 對(duì)照品均購(gòu)自南昌貝塔生物科技有限公司； 圣草次苷（批號(hào)13463-28-0）、新北美圣草苷（批號(hào)13241-32-2）、橙皮內(nèi)酯（批號(hào)23971-42-8）、枸橘苷（批號(hào)14941-08-3）、甜橙黃酮（批號(hào)2306-27-6）、桔皮素（批號(hào)481-53-8）、橙皮油素（批號(hào)495-02-3）對(duì)照品均購(gòu)自寶雞市辰光生物科技有限公司；純度≥98%。甲醇、乙腈為色譜純； 其余試劑均為分析純； 水為超純水。

21 批枳殼樣品來源信息見表1，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室龔力民副教授鑒定為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC ? BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）； 流動(dòng)相10%甲醇（A） -乙腈 （B），梯度洗脫 （0 ～5 min，82% ～75% A； 5 ～10 min，75% ～40% A； 10 ～11 min，40% ～5%A； 11～12 min，5%A； 12～16 min，5% ～82%A）； 體積流量0.5 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)（0 ～1.5 min，318 nm； 1.5 ～2.8 min，285 nm； 2.8～5 min，300 nm； 5 ～6 min，325 nm； 6 ～7.8 min，285 nm； 7.8 ～10.35 min，330 nm；10.35 ～10.8 min，290 nm； 10.8 ～16 min，325 nm）； 進(jìn)樣量2 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取各對(duì)照品適量，加甲醇稀釋成分別含圣草次苷9.75 μg/mL、新北美圣草苷22.50 μg/mL、蕓香柚皮苷108.00 μg/mL、柚皮苷450.00 μg/mL、橙皮苷32.12 μg/mL、新橙皮苷260.00 μg/mL、橙皮內(nèi)酯21.45 μg/mL、枸橘苷52.50 μg/mL、甜橙黃酮7.80 μg/mL、川陳皮素16.00 μg/mL、桔皮素15.75 μg/mL、橙皮油素6.30 μg/mL 的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取枳殼粗粉（過2 號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇40 mL，稱定質(zhì)量，超聲（200 W，40 kHz）提取45 min，取出，冷卻至室溫，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、空白溶劑適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰分離度理想，顯示了良好的專屬性。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密稱取圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯、枸橘苷、甜橙黃酮、川陳皮素、桔皮素、橙皮油素對(duì)照品適量，混勻，加入甲醇稀釋，得到一系列不同濃度的對(duì)照品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（S8），在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯、枸橘苷、甜橙黃酮、川陳皮素、桔皮素、橙皮油素峰面積RSD 分別為0.42%、0.18%、0.40%、0.42%、0.29%、0.43%、0.27%、0.26%、0.27%、0.30%、1.26%、0.22%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（S8），于0、2、4、6、8、10、12 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯、枸橘苷、甜橙黃酮、川陳皮素、桔皮素、橙皮油素峰面積RSD 分別為1.09%、0.66%、1.25%、0.49%、1.42%、0.25%、1.29%、2.81%、1.88%、2.75%、1.88%、2.82%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取枳殼粗粉6 份（S8），按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯、枸橘苷、甜橙黃酮、川陳皮素、桔皮素、橙皮油素含量RSD 分別為0.37%、0.23%、0.59%、0.44%、0.22%、0.15%、0.79%、0.93%、1.41%、1.23%、1.37%、1.40%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的枳殼粗粉6 份（S8），每份0.25 g，精密稱定質(zhì)量，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入各對(duì)照品溶液適量，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯、枸橘苷、甜橙黃酮、川陳皮素、桔皮素、橙皮油素平均加樣回收率 （RSD） 分別為98.38% （0.97%）、99.02%（0.49%）、99.38% （0.86%）、99.42% （1.20%）、98.94% （0.84%）、99.53% （0.73%）、98.91%（2.06%）、99.55% （1.81%）、99.31% （2.92%）、99.30% （2.72%）、98.34% （2.98%）、99.27%（2.96%）。

2.5 樣品含量測(cè)定 按“2.3” 項(xiàng)下方法制備21批枳殼藥材供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

2.6 灰色關(guān)聯(lián)度分析

2.6.1 樣品數(shù)據(jù)集的建立 以“2.5” 項(xiàng)下12 種成分為指標(biāo)性成分，建立枳殼藥材質(zhì)量灰色模式識(shí)別數(shù)據(jù)集，結(jié)果見表4。

表4 樣品數(shù)據(jù)集Tab.4 Samples datasets

2.6.2 原始數(shù)據(jù)規(guī)格化處理 設(shè)有n個(gè)樣品，每個(gè)樣品有m項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，即組成評(píng)價(jià)單元序列｛Xik｝ （i＝1，2，3，……，n；k＝1，2，3，……，m； 本實(shí)驗(yàn)中n＝21，m＝12）。由于評(píng)價(jià)指標(biāo)之間存在測(cè)試單位不統(tǒng)一的問題，因此，按照Yik＝Xik/Xk對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)格化處理，結(jié)果見表5。公式中Yik為規(guī)格化處理后的數(shù)據(jù)，Xik為原始數(shù)據(jù)，Xk為n個(gè)樣品第k個(gè)指標(biāo)的均值。

2.6.3 關(guān)聯(lián)度計(jì)算 用灰色關(guān)聯(lián)度進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)選擇其參考序列。設(shè)最優(yōu)參考序列和最差參考序列分別為｛Xsk｝ 和｛Xtk｝ （k＝1，2，3，……，m）。設(shè)最優(yōu)參考序列的各項(xiàng)指標(biāo)是n個(gè)樣品對(duì)應(yīng)指標(biāo)的最大值，即｛Xsk｝； 最差參考序列的各項(xiàng)指標(biāo)是n個(gè)樣品對(duì)應(yīng)指標(biāo)的最小值，即｛Xtk｝。按照Ysk＝Xsk/Xk、Ytk＝Xtk/Xk對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)格化處理。按照計(jì)算各評(píng)價(jià)單元序列相對(duì)最優(yōu)（差） 參考序列的差值，式中，Δmin＝min ｜Yik-Ysk｜，Δmax＝max ｜Yik-Ysk｜，ρ為分辨系數(shù)，一般取值 0.5。按照計(jì)算各評(píng)價(jià)單元相對(duì)于最優(yōu)（差） 參考序列的關(guān)聯(lián)度。評(píng)價(jià)單元序列同時(shí)相對(duì)于最優(yōu)參考序列和最差參考序列按照計(jì)算各樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度ri，并按ri大小排序，見表6。相對(duì)于最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)度ri（s）越大，同時(shí)相對(duì)于最差參考序列的關(guān)聯(lián)度ri（t）越小，則相對(duì)關(guān)聯(lián)度就越高，表明該評(píng)價(jià)單元序列越理想，為最佳評(píng)價(jià)單元； 根據(jù)相對(duì)關(guān)聯(lián)度的大小對(duì)評(píng)價(jià)單元序列進(jìn)行質(zhì)量排序，相對(duì)關(guān)聯(lián)度越高排序越靠前，說明樣品的質(zhì)量評(píng)價(jià)越高，ri排序結(jié)果可作為藥材質(zhì)量高低評(píng)價(jià)的依據(jù)。由表6 可知，關(guān)聯(lián)度排名前的樣品包括來源于湖南、四川、江西、重慶的樣品，說明這4 個(gè)產(chǎn)地的樣品質(zhì)量較好，這與湖南、四川、江西為枳殼的主產(chǎn)地及道地產(chǎn)區(qū)相吻合其中，S20（四川合江） 的相對(duì)關(guān)聯(lián)度最高，說明S20 在21批樣品中綜合質(zhì)量最好； 而S15 （安徽合肥） 相對(duì)關(guān)聯(lián)度最小，說明其綜合質(zhì)量差，說明產(chǎn)地因素對(duì)其有效成分綜合影響較大。關(guān)聯(lián)度排后的樣品不僅來源于浙江、安徽等地，還有產(chǎn)自湖南益陽(yáng)、江西九江、江西贛州、江西萍鄉(xiāng)的樣品，這說明同一省份不同地區(qū)的樣品質(zhì)量可能存在差異性。

表6 各樣品相對(duì)關(guān)聯(lián)度質(zhì)量?jī)?yōu)劣排序Tab.6 Results for sequencing quality of the samples

2.7 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.7.1 聚類分析 對(duì)21 批枳殼樣品采用SPSS 21.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行聚類分析，將21 批樣品的12 種成分含量作為變量，聚類方法為組間聯(lián)接，度量標(biāo)準(zhǔn)選擇歐式平方距離，結(jié)果見圖2。由此可知，當(dāng)類間距離范圍為20 ～25 時(shí)主要分為2 類，即S1～S9、S12、S14、S20 分為G1 組，S10 ～S11、S13、S15～S19、S21 為G2 組。

圖2 聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrograms of hierarchical cluster analysis

2.7.2 質(zhì)量波動(dòng)分析 為了探究各批次樣品之間的質(zhì)量波動(dòng)性，依據(jù)文獻(xiàn)引入?yún)?shù)P值［16-17］，對(duì)不同批枳殼藥材質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，公式為，其中Ci表示給定化合物的含量，而i表示21 批枳殼的平均含量。P值越靠近1，各批間的一致性就越好。一般而言，當(dāng)P值在0.75 ～1.25 的范圍內(nèi)是可以接受的［16-17］。由圖3 可知，甜橙黃酮、川陳皮素、桔皮素、橙皮油素、橙皮內(nèi)酯含量波動(dòng)范圍較大，表明這些成分對(duì)枳殼的質(zhì)量有較大影響。將質(zhì)量波動(dòng)分析的結(jié)果與聚類分析的結(jié)果相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)5 種成分含量較低的樣品被分為G2 組，而含量相對(duì)較高的樣品被分在G1 組，與聚類分析結(jié)果一致。

圖3 不同批樣品12 種成分的Box-chart 圖Fig.3 Box-chart diagram of 12 constituents in different batches of samples

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 實(shí)驗(yàn)選取的12 種成分中10種為黃酮類（圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、甜橙黃酮、川陳皮素、桔皮素）、2 種為香豆素類（橙皮內(nèi)酯、橙皮油素），分別具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎活性和調(diào)節(jié)胃腸道及抗抑郁作用［5，18］。王慧等［5］在文獻(xiàn)分析基礎(chǔ)上篩選出枳殼中黃酮類化合物（柚皮苷、新橙皮苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素）、香豆素類化合物（水合橙皮內(nèi)酯、橙皮內(nèi)酯）、部分揮發(fā)油、生物堿等作為質(zhì)量標(biāo)志物。結(jié)合上述文獻(xiàn)，在前期研究［7］的基礎(chǔ)上，選取該12 種成分作為考察指標(biāo)。

3.2 測(cè)定方法選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了柱溫 （25、30、35 ℃）、體積流量（0.3、0.4、0.5 mL/min），結(jié)合分離度、色譜峰數(shù)目和峰形，最終確定柱溫30 ℃、體積流量0.5 mL/min。再考察超聲提取時(shí)間（30、45、60 min），發(fā)現(xiàn)超聲提取45 min，樣品中12 種成分提取相對(duì)完全，確定了樣品提取時(shí)間。將單一對(duì)照品溶液經(jīng)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)合樣品的出峰順序、分離度、色譜峰數(shù)目及峰形，確定了318 nm、285 nm （圣草次苷、新北美圣草苷、枸橘苷）、300 nm （蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷）、325 nm （橙皮內(nèi)酯、橙皮油素）、330 nm （甜橙黃酮、川陳皮素）、290 nm （桔皮素） 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

4 結(jié)論

2020 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定枳殼中含柚皮苷不得少于4.0%，新橙皮苷不得少于3.0%，本實(shí)驗(yàn)中所有樣品均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)采用灰色關(guān)聯(lián)分析、聚類分析與質(zhì)量波動(dòng)分析相結(jié)合對(duì)不同來源枳殼中12 種成分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，三者結(jié)果能夠相互印證，聚類分析結(jié)果顯示，將關(guān)聯(lián)度排名前二的S20、S9 與排名相鄰的第4 ～12 名的樣品分為G1 組； 關(guān)聯(lián)度排名靠后的第14 ～21 名的樣品分為G2 組，顯然結(jié)果是合理的； 而其中關(guān)聯(lián)度排名分別為第3 名和第13 名的S19、S14 卻分別分在了G2、G1 組； 通過質(zhì)量波動(dòng)分析發(fā)現(xiàn)，因?yàn)镾19 中甜橙黃酮、川陳皮素、桔皮素、橙皮油素、橙皮內(nèi)酯含量遠(yuǎn)低于G1 組而被分在G2 組，而S14 中這5種成分含量較高被分在了G1 組； 質(zhì)量波動(dòng)分析進(jìn)一步驗(yàn)證了前者的準(zhǔn)確性，體現(xiàn)了灰色關(guān)聯(lián)分析、聚類分析及質(zhì)量波動(dòng)分析三者相結(jié)合的優(yōu)勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)建立了UPLC 法測(cè)定枳殼中12 種成分含量，并運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)分析與聚類分析對(duì)不同產(chǎn)地的枳殼中12 種有效成分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)； 再通過質(zhì)量波動(dòng)分析進(jìn)一步驗(yàn)證，可判斷枳殼藥材質(zhì)量的優(yōu)劣，為綜合評(píng)價(jià)枳殼質(zhì)量提供依據(jù)。