UPLC 法同時測定五味子糖漿中7 種成分

趙 碩，張金朋，趙志遠(yuǎn)，陳玉鳳，郭曉帆，劉媛媛

［山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院） 藥學(xué)院，山東 泰安 271016］

五味子糖漿是五味子經(jīng)浸漬、滲漉等過程制成的中藥制劑［1］，具有補氣生津、補腎安神功效［2］，常用于治療慢性咳嗽、氣短、心悸、失眠等癥狀［3-4］，2020 年版《中國藥典》 一部“含量測定”項下以五味子醇甲為定量指標(biāo)［5］，不能全面反映該制劑整體質(zhì)量，在臨床應(yīng)用方面存在很大局限性。前期報道，五味子產(chǎn)地、采收期、加工方式不同可能會導(dǎo)致相關(guān)制劑的質(zhì)量或安全問題［6-7］，故加強藥材質(zhì)量控制十分重要。迄今為止，關(guān)于五味子糖漿的含量測定已有文獻(xiàn)［8-13］ 報道，但尚未采用UPLC 法同時測定五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素的含量，故本實驗對其進(jìn)行研究，以期為該制劑質(zhì)量控制、臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 超高效液相色譜儀（日本島津公司，型號Nexera X2）； 德安特電子分析天平（0.1 mg，天津德安特傳感技術(shù)有限公司，型號ES-E120A）；高速冷凍離心機［賽默飛世爾科技（中國） 有限公司，型號Fresco 21］； 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號KQ-600DB）； 純水機（德國默克公司，型號Direct-Q?8UV-R）。

1.2 試劑與藥物 五味子醇甲（批號D1827017，純度≥98%）、五味子醇乙（批號F1508140，純度≥98%）、五味子甲素 （批號D1911039，純度≥98%） 對照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 戈米辛J （批號G99633663，純度≥98%）、當(dāng)歸酰戈米辛H （批號A43133661，純度≥98%）對照品（上海吉至生化科技有限公司）； 當(dāng)歸酰戈米辛Q 對照品（北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，批號PCS-210329，純度≥98%）； 五味子酚對照品（上海麥克林生化科技有限公司，批號C12256480，純度≥98%）。五味子糖漿（湖北端正藥業(yè)股份有限公司，批號211101、210102、201102、220501、220301、201501）。甲醇為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號20210331）； 乙腈為色譜純（安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?，批?9115052）；甲酸為質(zhì)譜純［賽默飛世爾科技（中國） 有限公司，批號214053］。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Ultimate ? UHPLC XB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）； 流動相水（含0.1%甲酸） （A） -乙腈（含0.1%甲酸） （B），梯度洗脫（0～1.2 min，45% ～53%B； 1.2～3 min，53% ～53.5%B； 3～10 min，53.5% ～55%B； 10 ～13 min，55% ～95% B； 13 ～15 min，95% ～95% B； 15 ～17 min，95% ～45%B； 17～21 min，45% ～45%B）； 體積流量0.3 mL/min； 柱溫40 ℃； 檢測波長267 nm； 進(jìn)樣量3 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素對照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為1 252、154、375、259、258、102、375 μg/mL 的貯備液，分別精密吸取1 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為五味子醇甲125.20 μg/mL、戈米辛J 15.40 μg/mL、五味子醇乙37.50 μg/mL、當(dāng)歸酰戈米辛H 25.90 μg/mL、當(dāng)歸酰戈米辛Q 25.80 μg/mL、五味子酚10.02 μg/mL、五味子甲素37.50 μg/mL），置于4 ℃冰箱中保存。

2.2.2 供試品溶液 精密吸取2 mL 本品，置于15 mL 離心管中，4 倍量80%甲醇稀釋，超聲（功率540 W） 提取20 min，80% 甲醇補足減失的質(zhì)量，12 000 r/min 離心5 min，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方工藝，制成缺五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素的陰性樣品，按“2.2.2” 項下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗 取“2.2” 項下對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，供試品溶液中各成分保留時間與對照品溶液中的一致，分別為3.867、4.332、4.600、5.971、6.622、9.435、13.186 min，而且相鄰峰之間的分離度均大于1.5，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液適量，甲醇依次稀釋1.25、2、5、50、500 倍，在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗 精密吸取“2.3.2” 項下對照品溶液（含五味子醇甲25.04 μg/mL、戈米辛J 3.08 μg/mL、五味子醇乙7.50 μg/mL、當(dāng)歸酰戈米辛H 5.18 μg/mL、當(dāng)歸酰戈米辛Q 5.16 μg/mL、五味子酚2.04 μg/mL、五味子甲素7.50 μg/mL）適量，在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素峰面積RSD 分別為0.41%、1.15%、0.34%、0.54%、1.32%、1.17%、0.36%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 精密吸取同一份本品（批號211101），按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素含量RSD 分別為1.61%、1.21%、1.21%、1.25%、1.73%、1.88%、1.14%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸戈米辛H、當(dāng)歸戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素峰面積RSD 分別為0.59%、1.51%、0.89%、1.69%、1.98%、1.78%、1.11%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密吸取各成分含量已知的本品（批號211101） 9 份，每份1 mL，分為低、中、高劑量組，每組3 份，分別按50%、100%、150%水平加入對照品溶液，按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素平均加樣回收率分別 為 99.96%、99.41%、100.26%、100.51%、99.68%、99.18%、99.83%，RSD 分別為0.48%、0.68%、1.93%、0.76%、1.01%、1.07%、0.82%。

2.3.7 樣品含量測定 精密吸取6 批樣品，每批2 mL，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下各進(jìn)樣測定3 次，計算含量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測定結(jié)果（μg/mL，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （μg/mL，n＝3）

3 討論

3.1 提取條件選擇 前期報道，不同料液比、溶劑對成分含量測定具有一定影響［14］。本實驗采用單因素試驗分別對料液比（1 ∶1、1 ∶4、1 ∶9）、甲醇體積分?jǐn)?shù) （70%、80%、100%）、提取時間（10、20、30 min） 進(jìn)行考察，結(jié)合提取率等指標(biāo)，最終發(fā)現(xiàn)料液比1 ∶4 的80%甲醇超聲提取20 min效果最好。

3.2 色譜條件選擇 對于流動相的選擇，考慮到五味子味酸，故本實驗考察了水-乙腈、0.1%甲酸-0.1%乙腈體系［15-17］，發(fā)現(xiàn)前者洗脫時基線較穩(wěn)定，但峰形有拖尾現(xiàn)象，故在上述兩相中加入0.1%甲酸，此時峰形得到很好的改善，分離度也有所提高。

3.3 含量分析 表2 顯示，五味子醇甲含量最高，在中藥質(zhì)量控制評價模式中，該成分作為五味子糖漿質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)符合2020 年版《中國藥典》 規(guī)定；五味子醇乙、五味子甲素、當(dāng)歸酰戈米辛H 含量次之，藥理活性較強［18-19］，也可作為檢測指標(biāo)。

4 結(jié)論

本實驗建立UPLC 法同時測定五味子糖漿中五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素的含量，該方法簡便快速，穩(wěn)定可靠，可用于該制劑全面質(zhì)量控制和評價。