健脾通絡(luò)方調(diào)控Wnt/β-catenin 信號通路對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型小鼠的影響及機制研究

劉 怡 任建琳 靖 琳 儲金硯 趙 勇 周 霖 吳杏黎

結(jié)直腸癌（CRC）居全球惡性腫瘤發(fā)病率第3位，2018 年全球每年約有88 萬例CRC 患者死亡[1]。有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的CRC 患者的3 年、5 年總生存率（OS）僅為20.7%和10.5%[2]。手術(shù)是CRC的首選治療方法，目前靶向治療效果有限，術(shù)后5 年生存率并不理想，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是影響CRC 患者預(yù)后的重要因素，提高CRC 患者生存率和降低病死率是中國CRC 臨床治療面臨的巨大挑戰(zhàn)。研究表明中藥在腫瘤免疫治療方面具有重要價值，其作用包括直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，可通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境（TME）以促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)[3]。TME 能誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分化成 M1 型和 M2型巨噬細(xì)胞。M1 型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，M2型巨噬細(xì)胞可分泌抗炎細(xì)胞因子[如轉(zhuǎn)化生長因子-β（ TGF-β）、IL-10 和IL-13 等]，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，可導(dǎo)致化學(xué)治療耐藥[4]。經(jīng)典Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路異常激活是CRC發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵驅(qū)動因素[5]。Qi 等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin 信號通路參與了腫瘤血管生成擬態(tài)（VM）形成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[7]。健脾通絡(luò)方是本課題組基于絡(luò)病理論治療腫瘤的經(jīng)驗方，具有通絡(luò)散結(jié)、健脾扶正抗癌的作用（專利號ZL202010190627.3）[8-9]，前期臨床研究表明健脾通絡(luò)方能抑制CRC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、延長患者的生存期，其增效減毒效果顯著[10-12]。本實驗針對Wnt/β-catenin信號通路，探討了健脾通絡(luò)方對Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)、CRC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及免疫抑制的影響，以期為CRC 的中醫(yī)藥治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

選取36 只4 周齡雄性SPF 級BALB/c 裸鼠，體重為（20±2）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，于SPF 級環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后造模。本課題所有動物相關(guān)研究均遵循上海中醫(yī)藥大學(xué)的相關(guān)動物使用管理條例（倫理批件號2021SHLKY-01-01）。

1.2 細(xì)胞

人結(jié)腸癌細(xì)胞 HCT116 購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。細(xì)胞株使用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、90% RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 藥物

健脾通絡(luò)方組成：天龍3 g、蜈蚣3 g、黃芪30 g、黨參15 g、麩炒白術(shù)12 g、白茯苓18 g、炒薏苡仁25 g、苦參15 g、藤梨根15 g、白花蛇舌草15 g、甘草6 g，上述藥物均購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院。將中藥水煎煮至 250～300 mL，合并2 次水提液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至生藥濃度為3.2 g/mL，采用低溫間歇滅菌法，-20 ℃保存?zhèn)溆?。在體內(nèi)實驗中，參考《藥理學(xué)實驗方法》[13]中的人和動物體表面積的等效劑量轉(zhuǎn)換公式，根據(jù)體表面積（BSA）歸一化法，小鼠實驗中使用的健脾通絡(luò)方劑量（等效臨床劑量）為 3.75 g/kg 。5-氟尿嘧啶（5-FU）注射液購自天津金耀藥業(yè)有限公司（規(guī)格10 mL 0.25 g，國藥準(zhǔn)字號 H12020959）。

1.4 主要實驗儀器

LS1FD1903028 超凈工作臺購自美國Thermo公司；HWS-250 37 ℃ CO2培養(yǎng)箱購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司；CP225D 超純水系統(tǒng)購自德國Sartorious Stedim Biotech 公司；JJ-12J 脫水機購自武漢俊杰電子有限公司；JB-P5 包埋機購自武漢俊杰電子有限公司；RM2016 病理切片機購自上海徠卡儀器有限公司；IVIV 200 小動物活體成像儀購自美國Xengon 公司。

1.5 動物造模、分組、給藥及觀察

將HCT116 細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106個/mL，采用0.3% 戊巴比妥鈉對小鼠行腹腔麻醉，將其放入超凈臺，用碘伏消毒手術(shù)區(qū)域，在小鼠左背部作一0.5～1.0 cm 長的斜切口，將脾臟下端輕輕提起，在小鼠脾臟注射0.2 mL HCT116 細(xì)胞懸液，注射完畢予輕壓止血，將脾臟復(fù)位后關(guān)腹。HTC116 細(xì)胞被注射入脾臟后，可通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至肝臟，從而建立CRC 肝轉(zhuǎn)移小鼠模型。造模成功后，采用隨機數(shù)表法將小鼠分為對照組、健脾通絡(luò)方組、5-FU組和健脾通絡(luò)方＋5-FU 組，每組 9 只 。

健脾通絡(luò)方組采用灌胃給藥，3.75 g/kg，對照組給予同體積0.9% NaCl 溶液灌胃，每日1 次；5-FU組采用腹腔注射給藥，0.025 g/kg，隔日1 次；健脾通絡(luò)方＋5-FU 組為聯(lián)合給藥；各組均治療28 d。對應(yīng)給藥后觀察各組的一般情況（包括精神狀態(tài)、活動度等），分別在第1、7、14、21、28 天稱量體重。末次給藥后小鼠予禁食不禁水12 h，用0.3%戊巴比妥鈉麻醉，使用小動物活體成像儀觀察各組的肝轉(zhuǎn)移情況；摘除眼球取血并收集肝臟組織，分別置于滅菌細(xì)胞管中，放入液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 ELISA 法檢測

將小鼠血液樣本放入EP 管內(nèi)，在4 ℃下以3 000 r/min 離心20 min，吸取上清液，采用ELISA法檢測血清中相關(guān)因子表達(dá)水平，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7 免疫組織化學(xué)染色法和H-E 染色法分析

肝組織經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、切片、脫蠟，將包埋的組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，用光學(xué)顯微鏡觀察各組腫瘤轉(zhuǎn)移情況。

將H-E 染色后的肝組織加入3% H2O2，室溫下孵育阻斷，加入一抗和相應(yīng)的二抗。用DAB 液顯色，用H-E 染色細(xì)胞核，封片，用光學(xué)顯微鏡觀察肝組織中相關(guān)蛋白表達(dá)情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 26. 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，實驗均重復(fù)3 次。根據(jù)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布和方差齊性檢驗結(jié)果選擇合適的檢驗方法，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組的體重比較

36 只小鼠均造模成功，未發(fā)生死亡。在給藥第1 天，各組的活動度、飲食和飲水、排尿和排便，以及體重均無明顯差異。隨著給藥時間延長，各組的體重均呈增加趨勢。在給藥第21、28 天，健脾通絡(luò)方組、5-FU 組和健脾通絡(luò)方＋5-FU 組的體重均較對照組顯著降低（P均＜0.05），提示3 組的體重增加趨勢均較對照組顯著減緩。見表1。

表1 各組的體重比較

2.2 各組的血清TGF-β、IL-10 表達(dá)水平比較

與對照組相比，其余3 組的血清TGF-β、IL-10表達(dá)水平均顯著降低（P均＜0.001）。見表2。

表2 各組的血清TGF-β、IL-10 表達(dá)水平比較

2.3 健脾通絡(luò)方對CRC 小鼠肝轉(zhuǎn)移的影響

小動物活體成像顯示，與對照組相比，其余3組的肝區(qū)熒光光子數(shù)均顯著減少（P均＜0.01），這提示3 組的肝轉(zhuǎn)移情況均較對照組顯著減輕。見圖1、圖2。

圖1 小動物活體成像觀察各組CRC 小鼠肝轉(zhuǎn)移情況

圖2 各組的熒光光子數(shù)比較

2.4 各組的肝組織病理學(xué)變化

各組的肝組織中均可觀察到轉(zhuǎn)移灶形成。對照組的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈明顯皺縮，肝組織見大量腫瘤細(xì)胞通過血管轉(zhuǎn)移，血管周圍多見腫瘤細(xì)胞對肝組織浸潤，其余3 組的肝轉(zhuǎn)移灶均減少，健脾通絡(luò)方＋5-FU 組的肝組織結(jié)構(gòu)較完整，轉(zhuǎn)移灶最少且體積較小。見圖3。

圖3 各組的肝組織病理學(xué)改變 H-E 染色 ×100 A 對照組 B 健脾通絡(luò)方組 C 5-FU 組 D 健脾通絡(luò)方＋5-FU 組

2.5 各組的肝組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

Wnt3a 和β-catenin 主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，Ki-67主要表達(dá)在細(xì)胞核，免疫組織化學(xué)染色陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕色。結(jié)果顯示，與對照組相比，其余3 組的肝組織中Wnt3a、β-catenin 和Ki-67蛋白陽性表達(dá)率均顯著降低（P均＜0.05）。見圖4、圖5。

圖4 各組的肝組織中相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 免疫組織化學(xué)染色 ×100

圖5 各組的相關(guān)蛋白陽性表達(dá)率比較

3 討論

先秦時期中醫(yī)就對CRC 有一定的認(rèn)識，雖無具體病名，但有類似記載，如“腸覃”、“臟毒”、“鎖肛痔”等[14]。《靈樞·水脹》中記載：“腸覃者，寒氣客于腸外，與衛(wèi)氣相搏，氣不得榮，因有所系，癖而內(nèi)著，惡氣乃起，息肉乃生。其始生也，大如雞卵，稍以益大，至其成，如懷子之狀，久則離歲，按之則堅，推之則移，月事以時下，此其候也?！逼浒l(fā)生多由于正氣虧虛，氣血運行不暢，水飲停留，絡(luò)脈血運遲緩，甚則氣滯血停，痰濕凝聚，絡(luò)脈受阻則精微不布。CRC 發(fā)病較隱匿、病程較長，符合中醫(yī)“久病入絡(luò)”病機。清代葉天士提出“久病入絡(luò)”、 “久痛入絡(luò)”，使“絡(luò)病”成為內(nèi)傷疑難雜癥病機概念，在臨床實踐中提高了對腫瘤等多種難治性疾病的臨床療效。絡(luò)脈作為經(jīng)脈的網(wǎng)絡(luò)分支遍布全身，其具有運行氣血、滲濡灌注的作用，絡(luò)脈的功能及形態(tài)結(jié)構(gòu)與現(xiàn)代微循環(huán)系統(tǒng)十分相似[8]。單純的正氣虧虛或一般的外邪侵襲等尚不足以導(dǎo)致CRC，當(dāng)代醫(yī)家在古人思想上提出“癌毒”，這是導(dǎo)致惡性腫瘤的重要因素，它隨著絡(luò)脈循行，遍及全身，終致不治[8]。根據(jù)蟲藥搜經(jīng)通絡(luò)，擅行氣血的特點，臨床多用蟲藥配伍扶正類中藥治療絡(luò)脈不通、絡(luò)脈受損等疑難雜癥。本課題組對CRC門診治療用藥進(jìn)行聚類分析，結(jié)合任建琳教授多年臨床治療CRC 經(jīng)驗總結(jié)，形成健脾通絡(luò)方，并成功申報“疑難疾病精準(zhǔn)診治攻關(guān)”項目，對含蟲藥的健脾復(fù)方顆粒治療CRC 的療效及影響因素進(jìn)行多中心臨床研究[15]。健脾通絡(luò)方中天龍、蜈蚣性善走竄，搜剔絡(luò)中瘀血、散結(jié)攻毒、推陳致新；藤梨根、白花蛇舌草清熱解毒以散結(jié)消瘤；黃芪、黨參補中益氣；白術(shù)、茯苓健脾益氣以資后天之本；苦參清熱燥濕，薏苡仁利水滲濕；甘草解毒調(diào)和諸藥。健脾通絡(luò)方全方共奏通絡(luò)散結(jié)、健脾扶正、抗癌消瘤之功，通過絡(luò)虛通補、蟲藥通絡(luò)、藤藥通絡(luò)體現(xiàn)“絡(luò)以通為用”的治療原則。

經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號通路被認(rèn)為對于維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和胚胎發(fā)育至關(guān)重要，研究表明其與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和化學(xué)治療耐藥有關(guān)[16]。Wnt/β-catenin 信號通路異常激活是CRC 進(jìn)展的重要因素，β-catenin 是其關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。未磷酸化或失活的β-catenin 在細(xì)胞質(zhì)中累積，并可進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合T 細(xì)胞因子，激活與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和惡變相關(guān)的下游靶蛋白[17-18]。免疫相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)變化能通過影響腫瘤微環(huán)境抑制腫瘤進(jìn)展。研究表明TGF-β 參與了早期胚胎發(fā)育和器官發(fā)生、免疫監(jiān)督、組織修復(fù)和維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，在腫瘤中的作用是復(fù)雜的，根據(jù)疾病階段可發(fā)揮抑制或促進(jìn)作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β 過度表達(dá)可導(dǎo)致代謝紊亂和細(xì)胞功能障礙，并可促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積[20-21]。在腫瘤早期階段，TGF-β 可抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用[22]，而在腫瘤晚期階段，腫瘤細(xì)胞可對其抗有絲分裂作用產(chǎn)生抗性，而TGF-β 則可轉(zhuǎn)變?yōu)榇侔┮蜃樱琓GF-β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過上調(diào)間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)及下調(diào)上皮標(biāo)志物的表達(dá)以促進(jìn)EMT[23-24]。CRC 的特征為先天免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和TGF-β激活的高基質(zhì)浸潤[25]。TGF-β 參與調(diào)節(jié)CRC 轉(zhuǎn)移、腫瘤基質(zhì)、微環(huán)境和免疫系統(tǒng)抵抗。研究表明TGF-β 可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 信號通路介導(dǎo)多種疾病的發(fā)生和進(jìn)展[26-27]。IL-10 在腫瘤發(fā)生與機體免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)IL-10可抑制機體對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸[28]。Liu 等[29]的研究表明，IL-10 可誘導(dǎo)M2 型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)Wnt 通路以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。

本研究結(jié)果顯示，采用健脾通絡(luò)方干預(yù)CRC肝轉(zhuǎn)移小鼠后，其體重增加趨勢較對照組顯著減緩。小動物活體成像、H-E 染色結(jié)果顯示，健脾通絡(luò)方干預(yù)后小鼠肝轉(zhuǎn)移進(jìn)展較對照組顯著減緩。ELISA法和免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果顯示，健脾通絡(luò)方能下調(diào)CRC 肝轉(zhuǎn)移小鼠的血清TGF-β、IL-10 表達(dá)水平，減輕免疫抑制，抑制Wnt/β-catenin 通路信號相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制CRC 細(xì)胞轉(zhuǎn)移。