非諾貝特對酒精性肝病患者肝臟巨噬細(xì)胞極化及肝纖維化指標(biāo)的影響

任玲玲 陳芳玲 陳 益 王立明 陳光蘭

酒精性肝病是由長期大量飲酒引起的、以肝細(xì)胞炎癥或壞死為主要病理變化的肝病類型，病情遷延可進(jìn)展至酒精性肝纖維化、肝硬化甚至肝衰竭，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。目前臨床治療酒精性肝病尚無特效藥，主要通過戒酒、鍛煉和對癥支持等方法緩解病情，但療效不夠理想[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，除肝星狀細(xì)胞外，肝臟巨噬細(xì)胞也是肝臟炎癥反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞，且在肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用[3]。研究表明，激活過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）可干擾激活蛋白-1（AP-1）/NF-κB 信號通路，從而抑制組織因子及促炎因子產(chǎn)生，增強(qiáng)肝臟巨噬細(xì)胞的抗纖維化作用，進(jìn)而拮抗肝纖維化進(jìn)程[4]。非諾貝特是臨床上常用的調(diào)脂類藥物，其亦是PPARα 激動劑。既往的研究報道多集中于非諾貝特治療非酒精性脂肪性肝病方面[5]，而關(guān)于非諾貝特治療酒精性肝病的報道較少?；诖?，本研究探討了非諾貝特對酒精性肝病患者肝臟巨噬細(xì)胞極化及肝纖維化指標(biāo)的影響，旨在為臨床治療提供更多參考。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選擇2018 年1 月至2022 年9 月麗水市第二人民醫(yī)院住院治療的100 例酒精性肝病患者作為研究對象，采用奇偶數(shù)字法將患者分為研究組和對照組，每組各50 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）18～80 歲；（2）符合《酒精性肝病診療指南 （2010 年1 月修訂）》[6]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（3）B 超下經(jīng)皮穿刺肝臟活體組織檢查結(jié)果示存在肝纖維化病變，肝纖維化分期為S1～S2 期[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）入組前1 個月內(nèi)接受酒精性肝病相關(guān)治療；（2）合并病毒性肝炎、肝硬化等其他類型肝病，或?yàn)榉蔷凭灾拘愿尾。唬?）合并嚴(yán)重的心腦血管疾病、自身免疫病或惡性腫瘤；（4）近1 個月內(nèi)使用過其他影響本研究結(jié)果的藥物；（5）妊娠期或哺乳期婦女；（6）患有精神、認(rèn)知等障礙；（7）過敏體質(zhì)或?qū)Ψ侵Z貝特過敏；（8）依從性差。剔除標(biāo)準(zhǔn)：（1）治療期間失訪；（2）無法堅(jiān)持戒酒、飲食控制及鍛煉；（3）因病情反復(fù)等原因中斷治療。

研究組50 例中男性36 例，女性14 例；年齡23～72 歲，平均年齡為（51.45±8.79）歲；平均BMI 為（27.35±3.12）kg/m2；持續(xù)飲酒年限5 ～31年，平均持續(xù)飲酒年限為（18.58±9.37）年；每日乙醇攝入量80～160 g，平均每日乙醇攝入量為（115.23±23.98）g；病程3～8 年，平均病程為（6.49±1.24）年；肝纖維化分期S1 期19 例，S2 期31 例；有吸煙史24 例。對照組50 例中男性38 例，女性12例；年齡25～78歲，平均年齡為 （52.31±8.83）歲；平均BMI 為（27.21±3.14）kg/m2；續(xù)飲酒年限5～32 年，平均持續(xù)飲酒年限為（18.62±9.33）年；每日乙醇攝入量84～158 g，平均每日乙醇攝入量為（114.98±23.85）g；病程3～9 年，平均病程為（6.57±1.26）年；肝纖維化分期S1 期18 例，S2 期32 例；有吸煙史22 例。2 組在性別、年齡、BMI、持續(xù)飲酒年限、每日乙醇攝入量、病程、肝纖維化分期和吸煙史方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。所有入組患者均知情并簽署同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過（批件號：20230068）。

1.2 治療方法

對照組入組后進(jìn)行常規(guī)干預(yù)治療，即戒煙、戒酒、低脂飲食及適量運(yùn)動，補(bǔ)充維生素和微量元素，進(jìn)行保肝、降酶治療；對于Maddrey 判別函數(shù)評分（MDF）＞32 分或終末期肝病模型（MELD）評分＞20 分的患者，給予糖皮質(zhì)激素治療[8-9]。研究組在對照組的基礎(chǔ)上口服非諾貝特片（由江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H32022964，規(guī)格0.1 g/片），飯后服用，每次1 片，每日3 次，連續(xù)治療2 個月。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 臨床療效判定 顯效指治療結(jié)束后患者惡心嘔吐、食欲減退、乏力、腹痛、體重減輕等臨床癥狀均完全消失，肝功能指標(biāo)水平降至正常范圍，肝纖維化癥狀消退；有效指治療結(jié)束后患者臨床癥狀顯著改善，肝功能指標(biāo)水平顯著下降，肝纖維化癥狀減輕；無效指治療結(jié)束后患者的臨床癥狀、肝功能指標(biāo)、肝纖維化癥狀均無顯著改善[6,8]。

1.3.2 肝臟巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)10進(jìn)行肝臟巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng)[10]。B 超引導(dǎo)下行肝穿刺活體組織檢查，獲取肝組織，用含10%肝素的生理鹽水洗滌；用鑷子劃碎組織并裝入試管，以0.05%膠原酶Ⅱ消化，37 ℃孵育40 min，用200目細(xì)胞篩過濾；PBS 溶液稀釋，4 ℃下2 000 r/min離心10 min，棄上清；取沉淀，PBS 溶液沖洗2 ～3 次，每次5 min；將Percoll 細(xì)胞分離液（購自北京百奧萊博科技有限公司，貨號：SY0531）與PBS 溶液以9 ∶1 比例混合，4 ℃下3 000 r/min 離心30 min；吸出白膜層后，PBS 溶液沖洗，得到單個核細(xì)胞；以含GM-CSF 因子的10%胎牛血清1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于6 孔板內(nèi)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d。

1.3.3 肝臟巨噬細(xì)胞表型檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測肝臟巨噬細(xì)胞的表型。收集培養(yǎng)7 d 后的肝臟巨噬細(xì)胞，以F4/80-PE 和CD11B-FITC 標(biāo)記M1 型巨噬細(xì)胞，以F4/80-PE 和CD206-FITC 標(biāo)記M2 型巨噬細(xì)胞，流式抗體購自美國Sigma 公司，4 ℃下孵育3 min；PBS 溶液沖洗3 次，每次5 min；用PBS溶液重懸后，使用流式細(xì)胞儀（購自美國BD 公司，型號：FACSCalibur）檢測，應(yīng)用CellQues Pro 軟件進(jìn)行分析。

1.3.4 肝組織中M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物水平檢測 采用蛋白質(zhì)印跡法測定肝組織中M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物水平。取肝組織，采用RIPA法充分裂解；4 ℃下4 000 g 離心15 min，收集上清液，采用BCA 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量；行常規(guī)電泳，濕法轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5% BSA 封閉；滴加一抗，分別為抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）抗體（1 ∶1 000）、抗IL-1β 抗體（1 ∶3 000）、 抗IL-10 抗體（1 ∶3 000）、抗精氨酸酶-1（Arg-1）抗體（1 ∶1 000），以抗β-肌動蛋白（β-actin）抗體（1 ∶5 000）作為內(nèi)參，以上抗體均購自美國Abcam 公司；4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，每次5 min；滴加與一抗同種屬二抗（1 ∶5 000），室溫孵育2 h；TBST 洗膜3 次，每次5 min；使用ECL 發(fā)光液（購自北京凱詩源生物科技有限公司，貨號：My35737）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，使用凝膠成像儀（購自美國GE 公司，型號：ImageQuant100）顯像，應(yīng)用Image ProPlus 6.0 軟件對條帶灰度值進(jìn)行分析。iNOS 和IL-1β 為M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，IL-10 和Arg-1 為M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)測定 分別于治療前及治療后抽取入組患者清晨空腹靜脈血5 mL，3 000 r/min 離心10 min（離心半徑10 cm），分離血清和血漿，在-20 ℃下保存待測；使用全自動生物化學(xué)分析儀（購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號：BS-350S）測定血清ALT、AST、總膽紅素（TBil）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）、總膽固醇（TC）和三酰甘油（TG）水平。采用放射免疫法測定血清透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）和Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）水平，試劑盒均購自上海鈺博生物科技有限公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組臨床療效比較

經(jīng)治療后，研究組中顯效21 例，有效23 例，無效6 例，總有效率為88.00% （44/50）；對照組中顯效13例，有效23例，無效14例，總有效率為72.00%（36/50）。與對照組相比，研究組治療后的總有效率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.000，P=0.046）。

2.2 2 組肝臟巨噬細(xì)胞表型比較

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)治療后，研究組肝臟巨噬細(xì)胞中M1 促炎型巨噬細(xì)胞（CD45＋F4/80＋CD11B-CD86＋）的占比顯著低于對照組，M2 抑炎型巨噬細(xì)胞（CD45＋F4/80＋CD11BCD206＋）的占比顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見圖1。

圖1 2 組肝臟巨噬細(xì)胞表型比較 A M1 促炎型巨噬細(xì)胞 B M2 抑炎型巨噬細(xì)胞

2.3 2 組肝組織中iNOS、IL-1β 水平比較

治療前，2 組肝組織中M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（iNOS 和IL-1β）水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。治療后，研究組肝組織中iNOS、IL-1β 水平均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表1、圖2。

表1 2 組肝組織中iNOS、IL-1β 水平比較

圖2 2 組肝組織中iNOS、IL-1β 水平比較

2.4 2 組肝組織中IL-10、Arg-1 水平比較

治療前，2 組肝組織中M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（IL-10 和Arg-1）水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。治療后，研究組肝組織中IL-10、Arg-1 水平均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表2、圖3。

表2 2 組肝組織中IL-10、Arg-1 水平比較

圖3 2 組肝組織中IL-10、Arg-1 水平比較

2.5 2 組肝功能指標(biāo)水平比較

治療前，2 組肝功能指標(biāo)（包括ALT、AST、TBil 和GGT）水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。治療后，研究組血清ALT、AST、TBil 和GGT 水平均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表3。

表3 2 組肝功能指標(biāo)水平比較

2.6 2 組肝纖維化指標(biāo)水平比較

治療前，2 組肝纖維化指標(biāo)（ 包括HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C）水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。 治療后， 研究組血清HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C 水平均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表4。

表4 2 組肝纖維化指標(biāo)水平比較

2.7 2 組血脂指標(biāo)水平比較

治療前，2 組血脂指標(biāo)（TC 和TG）水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。治療后，研究組血清TC、TG 水平均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表5。

表5 2 組血脂指標(biāo)水平比較

3 討論

一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果顯示，全球50%以上肝臟疾病與過度飲酒有關(guān)，其中亞洲地區(qū)酒精性肝病的患病率為4.81%，且患病率隨時間推移呈上升趨勢，其可能成為未來亞洲地區(qū)慢性肝病的主要原因[11]。研究表明，藥物治療對于酒精性肝病的防治具有一定效果，但其僅能抑制肝纖維化的進(jìn)展，而無法逆轉(zhuǎn)早期肝纖維化[12]。肝臟巨噬細(xì)胞位于肝血竇內(nèi)，具有顯著的異質(zhì)性和極化性，可發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答、清除體內(nèi)細(xì)菌毒素等作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，肝臟巨噬細(xì)胞極化在肝臟疾病的發(fā)生和進(jìn)展過程中起著重要作用[13]。有報道稱，通過靶向調(diào)節(jié)肝臟巨噬細(xì)胞極化/分化，可減輕由非酒精性脂肪性肝病或酒精性肝病引起的肝臟脂肪變性、炎癥反應(yīng)、肝纖維化和肝硬化[14]。

PPAR 是糖脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)等過程的重要調(diào)節(jié)因子，研究表明PPAR 激動劑在肝病治療中具有重要意義[15]。研究發(fā)現(xiàn)，通過激活PPARα 可抑制巨噬細(xì)胞向M1 型分化，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)[16]。非諾貝特是一種選擇性PPARα 激動劑。毛重山等[17]研究表明，非諾貝特可有效降低非酒精性脂肪性肝病合并2 型糖尿病患者的血脂水平，并減輕肝纖維化程度。本研究將非諾貝特應(yīng)用于酒精性肝病患者的治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)治療后患者血清TC、TG 水平均顯著降低，與以往的報道相符[17]，這提示非諾貝特可有效改善酒精性肝病患者的血脂水平，其機(jī)制可能為非諾貝特通過PPARα 途徑促使膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸流出，并抑制膽固醇從頭合成，從而加速脂肪酸氧化[18]。本研究入組患者的肝纖維化分期為S1～S2 期，屬于早期肝纖維化。研究結(jié)果顯示，經(jīng)非諾貝特治療后患者血清肝功能及肝纖維化指標(biāo)水平均顯著改善，且與經(jīng)常規(guī)干預(yù)治療的對照組相比，上述指標(biāo)顯著降低，這提示非諾貝特可能具有逆轉(zhuǎn)早期肝纖維化的作用，并能促進(jìn)肝功能恢復(fù)，這與以往報道結(jié)果相符[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，研究組治療后肝內(nèi)固有巨噬細(xì)胞中CD45＋F4/80＋CD11B－CD86＋細(xì)胞的占比顯著低于對照組，CD45＋F4/80＋CD11B－CD206＋細(xì)胞的占比顯著高于對照組，這提示非諾貝特可能通過抑制肝臟巨噬細(xì)胞向M1 型分化，并促進(jìn)M1 型向M2 型極化，進(jìn)而改善肝臟纖維化程度。iNOS 和IL-1β 主要由M1 型巨噬細(xì)胞分泌，IL-10 和Arg-1 主要由M2 型巨噬細(xì)胞分泌。本研究結(jié)果顯示，治療后，研究組肝組織中iNOS、IL-1β 水平均顯著低于對照組，而IL-10、Arg-1 水平均顯著高于對照組，這表明非諾貝特治療酒精性肝病的作用機(jī)制可能與促進(jìn)肝臟巨噬細(xì)胞向M2 抑炎型巨噬細(xì)胞分化有關(guān)。

綜上所述，非諾貝特能夠有效降低酒精性肝病患者的血脂水平，抑制肝纖維化進(jìn)展，改善肝功能，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)肝臟巨噬細(xì)胞極化有關(guān)。本研究僅納入酒精性肝病伴早期肝纖維化患者，且未對患者的不良反應(yīng)進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)，結(jié)果存在一定局限性，擬在今后擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探究非諾貝特的應(yīng)用價值。