肝細胞癌組織中長鏈非編碼RNA HOXA-AS2的表達及其臨床意義

陳 霞 張莉莉

肝細胞癌（HCC）是常見的消化系統(tǒng)腫瘤，其具有預(yù)后較差、復(fù)發(fā)率較高、病死率較高的特點[1-2]。HCC 的發(fā)生和進展可歸因于多種因素，如HBV 感染等[3]。近年來，手術(shù)切除和化學(xué)治療已成為治療HCC 的重要手段，但HCC 的發(fā)病率和病死率仍然較高[4]。因此，迫切需要研發(fā)更多有效的治療方法。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）的長度超過200個核苷酸，其在包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的進展過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，多種lncRNA 在HCC 組織中異常表達，其可被視為診斷HCC 的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點[5]。此外，lncRNA 表達失調(diào)也被認為與多種生物學(xué)過程有關(guān)，包括細胞生長、遷移、凋亡和分化。lncRNA HOXA-AS2（下文簡稱HOXA-AS2）的長度為1 048 bp，其位于HOXA基因簇中HOXA3 基因與HOXA4 基因之間。研究發(fā)現(xiàn)，HOXA-AS2 在胃癌、結(jié)直腸癌等患者中表達上調(diào)[6-7]。Zhang 等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，HOXA-AS2在HCC 組織和細胞株中表達上調(diào)?；诖?，本研究分析HCC 組織中HOXA-AS2 的表達水平與患者預(yù)后的關(guān)系，以期探索預(yù)測HCC 患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

前瞻性選擇2017 年5 月至2019 年5 月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院進行手術(shù)切除治療的116 例HCC 患者作為研究對象，其中男性70 例，女性46 例；年齡39 ～70 歲，平均年齡為（54.56±13.07）歲；根據(jù)Edmondson 分級標(biāo)準(zhǔn)[9]，其中Ⅰ～Ⅱ級55 例，Ⅲ～Ⅳ級61 例；根據(jù)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期50 例，Ⅲ～Ⅳ期66 例。收集術(shù)中的腫瘤組織及癌旁正常組織（距離腫瘤組織邊緣＞3 cm）標(biāo)本，于采集后30 min 內(nèi)用液氮迅速冷凍，并置于-80 ℃的冰箱中保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）根據(jù)《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南（2015 年版）》[10]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理檢查確診為HCC；（2）術(shù)前未接受任何治療；（3）臨床資料完整；（4）未合并其他惡性腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并心、腎等其他重要器官功能不全；（2）合并自身免疫病。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且所有受試者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 HOXA-AS2 表達水平檢測

采用實時熒光定量PCR 法檢測組織中HOXAAS2 的表達水平。在無菌環(huán)境中將腫瘤組織及癌旁正常組織標(biāo)本剪碎并研磨，4 000 r/min 離心15 min，取上清液。使用TRIzol 試劑盒提取上清液中的總RNA，并通過紫外分光光度計測定其純度；使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自日本TaKaRa 公司）將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA；之后進行PCR 擴增。反應(yīng)體系：cDNA產(chǎn)物2 μL，2×SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 8 μL，上、下游引物各1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，RNase-Free H2O 7.6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；之后94 ℃ 30 s、59 ℃ 20 s、72 ℃ 40 s，共40 個循環(huán)。以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算HOXA-AS2 的相對表達量。引物序列如表1 所示。

表1 引物序列

1.3 臨床資料收集和隨訪

收集所有入組患者的性別、年齡、TNM 分期、Edmondson 分級、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、血清甲胎蛋白（AFP）水平、乙型肝炎病史、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等信息。

采用電話和門診復(fù)查的方式對入組患者進行為期3 年的隨訪，所有患者于出院1 個月后開始隨訪，每3 個月隨訪1 次，隨訪截止時間為2022 年5月，終點事件為患者死亡。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法分析HOXA-AS2 的表達水平與HCC 患者術(shù)后生存期的關(guān)系。采用Cox 比例風(fēng)險回歸模型分析影響HCC 患者術(shù)后生存率的危險因素。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC 組織和癌旁正常組織中HOXA-AS2 的表達水平比較

PCR 法結(jié)果顯示，HCC 組織中HOXA-AS2 的相對表達量為3.45±0.51，顯著高于癌旁正常組織（1.06±0.09），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 HOXA-AS2 的表達水平與HCC 患者臨床病理特征的關(guān)系

以HOXA-AS2 相對表達量的中位數(shù)（3.06）為臨界值，將HCC 患者分為HOXA-AS2 高表達（＞3.06）組和HOXA-AS2 低表達（≤3.06）組，結(jié)果顯示與HOXA-AS2 低表達組相比，HOXA-AS2高表達組中Edmondson 分級為Ⅲ～Ⅳ級者、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期者、有乙型肝炎病史者、中低分化者、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的占比較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。2 組的年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目及血清AFP 水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 HOXA-AS2 的表達水平與HCC 患者臨床病理特征的關(guān)系/例（%）

2.3 HOXA-AS2 的表達水平與HCC 患者預(yù)后的關(guān)系

隨訪結(jié)果顯示，HOXA-AS2 高表達組術(shù)后3 年存活24 例，生存率為38.10%；HOXA-AS2 低表達組術(shù)后3 年存活37 例，生存率為69.81%。HOXAAS2 高表達組術(shù)后3 年生存率顯著低于HOXA-AS2低表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（log-rankχ2=10.764，P＜0. 001）。見圖1。

圖1 HOXA-AS2 的表達水平與HCC 患者生存情況的關(guān)系

2.4 影響HCC 患者術(shù)后生存的相關(guān)因素

將116 例HCC 患者的預(yù)后生存情況作為因變量，將患者的年齡、性別、Edmondson 分級、TNM分期、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、乙型肝炎病史、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血清AFP 及HOXA-AS2 作為自變量，納入單因素Cox 回歸分析，結(jié)果顯示Edmondson 分級、TNM 分期、乙型肝炎病史、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HOXA-AS2 均與患者的預(yù)后生存率有關(guān)（P均＜0.05）。將116 例HCC 患者的預(yù)后生存情況作為因變量，將單因素分析中P＜0.05 的項目作為自變量，納入多因素Cox 回歸分析，結(jié)果顯示Edmondson 分級、TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HOXA-AS2 均是影響HCC 患者術(shù)后生存率的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表3。

表3 影響HCC 患者術(shù)后生存率的單因素和多因素Cox 比例風(fēng)險回歸模型分析

3 討論

HCC 是一種常見的惡性腫瘤，也是一個全球范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題，其具有較高的復(fù)發(fā)率和病死率[11-12]。目前HCC 的診斷、治療及預(yù)后情況仍不令人滿意。因此，尋找有效的預(yù)后生物標(biāo)志物具有重要意義。Xu 等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，晚期HCC 患者的腫瘤細胞中l(wèi)ncRNA SHRG 高表達，而敲減SHRG基因會抑制HCC 細胞的增殖和遷移能力。Zhu 等[14]的研究表明，lncRNA BRM 的表達水平與HCC 患者的病情嚴重程度相關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA Sox4 可以調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）的表達水平，其對于HCC 細胞的自我更新及HCC的發(fā)生和進展具有重要意義[15]。因此，lncRNA 與HCC 的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)，且部分lncRNA 已成為HCC 治療的關(guān)鍵靶點。

研究表明，HOXA-AS2 可通過調(diào)節(jié)miR-216a-5p 的表達參與非小細胞肺癌的發(fā)生和進展[16]。Wang 等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，HOXA-AS2 可作為miR-520c-3p 的競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA），促進骨肉瘤細胞的遷移和侵襲。Zhang 等[8]指出，HOXA-AS2可通過miR-520c-3p/GPC3 信號通路，促進HCC 細胞增殖并誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。目前有關(guān)HOXAAS2 對HCC 患者預(yù)后影響的報道較少。本研究結(jié)果顯示，HCC 組織中HOXA-AS2 的相對表達量顯著高于癌旁正常組織，這提示HOXA-AS2 參與了HCC 的發(fā)生過程。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，HOXA-AS2高表達組中Edmondson 分級為Ⅲ～Ⅳ級者、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期者、有乙型肝炎病史者、中低分化者、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的占比均顯著高于HOXA-AS2低表達組，這提示HOXA-AS2 參與了HCC 的進展過程，但其具體的病理、生理學(xué)機制仍需今后開展基礎(chǔ)研究以進一步明確。

本研究的隨訪結(jié)果顯示，HOXA-AS2 高表達組術(shù)后3 年生存率顯著低于HOXA-AS2 低表達組，這提示HOXA-AS2 的表達水平與HCC 患者的預(yù)后相關(guān)。為避免混雜因素的影響，本研究通過Cox 比例風(fēng)險回歸模型分析影響HCC 患者預(yù)后的相關(guān)因素，結(jié)果顯示Edmondson 分級、TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是影響HCC 患者術(shù)后生存率的獨立危險因素，這與既往的研究結(jié)果相符[18]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)HOXA-AS2 同樣是影響HCC 患者術(shù)后生存率的獨立危險因素，這對于預(yù)防疾病復(fù)發(fā)具有一定的意義。

綜上所述，HOXA-AS2 在HCC 組織中表達上調(diào)，且其對于患者的預(yù)后預(yù)測具有較高價值，其表達水平越高，提示患者的預(yù)后生存率越低。本研究存在一定的不足，如本研究為單中心研究，樣本量偏少，結(jié)果存在一定的局限性。今后需開展多中心、大樣本量的研究，以進一步驗證本文結(jié)論。