環(huán)狀RNA CCDC66A 在肝細胞癌組織中的表達及臨床意義

解維敏 閆 奇

肝細胞癌（HCC）通常起源于干細胞的惡性轉(zhuǎn)化，是原發(fā)性肝癌的主要類型，也是全球第2 大惡性腫瘤相關(guān)死亡原因，其主要的特征是高復(fù)發(fā)率和異質(zhì)性[1]。近年來，HCC 的發(fā)病率和病死率呈逐年升高趨勢，目前其治療手段存在局限性。HCC患者經(jīng)手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療后易復(fù)發(fā)，且預(yù)后較差[2]。HBV 感染是HCC 發(fā)生的主要驅(qū)動因素，因此篩選HBV 相關(guān)HCC 的治療靶點和潛在生物標(biāo)志物至關(guān)重要。

環(huán)狀RNA（circRNA）是一類單鏈共價閉合RNA，由前體mRNA 剪接產(chǎn)生，前體mRNA 下游5'端與上游3'端相連，構(gòu)成了circRNA[3]。circRNA 保守性較高，具有組織依賴性，在機體的不同發(fā)育階段呈特異性表達。Wang 等[4]將高通量RNA 測序技術(shù)與生物信息學(xué)工具相結(jié)合，篩選出了HBV 相關(guān)腫瘤組織和癌旁組織中circRNA 差異表達譜，研究表明circRNA_10156 在HCC 中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，并提示circRNA 可能是HCC 治療的生物標(biāo)志物和干預(yù)靶點。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（CCDC）家族蛋白參與細胞間跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進細胞增殖和凋亡，調(diào)控腫瘤進展[5]。CCDC 來源的circRNA 同樣在腫瘤進展中發(fā)揮著重要作用，其中CCDC65 是一種腫瘤相關(guān)卷曲螺旋蛋白，與肝癌患者的生存期密切相關(guān)[6]。另有研究表明，HCC 組織中CCDC178蛋白表達水平升高，其過表達與疾病病理分期有關(guān)[7]。此外，已有研究證實CCDC66 在結(jié)直腸癌、胃癌等惡性腫瘤中表達水平顯著升高，在腫瘤進展中發(fā)揮著促癌作用[8-9]。目前有關(guān)CCDC66 在HCC 進展中作用的相關(guān)研究報道較少。本文通過檢測CCDC66 在HCC 組織中的表達水平，探究其對HCC 預(yù)后預(yù)測的價值。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選擇2016 年1 月至2017 年6 月在西北大學(xué)附屬神木市醫(yī)院行手術(shù)切除治療的106 例HCC 患者作為研究對象，其中男59 例，女47 例，年齡43～79 歲，平均年齡為（59.27±12.20）歲，平均BMI 為（24.63±2.62）kg/m2，患者TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期54 例，Ⅲ～Ⅳ期52 例。收集手術(shù)切除的HCC 組織和癌旁組織標(biāo)本，置于－80 ℃冰箱中保存、待用。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）穿刺活體組織病理檢查結(jié)果符合HCC 診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）未進行放射治療、化學(xué)治療等輔助治療；（3）入組患者及家屬均了解研究內(nèi)容，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他臟器惡性腫瘤者；（2）合并自身免疫病者；（3）合并心、腎、肺等臟器功能障礙者；（4）與患者及家屬溝通不暢。本研究內(nèi)容經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且符合赫爾辛基宣言。

1.2 臨床資料收集

利用本院的電子病歷系統(tǒng)，收集入組患者的年齡、性別、BMI 和乙型肝炎病史等臨床資料，術(shù)后記錄TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和腫瘤直徑等。

1.3 CCDC66 的表達水平檢測

采用實時定量PCR 法檢測CCDC66 的表達水平。用TRIzol 試劑盒（購自美國Invitrogen公司）收集HCC 組織及癌旁組織中的總RNA，將總RNA（10 μg）與40 U RNase R（購自美國Epicenter Technologies 公司）在37 ℃下孵育1 h，使用PrimerScript RT 試劑盒（購自日本TaKaRa公司）將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴增后在PCR儀上檢測CCDC66 的表達水平。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；之后95 ℃變性15 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共計40 個循環(huán)。以U6 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算CCDC66 的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 隨訪

采用電話和門診的方式對入組患者進行為期5年的隨訪，隨訪起始時間為患者術(shù)后，每3 個月隨訪1 次，隨訪截至2022 年6 月或患者死亡。本研究無失訪患者。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用非參數(shù)t檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法分析CCDC66的表達水平與HCC 患者術(shù)后生存期的關(guān)系。采用Cox 比例風(fēng)險回歸模型分析影響HCC 患者預(yù)后的危險因素。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC 組織和癌旁組織中CCDC66 的表達水平比較

結(jié)果表明，HCC 組織中CCDC66 的相對表達量為2.93±0.17，顯著高于癌旁組織（1.02±0.26），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝4.038，P＜0.05）。

2.2 CCDC66 的表達水平與HCC 患者臨床病理特征的關(guān)系

以CCDC66 相對表達量的中位數(shù)（1.89）為臨界值，將HCC 患者分為CCDC66 高表達（≥1.89）組和CCDC66 低表達（＜1.89） 組， 結(jié)果顯示與CCDC66 低表達組相比，CCDC66 高表達組中TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期者、有乙型肝炎病史者、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的占比較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。2 組的年齡、性別、BMI 及腫瘤直徑差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 CCDC66 的表達水平與HCC 患者臨床病理特征的關(guān)系/例（%）

2.3 CCDC66 的表達水平與HCC 患者術(shù)后生存期的關(guān)系

隨訪結(jié)果顯示，CCDC66 高表達組術(shù)后5 年存活25 例，生存率為39.68%；CCDC66 低表達組術(shù)后5 年存活22 例，生存率為51.16%。CCDC66 高表達組的5 年生存率顯著低于CCDC66 低表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 CCDC66 的表達水平與HCC 患者生存情況的關(guān)系

2.4 CCDC66 的表達水平預(yù)測HCC 患者預(yù)后的價值

將預(yù)后情況作為因變量，將TNM 分期、乙型肝炎病史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CCDC66 作為自變量（賦值情況見表3），納入Cox 單因素回歸分析，結(jié)果顯示TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期、有乙型肝炎病史、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CCDC66 高表達均與HCC 患者的預(yù)后有關(guān)（見表4）。以單因素分析結(jié)果中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）的項目作為自變量，納入多因素Cox 比例風(fēng)險回歸模型分析，結(jié)果顯示TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CCDC66高表達均是HCC 患者預(yù)后的獨立危險因素（見表5）。

表3 Cox 比例風(fēng)險回歸模型變量賦值表

表4 影響HCC 預(yù)后的單因素Cox 比例風(fēng)險回歸模型分析

表5 影響HCC 預(yù)后的多因素Cox 比例風(fēng)險回歸模型分析

3 討論

HCC 是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，75%以上的HCC 患者在確診時疾病已進展至晚期，導(dǎo)致患者的病死率較高[10]。目前HCC 患者的5 年生存率可達50%，但70%以上的患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[11]。因此，尋找特異性較高且應(yīng)用價值較高的生物標(biāo)志物對于改善HCC 的預(yù)后具有重要的臨床意義。

隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)真核細胞中存在大量circRNA[12]。circRNA 是穩(wěn)定的RNA 分子，具有共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)，在機體全血、血漿中的表達水平高于線性RNA。circRNA 比線性RNA 的半衰期更長，且穩(wěn)定性更高[13]。因此，circRNA 可能可以作為多種疾病的生物標(biāo)志物，在疾病的診療及預(yù)后預(yù)測方面發(fā)揮重要作用。circRNA 參與多種生物學(xué)過程，其主要通過調(diào)控miRNA，參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達[14]。CCDC66在多種腫瘤組織中異常表達，已被確定為腫瘤的潛在治療靶點。研究表明，敲除CCDC66 基因可顯著抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[15]。此外，致癌基因CCDC66 與結(jié)直腸癌細胞對奧沙利鉑的耐藥有關(guān)，下調(diào)CCDC66 表達可改善結(jié)直腸癌細胞對奧沙利鉑的耐藥[16]。本研究結(jié)果表明，與CCDC66 低表達組相比，CCDC66 高表達組中TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期者、有乙型肝炎病史者、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的占比較高，且CCDC66 高表達組的5 年生存率較低。多因素Cox 比例風(fēng)險回歸模型分析結(jié)果顯示，TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CCDC66 高表達均為HCC 患者預(yù)后的獨立危險因素。

綜上所述，HCC 患者腫瘤組織中CCDC66 表達上調(diào)，CCDC66 可作為預(yù)測患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。本研究存在一定的不足之處。首先，本研究的樣本量較小，今后應(yīng)擴大樣本量以進一步驗證本文結(jié)論；其次，本研究未闡明CCDC66 影響HCC進展的具體分子調(diào)控信號通路，后續(xù)研究可采用流式細胞術(shù)、蛋白質(zhì)印跡法等方法，探究CCDC66對HCC 細胞增殖和調(diào)亡的影響。