利那洛肽聯(lián)合普蘆卡必利對(duì)IBS-C 小鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)及SCF/c-kit 信號(hào)通路的影響

劉 暢 王 影

便秘型腸易激綜合征（IBS-C）是一種反復(fù)發(fā)作的腸道功能紊亂，以腹脹、排便頻率降低及排便困難為主要臨床特征[1]。研究表明，IBS-C 的發(fā)生、進(jìn)展與結(jié)腸傳輸功能障礙密切相關(guān)，而機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)在IBS-C 的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[2]。干細(xì)胞因子（SCF）來源于胃腸平滑肌細(xì)胞，其可作為c-kit 的配體與c-kit 結(jié)合，形成SCF/c-kit 信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)腸道Cajal 間質(zhì)細(xì)胞（ICC）的增殖和分化，抑制SCF/c-kit 信號(hào)通路可導(dǎo)致ICC 凋亡并使IBS-C 患者機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[3]。在IBS-C的臨床治療中，常使用導(dǎo)瀉藥物以促進(jìn)機(jī)體腸道蠕動(dòng)，但其遠(yuǎn)期療效往往較差，不適合應(yīng)用于長期維持治療[4]。普蘆卡必利是治療慢性便秘的新型藥物，可激活腸壁5-羥色胺4（5-HT4）受體，促進(jìn)腸道收縮，加速胃腸道排空[5]。利那洛肽是一種具有鎮(zhèn)痛和通便效果的口服型鳥苷酸環(huán)化酶C（GC-C）激動(dòng)劑，對(duì)IBS-C 患者的腹痛和便秘癥狀具有顯著改善作用[6]。本研究分別探索普蘆卡必利和利那洛肽單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用于IBS-C 小鼠后，對(duì)小鼠氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50 只SPF 級(jí)、C57BL/6 野生型雄性小鼠，6 周齡，體重為18 ～22 g，均購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（冀）2022-001]。所有小鼠均飼養(yǎng)于SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，室內(nèi)保持12 h 光照與黑暗交替，自由飲水、進(jìn)食，定期更換墊料。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

利那洛肽膠囊（290 μg/粒）購自瑞典Almac Pharma Services Limited 公司，琥珀酸普蘆卡必利片（2 mg/片）購自江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司；印度墨汁購自北京索萊寶科技有限公司；胃動(dòng)素（MOT）、生長抑素（SS）一抗、生物素羊抗兔IgG、DAB 顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧（ROS）、總抗氧化能力（TAOC）檢測(cè)試劑盒及ELISA 試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司；抗SCF、c-kit、GAPDH 小鼠單克隆抗體均購自英國Abcam 公司；基因上、下游引物由上海捷瑞生物工程有限公司提供，RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本TaKaRa 公司。

1.3 造模、分組及給藥干預(yù)

選取10 只小鼠作為對(duì)照組，其余40 只小鼠采用冰水灌胃法構(gòu)建IBS-C 模型。使用4 ℃生理鹽水灌胃，0.3 mL/只，1 次/d，連續(xù)灌胃14 d，造模期間正常飲食、飲水，如觀察發(fā)現(xiàn)造模小鼠的糞便顆粒數(shù)明顯減少，糞便含水量明顯降低，則提示造模成功。將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組、利那洛肽組、普蘆卡必利組和聯(lián)合給藥組，每組10 只。利那洛肽組給予利那洛肽（100 μg/kg）灌胃，普蘆卡必利組給予普蘆卡必利（0.2 mg/kg）灌胃，聯(lián)合給藥組同時(shí)給予利那洛肽和普蘆卡必利 （劑量同上）進(jìn)行干預(yù)，每日灌胃1 次，連續(xù)灌胃14 d。

1.4 小鼠糞便顆粒數(shù)及糞便含水量測(cè)定

用糞便采集盒連續(xù)收集各組小鼠12 h內(nèi)的糞便，觀察糞便性狀并記錄糞便顆粒數(shù)，用電子天平稱量糞便濕重，隨后將糞便置于65 ℃恒溫箱烘干后稱量干重，計(jì)算糞便含水量，公式：糞便含水量（%）=（糞便濕重－糞便干重）/糞便干重×100%。

1.5 胃殘留率測(cè)定

各組取5 只小鼠，禁食、不禁水24 h 后給予印度墨汁混懸液（阿拉伯膠制，0.8 mL/只）灌胃，同時(shí)腹腔注射阿托品（0.5 mg/kg），于20 min 后處死小鼠并解剖。稱量胃組織質(zhì)量，去除胃內(nèi)容物后再次稱量凈重，兩者之差即為小鼠胃內(nèi)容物質(zhì)量，計(jì)算胃殘留率，公式：胃殘留率（%）=胃內(nèi)容物（g）/墨汁混懸液（g）×100%。

1.6 小腸推進(jìn)率測(cè)定

取上述小鼠完整的腸組織，將腸組織平鋪于潔凈桌面，測(cè)量墨汁推進(jìn)長度，計(jì)算小腸推進(jìn)率，公式：小腸推進(jìn)率（%）=墨汁前端至幽門口的長度/直腸末端至幽門口的長度×100%。

1.7 結(jié)腸組織MOT、SS 水平測(cè)定

各組另取5 只小鼠，經(jīng)眼球采血后處死，取近直腸末端的結(jié)腸組織于10%福爾馬林溶液中固定48 h，取出后用流水沖洗，浸蠟、包埋后切片（厚度為5 μm），切片經(jīng)脫蠟、透明和脫水后，滴加0.3%的H2O2后置于室溫下20 min，經(jīng)抗原熱修復(fù)后滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封閉20 min，分別加入MOT、SS 一抗于4 ℃孵育過夜，加入二抗后在37 ℃下作用20 min，滴加SABC 試劑后在37 ℃下作用20 min，DAB 避光顯色后封片，光學(xué)顯微鏡下觀察MOT、SS 的陽性表達(dá)情況。陽性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞呈棕黃色至棕褐色顆粒，分布于結(jié)腸黏膜層。以陽性細(xì)胞的平均光密度（OD）值作為MOT、SS 水平的半定量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用ImageJ 軟件計(jì)算3 個(gè)視野的MOT、SS 陽性細(xì)胞的平均OD 值，以評(píng)價(jià)MOT、SS 水平。

1.8 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

采用ELISA 法檢測(cè)小鼠血清MDA、ROS、SOD 和TAOC 水平。1.7 小節(jié)中的小鼠經(jīng)眼球采血后，取0.5 mL 血液樣品，3 000 r/min 離心15 min，取上清液。分別作空白對(duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔，空白對(duì)照孔不加酶標(biāo)試劑和樣品，標(biāo)準(zhǔn)孔分別加入100 μL 酶標(biāo)試劑和不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，各樣品孔中分別加入100 μL 酶標(biāo)試劑、10 μL 血清樣品和40 μL 稀釋劑，置于37 ℃孵育1 h 后洗滌，加底物液顯色，經(jīng)37 ℃避光孵育15 min 后終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀于450 nm 下檢測(cè)各孔的OD 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔OD 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入樣品孔OD 值后計(jì)算得到MDA、ROS、SOD 和TAOC 的濃度。

1.9 結(jié)腸組織中SCF、c-kit 蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中SCF、c-kit 蛋白的表達(dá)水平。取1.7 小節(jié)中的小鼠近直腸末端的結(jié)腸組織，使用RIPA 裂解液對(duì)組織樣品進(jìn)行裂解，獲得5 組小鼠的結(jié)腸組織蛋白樣品，使用BCA 試劑盒測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的濃度。取10 μL 蛋白樣品上樣于SDS-PAGE 膠加樣孔內(nèi)，經(jīng)電泳分離、PVDF 轉(zhuǎn)膜后，加入5%脫脂牛奶封閉2 h，滴加一抗（1 ∶1 000）并置于4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗（1 ∶5 000）并置于室溫下反應(yīng)2 h，再次洗膜后加入發(fā)光液顯色。曝光拍照后，應(yīng)用ImageJ軟件測(cè)定條帶灰度值，以GAPDH 作為內(nèi)參，計(jì)算SCF、c-kit 蛋白的表達(dá)水平。

1.10 結(jié)腸組織中SCF 和c-kit mRNA 的表達(dá)水平檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)結(jié)腸組織中SCFmRNA 和c-kitmRNA 的相對(duì)表達(dá)量。取1.7 小節(jié)中的小鼠近直腸末端的結(jié)腸組織，采用TRIzol 法提取組織總RNA。采用紫外線分光光度法測(cè)定RNA 濃度后，取2 μg 總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA 為模板，使用RT-PCR試劑盒檢測(cè)SCFmRNA、c-kitmRNA 的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法檢測(cè)SCFmRNA、c-kitmRNA 的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組的糞便顆粒數(shù)和糞便含水量比較

與對(duì)照組相比，模型組的糞便顆粒數(shù)和糞便含水量均顯著減少（P均＜0.05）；與模型組相比，利那洛肽組、普蘆卡必利組和聯(lián)合給藥組的糞便顆粒數(shù)和糞便含水量均顯著增多（P均＜0.05）；與利那洛肽組、普蘆卡必利組相比，聯(lián)合給藥組的糞便顆粒數(shù)和糞便含水量均顯著增多 （P均＜0.05）。見表2。

表2 各組的糞便顆粒數(shù)和糞便含水量比較

2.2 各組的胃殘留率和小腸推進(jìn)率比較

與對(duì)照組相比，模型組的胃殘留率顯著升高，小腸推進(jìn)率顯著降低（P均＜0.05）；與模型組相比，利那洛肽組、普蘆卡必利組和聯(lián)合給藥組的胃殘留率均顯著降低，小腸推進(jìn)率均顯著升高（P均＜0.05）。與利那洛肽組、普蘆卡必利組相比，聯(lián)合給藥組的胃殘留率均顯著降低，小腸推進(jìn)率均顯著升高（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組的胃殘留率和小腸推進(jìn)率比較

2.3 各組結(jié)腸組織中MOT、SS 水平比較

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，MOT、SS 陽性細(xì)胞呈棕褐色顆粒。與對(duì)照組相比，模型組結(jié)腸組織中MOT 陽性細(xì)胞的平均OD 值顯著降低，SS陽性細(xì)胞的平均OD 值顯著升高（P均＜0.05）；與模型組相比，利那洛肽組、普蘆卡必利組和聯(lián)合給藥組結(jié)腸組織中MOT 陽性細(xì)胞的平均OD 值均顯著升高，SS 陽性細(xì)胞的平均OD 值均顯著降低（P均＜0.05）；與利那洛肽組、普蘆卡必利組相比，聯(lián)合給藥組結(jié)腸組織中MOT 陽性細(xì)胞的平均OD值均顯著升高，SS 陽性細(xì)胞的平均OD 值均顯著降低（P均＜0.05）。見圖1。

圖1 各組結(jié)腸組織中MOT、SS 的表達(dá)情況 A MOT、SS 陽性細(xì)胞的病理圖 免疫組織化學(xué)色 ×200 B MOT 陽性細(xì)胞的平均OD 值C SS 陽性細(xì)胞的平均OD 值

2.4 各組血清MDA、ROS、SOD 和TAOC 水平比較

與對(duì)照組相比，模型組血清MDA、ROS 水平均顯著升高，SOD、TAOC 水平均顯著降低（P均＜0.05）；與模型組相比，利那洛肽組、普蘆卡必利組和聯(lián)合給藥組血清MDA、ROS 水平均顯著降低，SOD、TAOC 水平均顯著升高（P均＜0.05）；與利那洛肽組、普蘆卡必利組相比，聯(lián)合給藥組血清MDA、ROS 水平均顯著降低，SOD、TAOC水平均顯著升高（P均＜0.05）。見表4。

表4 各組血清MDA、ROS、SOD 和TAOC 水平比較

2.5 各組結(jié)腸組織中SCF、c-kit 蛋白表達(dá)水平比較

與對(duì)照組相比，模型組結(jié)腸組織中SCF、c-kit蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P均＜0.05）；與模型組相比，利那洛肽組、普蘆卡必利組和聯(lián)合給藥組結(jié)腸組織中SCF、c-kit 蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P均＜0.05）；與利那洛肽組、普蘆卡必利組相比，聯(lián)合給藥組結(jié)腸組織中SCF、c-kit 蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P均＜0.05）。見圖2。

圖2 各組結(jié)腸組織中SCF、c-kit 蛋白的表達(dá)水平 A SCF、c-kit 的蛋白電泳圖 B SCF 蛋白表達(dá)水平 C c-kit 蛋白表達(dá)水平

2.6 各組結(jié)腸組織中SCF mRNA、c-kit mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較

與對(duì)照組相比，模型組結(jié)腸組織中SCFmRNA、c-kitmRNA 的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P均＜0.05）；與模型組相比，利那洛肽組、普蘆卡必利組和聯(lián)合給藥組結(jié)腸組織中SCFmRNA、c-kitmRNA 的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P均＜0.05）；與利那洛肽組、普蘆卡必利組相比，聯(lián)合給藥組結(jié)腸組織中SCFmRNA、c-kitmRNA 的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P均＜0.05）。見表5。

表5 各組結(jié)腸組織中SCF mRNA、c-kit mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

在中國腸易激綜合征（IBS）的患病率約為6.5%，其中IBS-C 的臨床發(fā)病率約占IBS 總發(fā)病率的35.0%，同時(shí)IBS 存在就診率低的現(xiàn)象，僅25%的患者得到及時(shí)診斷，較多患者因診斷不及時(shí)而延誤了治療時(shí)機(jī)[7]。目前IBS-C 的治療方案主要以改善便秘癥狀、調(diào)節(jié)飲食和改變生活方式為主，但目前常用藥物的不良反應(yīng)較多且功能單一，無法同時(shí)改善腹痛和排便困難，甚至?xí)又馗雇窗Y狀，導(dǎo)致療效不佳[8]。

普蘆卡必利是一種新型5-HT4受體激動(dòng)劑，可選擇性激活5-HT4受體，促使腸道平滑肌收縮，其起效迅速且作用持久，治療慢性便秘的效果較好[9]。利那洛肽是一種新型口服藥物，可通過結(jié)合腸上皮細(xì)胞GC-C 受體升高胞內(nèi)、胞外環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）含量，同時(shí)發(fā)揮通便和鎮(zhèn)痛的療效；此外，由于其降解產(chǎn)物主要分布于胃腸道，對(duì)肝臟和腎臟的損傷均較小，因此安全性較高，可用于IBS-C患者的長期治療[10]。多項(xiàng)研究表明，利那洛肽可通過激活小腸和結(jié)腸的GC-C 以提高小鼠痛閾，進(jìn)而緩解IBS-C 患者的腹痛癥狀[11-12]。臨床研究表明，利那洛肽可有效緩解IBS-C 患者的排便不適癥狀，提高腸道痛閾，改善患者的生活質(zhì)量[13]。由于利那洛肽的上市時(shí)間較短，目前關(guān)于其作用機(jī)制的研究報(bào)道較少，因此需進(jìn)一步探究利那洛肽的藥理學(xué)機(jī)制。

冷刺激是導(dǎo)致IBS-C 反復(fù)發(fā)作的危險(xiǎn)因素，冰水灌胃是目前較為理想的IBS-C 動(dòng)物模型的造模方法，該法可引起機(jī)體腸道運(yùn)動(dòng)異常，機(jī)體受到刺激后可導(dǎo)致糞便顆粒數(shù)和糞便含水量減少，且該癥狀可持續(xù)存在14 d 以上[14]。本研究采用冰水灌胃法構(gòu)建IBS-C 小鼠模型，觀察利那洛肽和普蘆卡必利聯(lián)合應(yīng)用于IBS-C 小鼠的效果。本研究結(jié)果顯示，利那洛肽和普蘆卡必利單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用均可增加IBS-C 模型小鼠的糞便顆粒數(shù)和糞便含水量，升高小腸推進(jìn)率，降低胃殘留率，這提示利那洛肽聯(lián)合普蘆卡必利治療可顯著改善IBS-C 模型小鼠癥狀，并可促進(jìn)腸功能恢復(fù)。MOT 具有刺激機(jī)體分泌胃蛋白酶、促進(jìn)消化道機(jī)械運(yùn)動(dòng)的生理功能，還可抑制SS 釋放[15]。SS 可抑制腸道平滑肌收縮，減少腸液分泌及腸道血流量[16]。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，利那洛肽和普蘆卡必利單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用后，結(jié)腸組織中MOT 水平升高，SS 水平降低，并且利那洛肽聯(lián)合普蘆卡必利的干預(yù)效果更加顯著，這提示兩者聯(lián)合使用可調(diào)節(jié)胃腸激素表達(dá)，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，進(jìn)而改善IBS-C 癥狀。

機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)所造成的ROS 累積可誘導(dǎo)結(jié)腸ICC 凋亡，導(dǎo)致腸動(dòng)力障礙[17]。SOD、TAOC水平可反映機(jī)體自由基清除能力，而MDA 水平可反映組織細(xì)胞受自由基損傷程度[18]。ELISA 法結(jié)果顯示，IBS-C 模型小鼠經(jīng)利那洛肽聯(lián)合普蘆卡必利治療后，其血清SOD、TAOC 水平均升高，MDA、ROS 水平均降低，這提示兩者聯(lián)合應(yīng)用可顯著增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，改善IBS-C 小鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)。研究表明，氧化應(yīng)激水平升高可抑制SCF/c-kit 信號(hào)通路的活性，促進(jìn)ICC 凋亡，而通過外源性給予SCF，可通過促進(jìn)SCF/c-kit 信號(hào)通路活化而改善胃腸道動(dòng)力異常[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IBS-C 模型小鼠結(jié)腸組織中SCF、c-kit 的蛋白和mRNA 的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，經(jīng)治療后其表達(dá)水平均顯著升高，這提示利那洛肽聯(lián)合普蘆卡必利可減輕IBS-C 模型小鼠氧化應(yīng)激損傷，這可能與SCF/c-kit 信號(hào)通路的激活有關(guān)。

綜上所述，利那洛肽聯(lián)合普蘆卡必利治療可通過促進(jìn)IBS-C 模型小鼠SCF/c-kit 信號(hào)通路的活化，提高機(jī)體抗氧化能力，進(jìn)而促進(jìn)小鼠腸道功能恢復(fù)，緩解其癥狀，并且聯(lián)合用藥的療效優(yōu)于單藥治療。本課題組今后將進(jìn)一步探究利那洛肽聯(lián)合普蘆卡必利治療減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)、激活SCF/c-kit 信號(hào)通路的具體作用機(jī)制。