肌肉生長抑制素基因在重要經(jīng)濟動物育種中的研究進展*

楊 鵬，黃 濤，徐夢思，

（1.新疆農(nóng)墾科學院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000；2.石河子大學動物科技學院）

肌肉性狀是影響畜牧生產(chǎn)中的重要經(jīng)濟性狀，提高家畜肌肉品質(zhì)是家畜育種工作者的畢生追求。肌肉生長抑制素（myostain，MSTN），又名生長分化因子8（growth and differentiation factor 8，GDF8），是目前唯一明確的對骨骼肌生長發(fā)育和再生起負向調(diào)節(jié)作用的分泌性糖蛋白，對肌肉發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持都起著重要作用，其自然突變或敲除導致的蛋白功能失活或者表達量下降都會導致肌肉異常發(fā)達，反之，其表達上升則會引起肌肉萎縮。MSTN 缺失型家畜骨骼肌重量增加，使得肌肉與其他組織相比，比例大大提高。自然界中存在MSTN天然突變體動物：如比利時藍牛、皮埃蒙特牛、特克賽爾羊，其肌肉異常發(fā)達的“雙肌”表型引起了遺傳育種研究領(lǐng)域的高度關(guān)注。

1 MSTN基因的結(jié)構(gòu)特征

MSTN基因編碼的MSTN蛋白因其具有轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor beta）超家族的典型結(jié)構(gòu)特征而成為了TGF-β超家族的成員之一，但相較于其他家族成員，其C端的氨基酸序列要更短一些。MSTN基因在不同物種中結(jié)構(gòu)相似且高度保守，包括三個相似大小的外顯子以及兩個內(nèi)含子，但其在不同脊椎動物物種中的染色體定位并不相同。MSTN位于人、黑猩猩、牛、綿羊和山羊的2號染色體上，位于小鼠1號染色體上，位于大鼠9號染色體上，位于豬15號染色體上，位于馬18號染色體，位于狗37號染色體，而兔、雞的該基因定位在7號染色體。哺乳動物MSTN基因外顯子編碼的氨基酸數(shù)目除小鼠（376個AA）外，其他均為375個氨基酸的潛在蛋白。與其他TGF-β蛋白一樣，MSTN蛋白包含信號序列、N端LAP前結(jié)構(gòu)域和7個半胱氨酸殘基的C端成熟序列。MSTN蛋白的活化需要經(jīng)兩次蛋白質(zhì)水解切割，最終形成C端成熟肽隨即發(fā)揮其生物學作用[1]。其3’-UTR區(qū)域具有豐富的miRNA結(jié)合位點，對于其轉(zhuǎn)錄和翻譯具有重要的調(diào)節(jié)作用。

2 MSTN基因在動物體內(nèi)的表達

MSTN的主要功能是通過自分泌或旁分泌信號傳導負向調(diào)節(jié)骨骼肌的生長和發(fā)育，但眾多研究表明MSTN基因在多種動物中均有所表達，且在哺乳動物各組織器官（包括乳腺）中廣泛表達。雖然在不同物種的表達譜范圍存在一定差異，但在骨骼肌中表達均最為顯著[2]，在乳腺和心臟中的表達水平較低。而在魚類的研究中，發(fā)現(xiàn)MSTN1基因廣泛表達，而MSTN2基因表達則相對有限，主要在大腦中。說明MSTN的作用不僅限于骨骼肌的生長和發(fā)育的負調(diào)節(jié)，還可能通過旁系同源物的差異表達來影響其他組織的生長發(fā)育過程。同時，MSTN 基因表達具有十分顯著的時序特征，在胚胎期發(fā)生的早期階段，MSTN的表達僅限于發(fā)育體節(jié)的肌動蛋白片段，成熟后，MSTN存在于骨骼肌中。

3 MSTN基因的生物學功能

研究表明，MSTN基因的生理作用主要是防止生物體發(fā)育的各個階段肌肉組織的過度生長，還能夠通過損傷衛(wèi)星細胞的激活和增殖以及巨噬細胞和成肌細胞向損傷部位的遷移起到抑制骨骼肌再生的目的。因此，目前針對MSTN基因生物學功能的研究主要集中在其缺失或者突變導致肌肉過度生長。除典型的雙肌型牛、羊[3]外，陸續(xù)也有犬[4]、豬[5]、兔[6]、雞[7]、鳥[8]和人類[9]等動物的相似研究，均表現(xiàn)為抑制生肌。研究表明，MSTN對家畜肌肉發(fā)育過程中的調(diào)控作用，不局限于對肌肉前體細胞的增殖調(diào)控，還包含對成肌細胞增殖和分化的調(diào)控[10]。MSTN的上調(diào)表達會引發(fā)成肌分化抗原（myogenic differentiation antigen，MyoD）的過度表達，進而引起過度活躍分化，抑制成肌細胞前體和成肌細胞的增殖，下調(diào)MSTN上述細胞數(shù)量則會增加。此外，還有研究表明MSTN基因?qū)τ谥镜某练e也具有調(diào)節(jié)作用。MSTN在脂肪組織中表達量最低，MSTN缺失型動物與野生型相比具有更少的總脂肪和體內(nèi)脂肪。在脂肪細胞中過度表達MSTN的轉(zhuǎn)基因小鼠，在喂食高脂肪飲食時不會發(fā)展為肥胖，并且比肥胖的非轉(zhuǎn)基因小鼠對葡萄糖更加耐受。McPherron等研究發(fā)現(xiàn)，在MSTN突變的小鼠動物模型中，該基因的缺失在導致小鼠肌肉增加的同時會減少脂肪的沉積，相反，MSTN基因的過度表達則會引起小鼠肌肉萎縮，脂肪積累量明顯增加[11]。

4 MSTN基因的作用機制

TGF-β 是一類結(jié)構(gòu)相關(guān)的轉(zhuǎn)化生長因子，廣泛參加機體內(nèi)的各種代謝活動，主要通過Smad 蛋白傳遞信號，傳導過程受到多層次的精密調(diào)控，TGF-β與含有胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域的細胞膜受體結(jié)合，形成磷酸化Smad 家族蛋白的復合物?；钚許mad 進入細胞核，附著在DNA 上并招募控制基因表達的轉(zhuǎn)錄激活劑。Smad2 和Smad3 以及Smad4 參與MSTN代謝途徑，誘導信號傳導。Smad7 和Smurf 參與信號傳導抑制，其中Smad7 被肌肉生長抑制素激活，并以反饋方式抑制MSTN 信號傳導[12]。MSTN 的信號傳導通路主要參與骨骼肌肥大的調(diào)控。除了經(jīng)典的Smad蛋白信號傳導機制外，MSTN也可以通過MAPK信號通路和PI3k-AKT信號通路發(fā)揮作用。

5 MSTN基因在重要經(jīng)濟動物育種中的研究進展

肌纖維是構(gòu)成肌肉組織的基本單位，其數(shù)量、類型和密度與動物的產(chǎn)肉率息息相關(guān)。研究表明，MSTN基因全程參與家畜的肌肉發(fā)育與生長，在胚胎期和出生后都對家畜整體肌肉含量與比例起到?jīng)Q定性作用。

5.1 MSTN多態(tài)性研究

MSTN在哺乳動物中高度保守，同時也具有豐富的突變。MSTN基因突變小鼠的肌肉可以增加2倍以上，該基因突變在牛、綿羊和豬中同樣表現(xiàn)出了肌肉異常發(fā)達和脂肪減少的雙肌表型。在20世紀80年代，有學者在比利時藍牛的單基因測定結(jié)果中首次證實了MSTN基因功能喪失導致其雙肌表型的出現(xiàn)，結(jié)果顯示比利時藍牛MSTN等位基因開放閱讀框中11個堿基的缺失導致3個氨基酸的丟失，在氨基酸274之后發(fā)生移碼并在氨基酸287后創(chuàng)建了一個終止密碼子。這種突變導致蛋白質(zhì)鏈縮短，從而喪失了MSTN蛋白質(zhì)的原有功能，使得比利時藍牛骨骼肌的重量是正常肉牛品種的1.6倍，并且由于瘦肉含量較高且口感適應而受到了廣大消費者的青睞。隨后陸續(xù)又有大約20種不同類型的MSTN基因遺傳變異（缺失、插入和單核苷酸多態(tài)性）在牛中被鑒定。這些多態(tài)性均可作為肉牛提高肉質(zhì)和產(chǎn)肉數(shù)量的分子標記。在這些MSTN突變的比利時藍牛中，由于脂肪減少，肌肉質(zhì)量增加，骨骼比例減少，結(jié)締組織減少，從而導致牛肉嫩度提升，肉質(zhì)特性也更加優(yōu)越[13]。但是，在日常生產(chǎn)中，雙肌牛也經(jīng)常觀察到與難產(chǎn)相關(guān)的問題，因為MSTN對于肌肉發(fā)育的調(diào)控是在出生前就發(fā)揮作用的，因而導致純合子雙肌犢牛的出生體重相比雜合子犢牛要大得多，突變帶來了犢牛生產(chǎn)過程中的一系列不利影響，例如：妊娠期延長，奶牛生育能力下降或者出現(xiàn)難產(chǎn)和死產(chǎn)犢牛的現(xiàn)象。所以在實際生產(chǎn)中，在追求雙肌表型的同時，也要考慮通過交配獲得MSTN雜合子動物進而減少出生牛犢的死亡概率。

綿羊的MSTN基因位于2號染色體的長臂末端，在過去的十年里，在不同的綿羊中報道的MSTN SNPs大多數(shù)位于該基因的非編碼區(qū)。比利時的特克賽爾羊肌纖維粗大，可以生產(chǎn)出產(chǎn)量更高、瘦肉率更高且脂肪含量更低的胴體，因此被廣泛用作終端雜交品種。對特克賽爾綿羊進行的數(shù)量性狀基因座分析表明，在第2號染色體上MSTN的3’非翻譯區(qū)有一個變異（g.6723G ＞A），該變異對肌肉質(zhì)量有顯著影響。這為在骨骼肌中高度表達的miR1和miR206創(chuàng)建了一個靶點，此外還發(fā)現(xiàn)了其他遺傳變異，包括c.1232A、g.391G ＞T和18個其他SNPs[14]。Han等采用聚合酶鏈式反應-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析和DNA測序技術(shù)對新西蘭綿羊品種的MSTN基因多態(tài)性進行研究共發(fā)現(xiàn)了27個核苷酸突變。其中3個位于啟動子區(qū)域，3個位于5’非編碼區(qū)，11個位于1號內(nèi)含子，5個位于2號內(nèi)含子，5個位于3’非編碼區(qū)[15]。

Jiang等人報道了豬MSTN基因的三個SNPs：T ＞A、G ＞A和C ＞T，只有一個突變（MSTN：G.383T ＞A）與約克夏豬生長期的平均日增重有關(guān)，且具有雜合突變豬的體重更大[16]。比利時皮特蘭豬的肌肉表型異常發(fā)達，Stinckens等人將其MSTN序列與其他五個品種的豬進行了比較，共發(fā)現(xiàn)15個多態(tài)性位點，其中位于啟動子區(qū)域g.447A ＞G多態(tài)性在皮特蘭豬中具有很高的等位基因頻率，g.879T ＞A多態(tài)性僅在中國梅山豬中出現(xiàn)[17]。然而，迄今為止在豬中發(fā)現(xiàn)的MSTN 自然遺傳變異與肌肉表型沒有顯著關(guān)聯(lián)。

5.2 MSTN基因編輯研究

牛、羊、豬等畜牧經(jīng)濟物種最主要追求的經(jīng)濟目標是提高其產(chǎn)肉效率，因而對肌肉發(fā)育調(diào)控起到負向調(diào)節(jié)作用的MSTN基因成為了科研人員重點關(guān)注的基因。隨著該基因結(jié)構(gòu)特點和生物學功能的明晰，同時體細胞核移植技術(shù)和基因編輯技術(shù)的高速發(fā)展與成熟，越來越多的科研人員試圖通過當前主流的基因編輯技術(shù)對動物個體的MSTN基因進行改造。

2012年，Tessanne等人開展了MSTN基因沉默轉(zhuǎn)基因牛的生產(chǎn)研究，成功獲得了5頭轉(zhuǎn)基因牛，其中3頭牛實現(xiàn)了MSTN的沉默表達[18]。Gim等在最近的研究中利用電穿孔技術(shù)對胚胎進行額外基因編輯。將MSTN公母牛體外受精產(chǎn)生的胚胎移植到代孕母牛體內(nèi)，成功產(chǎn)犢1頭。F1代犢牛測序顯示MSTN雜合突變，無健康問題[19]。Qian等人使用鋅指核酸酶技術(shù)結(jié)合體細胞核移植培育出MSTN缺失型梅山豬，其后代表現(xiàn)出顯著的雙肌表型，特別是后驅(qū)異常發(fā)達，肌肉質(zhì)量較野生豬相比增加了50%～100%，但肌纖維尺寸卻比也野生豬還要小[20]。說明該雙肌表型的形成主要依賴于MSTN突變引起的肌纖維數(shù)量顯著增多。

基因編輯技術(shù)的應用已成功獲得多個MSTN敲除綿羊，大多數(shù)均是結(jié)合原核注射技術(shù)獲得的編輯個體，但這種方式容易獲得嵌合體。于是開始嘗試SCNT的方式獲得純合基因編輯綿羊，研究者首先需要分別通過ZFN、TALEN或CRISPR∕Cas9基因編輯技術(shù)獲得MSTN-KO精準編輯的細胞系，并產(chǎn)出MSTN基因編輯純合綿羊[21]。這些發(fā)生基因編輯的細胞系的狀態(tài)和形態(tài)與普通細胞相比沒有顯著差異，而個體與野生型綿羊相比，體重增加，骨骼肌纖維肥大，且表現(xiàn)雙肌性狀。Wang等利用CRISPR∕Cas9技術(shù)實現(xiàn)了山羊和綿羊MSTN基因的基因編輯，成功獲得了體重增加、肌纖維尺寸增大且不影響肉質(zhì)的動物個體[22-23]。這些證據(jù)表明破壞動物MSTN的功能可以有效地增加肌肉質(zhì)量、提高產(chǎn)肉量，而且MSTN基因突變和表達水平下調(diào)不會影響肉質(zhì)。

6 展望

MSTN基因一直是畜牧產(chǎn)業(yè)中調(diào)節(jié)家畜肉類產(chǎn)量的主效基因，目前的研究主要集中在通過基因敲除MSTN基因的方法實現(xiàn)動物肌肉總量的提升，且大多數(shù)成功獲得極顯著雙肌表型的研究多為集中在模式動物小鼠上的，在大型動物（牛、羊和豬）的研究成功率還有待提升。因此，需要我們更多的了解大型哺乳動物肌肉生長的調(diào)控機制，同時開展更加有針對產(chǎn)后個體的MSTN基因抑制，進而發(fā)揮該基因在重要經(jīng)濟動物肌肉發(fā)育領(lǐng)域的調(diào)節(jié)作用。

此外，肌肉生長抑制素的作用不僅限于骨骼肌本身，還在調(diào)控脂肪、骨骼形成，參與肌肉、脂肪等生物學過程中同樣發(fā)揮重要作用。因此，在實際的育種工作中，簡單粗暴地完全敲除MSTN 基因可能會影響到動物體的其他生長發(fā)育指標。除了基因編輯，研究者還嘗試了許多其他的策略來下調(diào)或阻斷MSTN 的活性。包括過量表達肌抑素氨基端的LAP、過量表達卵泡抑制素（Follistatin）、過量表達顯性負ActRⅡB受體、使用肌抑素的單克隆抗體和采用RNAi技術(shù)直接干擾肌抑素基因的表達都能不同程度地緩解肌抑素的作用，從而刺激肌肉的發(fā)育。

研究表明動物的雙肌表型主要表現(xiàn)在肌纖維的數(shù)量以及肌纖維體積的增粗，在動物出生后肌纖維的數(shù)量就相對恒定，出生后肌肉產(chǎn)量完全取決于營養(yǎng)以及運動這兩種狀態(tài)來達到肌肉的增產(chǎn)。MSTN 基因在胚胎期，尤其是成肌細胞分化期間表達量高，動物出生后MSTN 的表達一直維持在較低的豐度。因此，在未來的研究中還可以嘗試從動物發(fā)育的胚胎期著手，在中胚層肌肉發(fā)育的關(guān)鍵時期進行動物母體介導調(diào)控調(diào)控胎兒的MSTN基因表達，從而在不影響MSTN基因其他重要生物學功能正常行使的情況下達到調(diào)節(jié)動物肌肉發(fā)育的目的。