AKR1B10 通過(guò)靶向糖酵解途徑對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

湯曉青 ,郭璽 ,萬(wàn)焱 ,王潔 ,徐斌 ,陳瑾 ,黨富濤,付海艷,羅煜

昆明市第三人民醫(yī)院,云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學(xué)中心1腫瘤科,2醫(yī)務(wù)科 昆明市,650041

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC) 是最常見(jiàn)的惡性腫瘤,在全球癌癥相關(guān)死亡中排名第四[1]。HCC 的主要原因是肝硬化,它主要是由乙型肝炎、丙型肝炎感染、飲酒過(guò)度等因素引起[2]。目前,HCC 的常規(guī)治療包括放療、化療、部分手術(shù)和肝移植,由于治療過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)各種并發(fā)癥,HCC 患者的5 年生存率仍然很低[3-4]。因此,闡明HCC 發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)于開(kāi)發(fā)更有效的治療方案尤為重要。

代謝重編程是腫瘤的一個(gè)重要特征[5-6]。Warburg 效應(yīng)表明,即使在充足的氧氣條件下,大多數(shù)腫瘤細(xì)胞也依賴(lài)糖酵解來(lái)產(chǎn)生能量[7]。能量代謝的改變已被認(rèn)為是解釋腫瘤細(xì)胞典型的快速增殖、轉(zhuǎn)移和化學(xué)抗性的關(guān)鍵機(jī)制[8]。因此,該關(guān)鍵特征為癌癥的治療干預(yù)提供了新的靶點(diǎn)。越來(lái)越多的研究證實(shí)抑制糖酵解成為癌癥治療的新策略,例如Ma 等[9]研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA FGF13-AS1 通過(guò)FGF13-AS1/胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA 結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor 2 mRNA binding proteins,IGF2 BPs)/骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因(myelocytomatosis,MYC) 軸抑制乳腺癌細(xì)胞的糖酵解和干細(xì)胞特性發(fā)揮腫瘤抑制作用。Qin 等[10]研究發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5 (protein arginine methyltransferase 5,PRMT5) 通過(guò)F-box 和WD 重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白7 (F-box and WD repeat domain-containing 7,FBW7)/MYC 軸通過(guò)調(diào)節(jié)糖酵解促進(jìn)胰腺癌的發(fā)展。

另外,在HCC 中的研究發(fā)現(xiàn),熱休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90) 通過(guò)M2 型丙酮酸激酶 (recombinant pyruvate kinase isozymes M,PKM2) 促進(jìn)肝癌細(xì)胞的糖酵解過(guò)程,從而促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[11]。以上這些結(jié)果提示糖酵解與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。值得注意的是,目前關(guān)于HCC 進(jìn)展與糖酵解的之間關(guān)系尚未完全明晰,因此,本研究旨在深入探究肝癌與糖酵解的關(guān)系。

醛酮還原酶家族1 成員B10 (aldo-keto reductase family 1 member B10,AKR1B10),是人類(lèi)醛酮還原酶 (aldo-keto reductase,AKR) 超家族的一員,通過(guò)將醛酮羰基化合物還原為醇來(lái)保護(hù)細(xì)胞[12]。AKR1B10 通過(guò)穩(wěn)定乙酰輔酶A 羧化酶α[13]來(lái)調(diào)節(jié)脂質(zhì)的合成,在癌癥脂質(zhì)代謝中發(fā)揮中心作用。在最近的研究中,AKR1B10 被報(bào)道可能參與許多癌癥的發(fā)生發(fā)展,其高表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者和胃癌患者預(yù)后不佳密切相關(guān)[14-15]。據(jù)報(bào)道,AKR1B10 通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B,AKT)/核因子κB (nuclear factor kappa-B,NF-κB) 信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移[16]。另一項(xiàng)研究報(bào)道,甲基轉(zhuǎn)移酶樣3 (methyltransferase like 3,METTL3) 通過(guò)介導(dǎo)AKR1B10的N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A) 修飾促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖和糖酵解[17]。盡管有諸多研究證實(shí)AKR1B10 在多種癌癥的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,但關(guān)于AKR1B10 在HCC 細(xì)胞糖酵解中的詳細(xì)功能和潛在分子機(jī)制尚不清楚。

1 材料方法

1.1 生信分析

從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov/) 下載HCC 的mRNA 數(shù)據(jù)(正常樣本50個(gè),癌癥樣本374 個(gè)) 的表達(dá)量數(shù)據(jù)。通過(guò)edgeR差異分析(| logFC | ＞2,Padj＜0.05),獲得差異表達(dá)mRNA,通過(guò)查閱文獻(xiàn)確定研究對(duì)象為AKR1B10。分析AKR1B10 在癌癥組織中的表達(dá)情況。對(duì)目的基因進(jìn)行GSEA 通路富集分析。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

人HCC 細(xì)胞HepG2、HCCLM3、Hep3B 和人正常肝細(xì)胞系L-02 均購(gòu)自青旗生物技術(shù)發(fā)展有限公司(China)。將上述細(xì)胞系在含10 %胎牛血清(FBS) 的DMEM 培養(yǎng)基中于37 ℃,5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

si-AKR1B10、oe-AKR1B10 以及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照購(gòu)自于Ribobio (China)。2-DG (20 mmol/L)和DMSO (20 mmol/L) 均購(gòu)自Sigma (USA)。使用Lipofectamine 2000 試劑盒(Thermo Fisher Scientific,USA),并根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HCC 細(xì)胞中。

1.3 qRT-PCR

利用Trizol 法提取總RNA,RNA (1 mg) 通過(guò)Qiagen One-Step RT-PCR kit (Qiagen Gmbh,Germany) 一步逆轉(zhuǎn)錄法將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA 并進(jìn)行qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)。具體引物序列如表1 所示。

表1 引物序列

1.4 蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)

加入裂解液從細(xì)胞中提取總蛋白,然后進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白。隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上后,使用5 %脫脂奶粉封閉1 h。將膜與一抗4 ℃孵育過(guò)夜,然后和二抗孵育2 h,使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL) 底物試劑盒以及凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白表達(dá)。本研究使用的抗體包括: 一抗兔抗 AKR1B10 (1 ∶1 000,ab192865,Abcam,UK)、β-actin (1 ∶ 1 000,ab179467,Abcam,UK);二抗山羊抗兔IgG (1 ∶2 000,ab205718,Abcam,UK)。

1.5 CCK-8

細(xì)胞以2 ×103個(gè)/孔的密度接種到96 孔板中,并孵育0、24、48、72 和96 h。加入10 μL CCK-8溶液(Sigma,USA),繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4 h。用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)吸光度。

1.6 Transwell

將細(xì)胞接種到Transwell 實(shí)驗(yàn)裝置(Corning,USA) 的上室(無(wú)血清培養(yǎng)基),隨后在下室加入含有10 % FBS 的PRMI-1640 培養(yǎng)基,在37 ℃下培養(yǎng)1 d 后,除去上室中未遷移的細(xì)胞。用4 %多聚甲醛固定遷移的細(xì)胞,用結(jié)晶紫染色30 min。在顯微鏡下觀察并計(jì)算細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè),在向上室接種細(xì)胞前,先在上室底部涂抹30 μL 的Matrigel,其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)基本一致。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)

對(duì)于HCC 細(xì)胞凋亡水平的測(cè)定,將各組細(xì)胞正常消化后,用PBS 洗滌細(xì)胞兩次,然后在500 μL 結(jié)合緩沖液中重新懸浮,與5 μL Annexin VFITC 和10 μL PI 混合,并在室溫下暗染色15 min。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)[FCM,BD FACS Calibur,?？松?北京) 科技有限公司,China] 檢測(cè)凋亡率。

1.8 糖酵解途徑活性的測(cè)定

使用Seahorse Biosciences XF96 分析儀檢測(cè)糖酵解能力和耗氧量。細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中24 h,然后在37 ℃的XF 培養(yǎng)基中孵育2 h。按照XF Cell Mito Stress Test Profile 操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè)耗氧率(oxygen consumption rate,OCR)。按照XF Glycolysis Stress Test Profile 操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè)胞外酸化率(extracellular acidification rate,ECAR)。

1.9 丙酮酸、乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸水平檢測(cè)

根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū),使用丙酮酸檢測(cè)試劑盒(Catl.No.A081) 檢測(cè)丙酮酸的產(chǎn)生,使用乳酸檢測(cè)試劑盒(Catl.No.K951) 檢測(cè)乳酸的產(chǎn)生,使用檸檬酸檢測(cè)試劑盒(Catl.No.A128) 檢測(cè)檸檬酸的產(chǎn)生,使用蘋(píng)果酸檢測(cè)試劑盒(Catl No.K637) 檢測(cè)蘋(píng)果酸的產(chǎn)生。乳酸檢測(cè)試劑盒和蘋(píng)果酸檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自BioVision (USA),丙酮酸檢測(cè)試劑盒和檸檬酸檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所(中國(guó))。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

本研究的數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD) 表示,并使用GraphPad Prism 進(jìn)行分析并繪圖。本研究所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。多組間差異均使用ANOVA 方差分析檢驗(yàn)差異顯著性,兩組間差異的比較均使用Studentt-test 檢驗(yàn)差異的顯著性。P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AKR1B10 在HCC 組織和細(xì)胞中顯著上調(diào)

從TCGA-HCC 數(shù)據(jù)下載mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù),進(jìn)行差異分析,結(jié)果顯示AKR1B10 在HCC 組織中高表達(dá)(圖1A)。利用qRT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)AKR1B10 在HCC 細(xì)胞系HepG2、HCCLM3、Hep3B 中顯著上調(diào) (圖1B、C),其在HepG2 細(xì)胞中的表達(dá)最高,在HCCLM3 細(xì)胞中表達(dá)最低,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇這兩個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。以上結(jié)果表明AKR1B10 在HCC組織和細(xì)胞中顯著高表達(dá)。

圖1 AKR1B10 在HCC 組織和細(xì)胞中顯著上調(diào)

2.2 敲低AKR1B10 抑制HCC 細(xì)胞的惡性進(jìn)展

我們基于HepG2 細(xì)胞構(gòu)建AKR1B10 敲低表達(dá)的HCC 細(xì)胞,基于HCCLM3 細(xì)胞構(gòu)建AKR1B10過(guò)表達(dá)的HCC 細(xì)胞,并利用qRT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率(圖2A、B)。CCK-8 和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲低AKR1B10 顯著下降會(huì)顯著降低HCC 細(xì)胞的細(xì)胞活力、遷移和侵襲能力(圖2C～G)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示敲低AKR1B10 后細(xì)胞凋亡比例顯著提高,而過(guò)表達(dá)AKR1B10 則顯著抑制細(xì)胞凋亡率(圖2H)。以上結(jié)果表明敲低AKR1B10 能抑制HCC 細(xì)胞的細(xì)胞活力、遷移和侵襲,并促進(jìn)凋亡。

圖2 敲低AKR1B10 抑制HCC 細(xì)胞的惡性進(jìn)展

2.3 AKR1B10 促進(jìn)HCC 細(xì)胞糖酵解途徑

為了進(jìn)一步探究AKR1B10 影響HCC 細(xì)胞惡性行為的潛在機(jī)制,通過(guò)GSEA 通路富集分析發(fā)現(xiàn),AKR1B10 高表達(dá)可能參與糖酵解/糖異生通路(圖3A)。由此猜測(cè)AKR1B10 可能影響HCC 細(xì)胞糖酵解。因此,我們采用qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞中糖酵解代謝途徑相關(guān)的特定基因MYC、HK2、PGK1 的表達(dá)水平,結(jié)果表明與si-NC 相比,si-AKR1B10 組細(xì)胞中的MYC、HK2 和PGK1 的表達(dá)顯著降低(圖3B)。利用 Seahorse XP96 分析 si-NC 和 si-AKR1B10 組細(xì)胞的ECAR 和OCR 后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比,si-AKR1B10 組細(xì)胞中ECAR 顯著降低,說(shuō)明AKR1B10 敲低表達(dá)能夠顯著抑制HepG2 細(xì)胞糖酵解(圖3C)。而si-AKR1B10 組細(xì)胞中OCR 增高,說(shuō)明AKR1B10 敲低表達(dá)能夠顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞的線粒體氧化呼吸(圖3D)。利用試劑盒檢測(cè)HepG2 細(xì)胞中丙酮酸、乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比,敲低AKR1B10 抑制了HepG2 細(xì)胞中丙酮酸、乳酸、檸檬酸和蘋(píng)果酸的產(chǎn)生,說(shuō)明敲低AKR1B10 可以導(dǎo)致HepG2 細(xì)胞糖酵解過(guò)程阻斷(圖3E～H)。以上結(jié)果表明,敲低AKR1B10 可以抑制HepG2 細(xì)胞糖酵解。

圖3 敲低AKR1B10 可以抑制HepG2 細(xì)胞糖酵解

2.4 AKR1B10 通過(guò)靶向糖酵解途徑促進(jìn)HCC 細(xì)胞惡性進(jìn)展

為了探究AKR1B10 是否通過(guò)靶向糖酵解途徑影響HCC 細(xì)胞惡性進(jìn)展。我們?cè)O(shè)置如下分組: oe-NC+DMSO 組、oe-AKR1B10+DMSO 組、oe-AKR1B10 +2-DG 組。qRT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡分析表明,與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)AKR1B10 可以提高細(xì)胞中AKR1B10 的表達(dá)(圖4A、B)。CCK-8 實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)表明,過(guò)表達(dá)AKR1B10 使HCC細(xì)胞的細(xì)胞活力、遷移和侵襲能力顯著下降;而進(jìn)一步添加2-DG 可以逆轉(zhuǎn)以上過(guò)表達(dá)AKR1B10 對(duì)HCC 細(xì)胞表型的影響(圖4C～E)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)AKR1B10 后細(xì)胞凋亡比例顯著下降,而過(guò)表達(dá)AKR1B10 的同時(shí)添加2-DG 可以使HCC 細(xì)胞凋亡率回復(fù)到對(duì)照組水平(圖4F)。綜上,AKR1B10 通過(guò)靶向糖酵解途徑促進(jìn)HCC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,并抑制細(xì)胞凋亡。

圖4 AKR1B10 通過(guò)靶向糖酵解途徑促進(jìn)HCC 細(xì)胞惡性進(jìn)展

3 討論

AKR1B 亞群與許多疾病有關(guān),如糖尿病和癌癥。AKR1B10 是AKR1B 中包含的亞組之一[18]。AKR1B10 主要在消化道組織中表達(dá),如胃、小腸和結(jié)直腸。在肝臟、胸腺和前列腺中,表達(dá)可能較低,但在其他正常組織中,表達(dá)為零[18-21]。此外,研究發(fā)現(xiàn),AKR1B10 對(duì)包括視黃醛[22]和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物在內(nèi)的底物具有酶活性[23]。

AKR1B10 對(duì)腫瘤的發(fā)展是不可或缺的,是一些腫瘤的診斷生物標(biāo)志物[24]。據(jù)報(bào)道,AKR1B10高表達(dá)與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較差的預(yù)后相關(guān),同時(shí)新輔助化療的反應(yīng)較差,這表明AKR1B10 可能是局部進(jìn)展期癌癥治療反應(yīng)的潛在預(yù)測(cè)因子[25]。因此,抑制AKR1B10 可能是一種理想的治療策略[26-27]。最近,一種廣泛用于腫瘤治療的AKR1B10 抑制劑最近引起了越來(lái)越多的關(guān)注[28-30]。Jin 等[31]報(bào)道AKR1B10 抑制劑增強(qiáng)索拉非尼對(duì)肝癌移植瘤的抑制作用。這些發(fā)現(xiàn)引起了研究人員的注意,并導(dǎo)致AKR1B10 靶向抑制對(duì)腫瘤細(xì)胞的不同作用[32-34]。

在本研究中,我們探討了AKR1B10 在HCC 中的作用及其分子機(jī)制。我們的結(jié)果表明,AKR1B10 在人HCC 組織和細(xì)胞系中的表達(dá)顯著上調(diào)。此外,沉默AKR1B10 抑制了HCC 細(xì)胞的細(xì)胞活力、遷移和侵襲,并抑制細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果與Li 等[35]報(bào)道的結(jié)果相似,該研究表明AKR1B10 通過(guò)激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK) 信號(hào)促進(jìn)乳腺癌癥細(xì)胞遷移和侵襲。以上這些結(jié)果提示AKR1B10 在HCC 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

本研究通過(guò)生信分析發(fā)現(xiàn)AKR1B10 高表達(dá)參與糖酵解信號(hào)通路。Warburg 等[36]研究發(fā)現(xiàn)即使在充足的氧氣條件下,大多數(shù)腫瘤細(xì)胞也依賴(lài)糖酵解途徑來(lái)提供能量。有氧糖酵解不僅可以給腫瘤細(xì)胞提供所需的能量,而且可以提供細(xì)胞合成所需的大量中間產(chǎn)物[37-38]。研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)癌細(xì)胞的糖酵解速率都有所增加,比正常細(xì)胞高200 倍[39]。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn),線粒體代謝功能失調(diào)被認(rèn)為是癌癥的主要原因[39]。因此,抑制糖酵解成為癌癥治療的新策略。Bai 等[40]研究發(fā)現(xiàn)溶質(zhì)載體家族25 成員 20 (solute carrier family 25 member 20,SLC25A51) 通過(guò)激活沉默調(diào)節(jié)蛋白5 (recombinant sirtuin 5,SIRT5) 的轉(zhuǎn)錄驅(qū)動(dòng)有氧糖酵解,從而促進(jìn)HCC 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Zhou 等[41]研究發(fā)現(xiàn)三磷酸鳥(niǎo)苷結(jié)合蛋白4 (guanosine triphosphate binding protein 4,GTPBP4) 通過(guò)PKM2 依賴(lài)性葡萄糖代謝促進(jìn)HCC 的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)AKR1B10 導(dǎo)致HCC 細(xì)胞的糖酵解水平和糖酵解能力顯著提高,并降低了細(xì)胞的基礎(chǔ)耗氧率和最大耗氧率。由此可知,AKR1B10 過(guò)表達(dá)可以通過(guò)調(diào)控HCC 細(xì)胞糖酵解,進(jìn)而促進(jìn)HCC 的發(fā)生和發(fā)展。我們的研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了Cui 等[42]和Chen 等[43]的研究,即AKR1B10 可以調(diào)控糖酵解控制HCC 細(xì)胞代謝重編程促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。

綜上所述,本研究表明AKR1B10 在HCC 中顯著上調(diào),AKR1B10 的下調(diào)可顯著抑制HCC 細(xì)胞有氧糖酵解,進(jìn)而抑制HCC 細(xì)胞的細(xì)胞活力、遷移和侵襲,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。雖然,本研究在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和論據(jù)上較為合理,但未從動(dòng)物和臨床層面上進(jìn)行驗(yàn)證,且沒(méi)有進(jìn)一步挖掘在肝癌中AKR1B10 所影響的下游信號(hào)通路及上游調(diào)控分子。因此本團(tuán)隊(duì)擬繼續(xù)挖掘AKR1B10 的下游的信號(hào)通路及上游潛在調(diào)控分子,并探究其在HCC 進(jìn)展中的功能。總之,我們的研究加深了我們對(duì)HCC 的發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的認(rèn)識(shí),這些發(fā)現(xiàn)表明AKR1B10 可能是治療HCC 的新靶點(diǎn)。