β-catenin 蛋白H36P 突變對肝癌細(xì)胞的增殖的影響

吳忠坤 ,宋平輝 ,張毅 ,李春博 ,李勤新

1陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院普通外科 陜西省咸陽市,712000 2興平市人民醫(yī)院兒科 陜西省興平市,713199

肝癌(liver cancer) 是一種起源于肝臟的惡性腫瘤,可分為原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌,其中后者更為常見[1-3]。肝癌在癌癥死亡中排名第三,在惡性腫瘤發(fā)病中排名第四,嚴(yán)重危害患者生命安全[4]。既往流行病學(xué)調(diào)查顯示,肝癌與寄生蟲、病毒性肝炎、飲酒等因素相關(guān)。但這些因素對肝癌發(fā)生和發(fā)展的影響機(jī)制尚未明晰。目前,已有大量針對肝癌發(fā)病機(jī)制的分子生物學(xué)研究,并取得一定成果。研究已證實(shí),肝癌發(fā)生發(fā)展與Wnt/β-catenin、PI3 K/Ras 信號(hào)通路異常、P53 調(diào)控的細(xì)胞周期異常、染色體重組、氧化應(yīng)激等機(jī)制明顯相關(guān)[5-8]。Guichard 等[9]研究結(jié)果顯示,肝癌中Wnt/β-catenin 信號(hào)通路異常的發(fā)生率最高,其占比超過30 %。其中,β-catenin 隸屬ARM 重復(fù)蛋白超家族,由CTNNB1 基因編碼。雖然這種蛋白在進(jìn)化上高度保守,但能通過Wnt/β-catenin 信號(hào)通路輸出信號(hào),并對下游效應(yīng)器功能產(chǎn)生多樣且廣泛的影響。既往研究表明,這條信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)在胚胎細(xì)胞、體細(xì)胞和肝細(xì)胞的生長過程中扮演重要角色,保證組織器官正常發(fā)育和再生[10-11]。其通路異常產(chǎn)生一系列連鎖反應(yīng),引起細(xì)胞異常生長發(fā)育,甚至發(fā)生癌變。近期Hirotsu 等[12]研究發(fā)現(xiàn),16 種肝癌突變基因中頻率最高的分別為TP53 和CTNNB1基因突變,其中CTNNB1 基因點(diǎn)突變以G34R 和H36P 為主。但目前鮮有關(guān)于H36P 位點(diǎn)突變的研究,因此本研究擬討論β-catenin 蛋白H36P 突變與肝癌細(xì)胞的增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝Huh7 和HepG2 細(xì)胞株及突變體G34R 和H36P 質(zhì)粒均購于上海雅吉生物科技有限公司。全部引物均由金斯瑞生物科技有限公司。主要實(shí)驗(yàn)試劑和藥品,包括細(xì)胞培養(yǎng)液(上海索萊寶生物科技有限公司)、電泳染料(武漢愛博泰克生物技術(shù)有限公司)、甲醇、乙酸等試劑(國藥集團(tuán))、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國QIAGEN 公司)、兔β-catenin 單克隆抗體(clone: ARC0136,武漢愛博泰克生物技術(shù)有限公司)、分子克隆試劑(美國Invitrogen 公司)、Taq DNA 聚合酶(美國Invitrogen 公司)、CCK-8 試劑盒(上海索萊寶生物科技有限公司) 等。

1.2 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

取出保存的Huh7、HepG2 細(xì)胞株后置于冰上解凍,完全解凍后1 000 r/min 離心5 min 移除上清,加入滅菌的新鮮培養(yǎng)基,吹打混合,混勻后移至6 cm 培養(yǎng)皿,細(xì)胞融合度達(dá)到80 %后傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)時(shí),使用DMEM 培養(yǎng)液(含10 %～15 %胎牛血清) 培養(yǎng),調(diào)整密度為3 ×106個(gè)/mL,置于37 ℃5 % CO2和95 %濕度下培養(yǎng),生長良好狀態(tài)下細(xì)胞單層貼壁生長。

1.3 構(gòu)建質(zhì)粒及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

CTNNB1 基因(NCBI Gene ID: 1499) 序列獲取自NCBI 官網(wǎng),并設(shè)計(jì)正反義引物鏈(F 鏈: 5′-CCTCCCAAGTCCTTTATGAATGG-3′,R 鏈: 5′-CCGTCAATATCAGCTACTTGCTCTT-3′)。通過PCR 擴(kuò)增法擴(kuò)增CTNNB1 基因外顯子序列,并通過雙酶切法克隆至p-CMV5 質(zhì)粒載體上。應(yīng)用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting,WB) 檢測蛋白表達(dá)檢測

使用蛋白質(zhì)印跡法檢測底物蛋白的表達(dá)情況。首先,抽提細(xì)胞樣品中的蛋白: ①將待處理細(xì)胞樣品冰上預(yù)冷,除去培養(yǎng)液后使用PBS 緩沖液沖洗;②按比例加入裂解液后冰上靜置5 min,超聲破碎處理后離心并移除上清。隨后,吸取微量處理好的樣品進(jìn)行蛋白濃度檢測。其余部分加入等量2×SDS Buffer,沸水浴10 min,蛋白變性后進(jìn)行WB分析。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.5 蛋白泛素化檢測

利用放線菌酮(cycloheximide,CHX) 法檢測底物(β-catenin 野生型和突變體G34R 和H36P)蛋白的降解。首先,將G34R 和H36P 突變體及WT 轉(zhuǎn)染至已培養(yǎng)的Huh7、HepG2 細(xì)胞株中。隨后每隔2 h 加入溶解在DMSO 中的CHX (100 μg/μL) 處理,提取樣品蛋白檢測其表達(dá)情況。

1.6 細(xì)胞增殖檢測

利用cell counting kit-8 (CCK-8) 法檢測細(xì)胞增殖。將處理好的細(xì)胞培養(yǎng)液中直接加入10 %體積的CCK-8,充分混合后加入10 μL 檢測試劑,培養(yǎng)1～4h。使用酶標(biāo)儀在A450nm下讀數(shù)并記錄結(jié)果,每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.7 蛋白核轉(zhuǎn)位檢測

使用蛋白提取試劑盒,分別抽提核蛋白、胞漿蛋白和總蛋白,使用WB 法檢測其表達(dá)情況。其中PARP 作為核蛋白內(nèi)參,GAPDH 作為全蛋白或胞漿蛋白內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝癌細(xì)胞中β-catenin 野生型及突變體的表達(dá)情況及其蛋白穩(wěn)定性

WB 法檢測空載對照vector、β-catenin 野生型WT-β-catenin、β-catenin 突變體G34R 和H36P 在HepG2 和Huh7 肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,突變體G34R、H36P 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平,與野生型β-catenin 無明顯差異(圖1)。

圖1 肝癌細(xì)胞株中野生型、突變型β-catenin 蛋白表達(dá)

CHX 實(shí)驗(yàn)檢測β-catenin 突變體在HepG2 和Huh7 肝癌細(xì)胞株中的泛素化降解情況。結(jié)果顯示,在HepG2 細(xì)胞株中,CHX 作用8 h 時(shí)WT-β-catenin幾乎完全降解,而G34R 和H36P 只降解了75 %和60 % (圖2A)。Huh7 細(xì)胞株中的情況類似,6 h時(shí)WT-β-catenin 幾乎完全降解,而G34R 和H36P只降解了約40 % (圖2B),以上結(jié)果均有顯著性差異(P＜0.05)。

圖2 β-catenin 泛素化降解量化統(tǒng)計(jì)

2.2 β-catenin 突變體對肝癌細(xì)胞增殖的影響

CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測β-catenin 突變體G34R、H36P 對HepG2 和Huh7 肝癌細(xì)胞株增殖的影響。CCK-8 細(xì)胞增殖計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn),相較于WT-βcatenin,G34R 和H36P 促使HepG2 及Huh7 細(xì)胞增殖提升(圖3)。

圖3 β-catenin 突變體對肝癌細(xì)胞增殖的影響

2.3 β-catenin 野生型和突變體在肝癌細(xì)胞中核轉(zhuǎn)位差異分析

分離細(xì)胞核質(zhì)分離進(jìn)行WB 分析了解突變體G34R、H36P 在HepG2 和Huh7 肝癌細(xì)胞株中核轉(zhuǎn)位情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與WT-β-catenin、突變體G34R 相比,突變體H36P 在肝癌細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)位明顯增加(圖4)。

圖4 β-catenin 野生型和突變體在肝癌細(xì)胞中核轉(zhuǎn)位情況

3 討論

既往研究表明,β-catenin 蛋白在Wnt/β-catenin 信號(hào)通路中扮演重要角色,在肝癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中均發(fā)揮不可替代的作用[13-15]。小鼠、大鼠和兔等動(dòng)物模型研究進(jìn)一步驗(yàn)證了β-catenin 蛋白的生物學(xué)功能。結(jié)果表明,β-catenin 蛋白對細(xì)胞增殖、分化、遷移和極化等功能均有影響[16]。另一方面研究發(fā)現(xiàn),肝癌的發(fā)生和發(fā)展期間Wnt/β-catenin 信號(hào)通路均呈現(xiàn)異常,其中β-catenin 蛋白表達(dá)也呈異常水平[16-18]。除此之外,不僅在肝癌組織,甚至在離體肝癌細(xì)胞株及其構(gòu)建的相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌模型中都存在β-catenin 的單個(gè)位點(diǎn)突變。本研究為了檢查突變體的蛋白表達(dá)水平,對比了對照質(zhì)粒、野生型、陽性對照突變體G34R 和新突變體H36P的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示,在HepG2 和Huh7 肝癌細(xì)胞株中,G34R 和H36P 蛋白表達(dá)水平與WTβ-catenin 無明顯差異。這可能是體外培養(yǎng)細(xì)胞中β-catenin 內(nèi)源性高水平表達(dá)的結(jié)果,因而抑制了外源性β-catenin 的表達(dá)。

雖上述實(shí)驗(yàn)未見β-catenin 野生型及其突變體的蛋白表達(dá)水平差異,但其蛋白結(jié)構(gòu)可能發(fā)生改變。因此接下來,本研究檢測了突變體β-catenin蛋白在肝癌細(xì)胞株中的泛素化降解情況。按時(shí)間梯度加入核糖體轉(zhuǎn)錄抑制劑CHX 處理,以分析蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示,CHX 作用6～8 h 后,WTβ-catenin 蛋白幾乎完全降解,而H36P 蛋白僅降解了20 %～39 %,與同時(shí)間段陽性對照G34R 水平類似。這說明,H36P 在肝癌細(xì)胞中的泛素化降解過程受到了較大程度的抑制,也再次證實(shí)了H36P蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性。本研究推測這可能是蛋白的空間分布改變的結(jié)果。為了了解H36P 在肝癌細(xì)胞中核轉(zhuǎn)位的情況,本研究分離了細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,WB 檢測β-catenin 在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的水平。結(jié)果表明,H36P 突變體在肝癌細(xì)胞的細(xì)胞核中的水平明顯高于野生型β-catenin。CCK-8 計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,相較于WT-β-catenin,H36P 更加明顯地促使HepG2 和Huh7 細(xì)胞存活率(A值) 的變化。且在浸染72 h 內(nèi),H36P 對上述細(xì)胞存活率的影響也較陽性對照G34R 更為明顯。上述結(jié)果均說明,H36P 促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述,β-catenin 蛋白H36P 突變蛋白表達(dá)穩(wěn)定、泛素化降解過程受阻、核轉(zhuǎn)位情況增多,并能促進(jìn)HepG2 和Huh7 肝癌細(xì)胞的增殖。

雖然本研究發(fā)現(xiàn)β-catenin 蛋白突變體H36P 在肝癌細(xì)胞中具有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的作用。但本研究未了解H36P 泛素化降解受阻過程的具體機(jī)制,及H36P 與Wnt/β-catenin 信號(hào)通路中其他關(guān)鍵蛋白的相互作用情況。因此在下一步的研究中,擬探究突變體在信號(hào)通路中的作用。