干擾LncRNA BCYRN1 對乳腺癌MCF-7 細胞增殖、運動和移植瘤生長的影響

吉棚 ,趙華山 ,王晨 ,劉淑榮 ,馬建增

陽光融和醫(yī)院1乳腺甲狀腺外科,2腫瘤內(nèi)科 山東省濰坊市,261000

乳腺癌是乳腺上皮細胞癌變引起的惡性腫瘤,雖然我國屬于乳腺癌低發(fā)區(qū)域,但近年來我國乳腺癌發(fā)病年齡趨向年輕化[1-2]。目前對于乳腺癌的治療主要以手術(shù)切除為主,雖然輔助化療能夠顯著提高乳腺癌患者的治療效果[3-4],但外科創(chuàng)傷、化療也會對癌癥患者身體帶來創(chuàng)傷,對乳腺癌發(fā)病、進展相關(guān)基因作用機制的研究有助于治療藥物研發(fā),為癌癥疾病治療提供新的思路[5]。長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA,LncRNA) 是參與腫瘤細胞生物學行為過程的無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子,有研究顯示LncRNA BCYRN1 在肺腺癌細胞中表達上調(diào),還能影響肺腺癌細胞周期阻滯、侵襲和遷移能力,LncRNA BCYRN1 高表達患者的預(yù)后較差[6]。但LncRNA BCYRN1 在乳腺癌中的作用機理研究較少,本研究借助短發(fā)卡RNA (short hairpin RNA,shRNA) 技術(shù)沉默BCYRN 表達,探討shRNA 干擾LncRNA BCYRN1 對乳腺癌MCF-7 細胞行為、移植瘤生長的影響及其潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 組織樣本、實驗細胞及動物

乳腺癌組織及癌旁組織源于本院行乳腺癌根治術(shù)切除組織,共計30 例,乳腺癌患者年齡25～46歲,平均(35.3 ±5.9) 歲。乳腺癌細胞株MCF-7購自中國科學院細胞庫;SPF 級3 周齡雌性裸鼠40只購自濰坊醫(yī)學院[SCXK (魯) 20200001],體重(20 ±4) g。

1.2 主要試劑與儀器

Ki67 抗體(貨號: ab 245113;批號20190209)、E-鈣粘蛋白(E-cadherin) 抗體(貨號: ab 194982;批號: 20190408)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin) 抗體(貨號: ab 198496;批號: 20190601)、波形蛋白(Vimentin) 抗體(貨號: ab92547;批號20190411) 均購自艾博抗(上海) 貿(mào)易有限公司;山羊抗大鼠IgG熒光二抗(貨號: E-AB-1021) 購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;Lipofectamine?2000 購自上海研謹生物科技有限公司;RPMI1640 培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、絲裂霉素均購自美國sigma 公司;TRIzol 試劑購自Thermo Fisher 公司。

細胞培養(yǎng)箱購自美國Forma 公司;低溫離心機購自德國eppendorf 公司;切片機、英冠顯微鏡購自德國Leica 公司;實時熒光定量PCR 儀購自美國伯樂公司。

1.3 細胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染

將乳腺癌MCF-7 細胞放于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(37 ℃、5 % CO2),RPMI1640 培養(yǎng)基含有10 %FBS、100 U/mL 青霉素、鏈霉素。將乳腺癌MCF-7 細胞分為空白對照組(Control)、陰性對照組(shRNA-NC)和干擾組(sh-BCYRN1),用于后續(xù)實驗,按照說明書,將sh-BCYRN1 穩(wěn)定表達下調(diào)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染干擾組細胞,將無義序列shRNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染陰性對照組細胞,培養(yǎng)48 h,使用RT-PCR 檢測細胞BCYRN1 表達。

1.4 實時定量PCR (real-time quantitative PCR,RTPCR) 檢測BCYRN1 相對表達量

Trizol 提取細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 鏈,以此鏈為模板,采用定量PCR 儀擴增,以GADPH為內(nèi)參照基因,95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性8 s,58 ℃退火35 s,72 ℃延伸40 s,40 個循環(huán)。目的基因表達相對值RQ=2-ΔΔCt。引物由TAKARA 公司合成,β-肌動蛋白(β-actin) 上游引物5′-CTCAGACACCATGGGGAGGTGA-3′,下游引物 5′-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3′;BCYRN1 上游引物5′-AGACCTGCCTGGGCAATATAG-3′,下游引物5′-GTTGTTGCTTTGAGGGAAGTTACG-3′。

1.5 Edu 法檢測細胞增殖

使用Edu 法檢測細胞增殖,詳細操作參考文獻[7],在400 倍顯微鏡下觀察Edu 陽性細胞數(shù)。

1.6 Transwell 檢測細胞侵襲情況

取對數(shù)生長期細胞并將密度調(diào)整為1 ×105個/mL,將細胞接種至Transwell 小室(上室為無血清培養(yǎng)基、下室為含血清培養(yǎng)基),24 h 后,4 %多聚甲醛固定細胞,0.1 %結(jié)晶紫染色細胞,高倍鏡下選取3 個不重疊視野對染色細胞進行拍照,重復3 次,統(tǒng)計細胞數(shù)。

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

將細胞接種至24 孔板(5 ×105個/孔),按照上述細胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)24 h,全培養(yǎng)基潤洗,加入10 μmol/L 絲裂霉素,培養(yǎng)2 h,加入完全培養(yǎng)基,分別在0 h 和24 h 時拍照,重復3 次。

1.8 免疫熒光檢測Vimentin 表達

待細胞貼壁生長后,收集細胞涂片,4 %多聚甲醛固定15 min,Triton X-100 透膜10 min,正常非免疫兔血清封閉30 min,加入大鼠抗人Vimentin一抗稀釋液(1∶100) 4 ℃過夜,每張涂片滴加山羊抗大鼠IgG 熒光二抗稀釋液(1∶400) 37 ℃反應(yīng)30 min,晾干后抗熒光猝滅封片劑封固,于熒光顯微鏡觀察細胞Vimentin 表達。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting) 檢測蛋白表達水平

待細胞貼壁生長后使用胰蛋白酶處理,提取總蛋白,10 %的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳在100 V電壓分離,0.65 mA/cm2恒定電流轉(zhuǎn)移1.5 h 至聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene fluoride,PVDF) 膜,使用5 %的脫脂奶粉恒溫封閉2 h,加入各需要檢測蛋白的一抗、二抗,孵育2 h,Tris 緩沖鹽水與吐溫20 (Tris Buffered Saline with Tween 20,TBST)洗凈,以β-actin 為內(nèi)參蛋白,實驗重復3 次。

1.10 裸鼠體內(nèi)移植瘤實驗

收集對數(shù)期的MCF-7 細胞,將MCF-7 細胞懸液(3.5 ×107個/mL) 于裸鼠腋下注射,4 μL/只,待成瘤后(成瘤標準: 移植瘤直徑＞5 mm),將成瘤裸鼠隨機數(shù)字表法分為空白對照組(Control)和干擾組(sh BCYRN1),每組各20 只,干擾組、空白對照組分別給予sh-BCYRN1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、無義序列shRNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染移植瘤,繼續(xù)飼養(yǎng)4 周,麻醉處死裸鼠,分離移植瘤,RT-PCR 檢測移植瘤BCYRN1 表達,稱重腫瘤質(zhì)量,蛋白質(zhì)印跡法檢測移植瘤Ki67、N-cadherin 蛋白表達。

1.11 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗;兩組間差異比較用t檢驗;檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織及癌旁組織BCYRN1 表達情況及轉(zhuǎn)染效率檢測結(jié)果

乳腺癌組織、癌旁組織BCYRN1 表達的RTPCR 實驗結(jié)果表明,乳腺癌組織BCYRN1 表達顯著高于癌旁組織(P＜0.05),說明BCYRN1 在乳腺癌組織中呈高表達趨勢 (圖1A)。轉(zhuǎn)染細胞BCYRN1 表達的RT-PCR 實驗結(jié)果表明,陰性對照組、空白對照組BCYRN1 表達無顯著變化(P＞0.05),比較空白對照組和陰性對照組,干擾組BCYRN1 表達顯著降低(P＜0.05),說明細胞轉(zhuǎn)染成功(圖1B)。

圖1 乳腺癌組織BCYRN1 表達及MCF-7 細胞轉(zhuǎn)染后的BCYRN1 表達

2.2 干擾LncRNA BCYRN1 對MCF-7 細胞Ki67 蛋白表達的影響

Edu 實驗結(jié)果表明,與空白對照組比較,陰性對照組Edu 陽性細胞百分比無顯著變化 (P＞0.05);比較空白對照組和陰性對照組,干擾組Edu 陽性細胞百分比顯著減少(P＜0.05),說明干擾LncRNA BCYRN1 能抑制乳腺癌MCF-7 細胞增殖(圖2A、B)。

圖2 Edu 結(jié)果及細胞Ki67 蛋白表達情況

蛋白質(zhì)印跡實驗結(jié)果表明,與空白對照組比較,陰性對照組Ki67 蛋白表達無顯著變化(P＜0.05);與空白對照組和陰性對照組比較,干擾組Ki67 蛋白表達顯著降低(P＜0.05),說明干擾LncRNA BCYRN1 能降低乳腺癌MCF-7 細胞Ki67 蛋白表達(圖2C)。

2.3 干擾LncRNA BCYRN1 對MCF-7 細胞侵襲的影響

Transwell 實驗結(jié)果表明,與空白對照組比較,陰性對照組單個視野細胞侵襲數(shù)目無顯著變化(P＞0.05)。

與空白對照組和陰性對照組比較,干擾組單個視野細胞侵襲數(shù)目顯著降低(P＜0.05),說明干擾LncRNA BCYRN1 能抑制乳腺癌MCF-7 細胞侵襲(圖3)。

圖3 各組細胞侵襲情況

2.4 干擾LncRNA BCYRN1 對MCF-7 細胞遷移的影響

劃痕實驗結(jié)果表明,與空白對照組比較,陰性對照組細胞遷移率無顯著變化(P＞0.05);與空白對照組和陰性對照組比較,干擾組細胞遷移率顯著下降(P＜0.05),說明干擾LncRNA BCYRN1 能抑制乳腺癌MCF-7 細胞遷移(圖4)。

圖4 各組細胞遷移情況

2.5 干擾LncRNA BCYRN1 對MCF-7 細胞運動能力的影響

蛋白質(zhì)印跡實驗結(jié)果表明,與空白對照組比較,陰性對照組E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達無顯著變化(P＞0.05);比較空白對照組和陰性對照組,干擾組N-cadherin 蛋白表達顯著降低,Ecadherin 蛋白表達升高(P＜0.05),說明干擾LncRNA BCYRN1 能通過降低N-cadherin 蛋白表達,升高E-cadherin 蛋白表達,抑制乳腺癌MCF-7 細胞運動能力(圖5A)。免疫熒光實驗結(jié)果表明,與空白對照組比較,陰性對照組Vimentin 陽性率無顯著變化(P＞0.05);與空白對照組和陰性對照組比較,干擾組Vimentin 陽性率顯著降低(P＜0.05),說明干擾LncRNA BCYRN1 能抑制Vimentin 表達來影響乳腺癌MCF-7 細胞運動(圖5B)。

圖5 MCF-7 細胞運動能力檢測結(jié)果

2.6 干擾LncRNA BCYRN1 對裸鼠移植瘤生長的影響

移植瘤RT-PCR 實驗結(jié)果表明,與空白對照組比較,干擾組BCYRN1 表達顯著降低(P＞0.05),說明干擾LncRNA BCYRN1 裸鼠移植瘤構(gòu)建成功(圖6A)。移植瘤質(zhì)量稱重實驗表明,干擾組裸鼠移植瘤質(zhì)量低于空白對照組(P＜0.05),說明干擾LncRNA BCYRN1 能抑制裸鼠移植瘤生長(圖6B),移植瘤蛋白質(zhì)印跡實驗結(jié)果表明,與空白對照組比較,干擾組移植瘤組織Ki67、N-cadherin 蛋白表達降低 (P＜0.05),說明干擾 LncRNA BCYRN1 可能通過降低Ki67、N-cadherin 蛋白表達來抑制移植瘤生長(圖6C、D)。

圖6 干擾LncRNA BCYRN1 對裸鼠移植瘤生長的影響

3 討論

LncRNA BCYRN1 在非小細胞肺癌患者血清中呈高表達趨勢且與患者不良預(yù)后存在密切關(guān)系[8],還能通過調(diào)節(jié)細胞侵襲信號通路調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[9],BCYRN1 高表達能促進卵巢癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移[10]。本研究結(jié)果顯示,乳腺癌癌組織BCYRN1 表達明顯高于癌旁組織,說明BCYRN1 可能參與乳腺癌發(fā)病或進展過程。本研究通過shRNA 沉默MCF-7 細胞中BCYRN1 表達,結(jié)果顯示LncRNA BCYRN1 低表達MCF-7 細胞的Edu陽性細胞百分比降低,且Ki67 蛋白表達降低。Ki67 在細胞增殖過程中占據(jù)重要作用,在多種腫瘤組織呈高表達趨勢[11-12],Ki67 高表達與乳腺癌組織微血管密度存在關(guān)系[13]。說明shRNA 干擾LncRNA BCYRN1 能降低乳腺癌MCF-7 細胞增殖能力,可能是通過降低細胞Ki67 蛋白表達實現(xiàn)對癌細胞增殖抑制作用。

LncRNA 可通過調(diào)節(jié)瘤細胞增殖、運動能力、凋亡以及耐藥性等參與原發(fā)性腫瘤進展,LncRNA參與乳腺癌細胞生物學行為過程[14-15],具有潛在診斷價值。乳腺癌經(jīng)根治術(shù)治療后仍存在術(shù)后復發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移風險,這與乳腺癌細胞較強侵襲、遷移能力有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,LncRNA BCYRN1低表達MCF-7 細胞的單個視野細胞侵襲數(shù)目、細胞遷移率均呈明顯降低趨勢,與Zhou 等[16]研究結(jié)果趨勢,說明shRNA 干擾LncRNA BCYRN1 會降低乳腺癌MCF-7 細胞侵襲和遷移能力。乳腺癌細胞侵襲、遷移能力強于正常組織細胞,與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān),有研究表明阻斷乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程可以降低乳腺癌細胞侵襲、遷移能力[17]。E-cadherin 為上皮細胞標志蛋白,N-cadherin 參與細胞間的黏附過程,N-cadherin 在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中表達上調(diào)[18]。Vimentin 為細胞骨架組成部分,同時也是間質(zhì)細胞標志蛋白,其表達水平升高提示腫瘤細胞的浸潤能力增強[19]。本研究結(jié)果顯示,LncRNA BCYRN1 低表達MCF-7 細胞N-cadherin 蛋白表達和Vimentin 陽性率均呈明顯降低趨勢,而Ecadherin 蛋白表達呈明顯升高趨勢,與皮亞平等[20]研究結(jié)果相似,說明shRNA 干擾LncRNA BCYRN1可能通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的E-cadherin、Ncadherin、Vimentin 蛋白表達來調(diào)節(jié)乳腺癌細胞侵襲、遷移能力。裸鼠成瘤實驗在腫瘤學、免疫學以及藥物安全性評估、篩選方面有著特殊意義,本研究通過裸鼠移植瘤實驗發(fā)現(xiàn)LncRNA BCYRN1 低表達裸鼠移植瘤質(zhì)量和移植瘤組織Ki67、N-cadherin蛋白表達降低,說明shRNA 干擾LncRNA BCYRN1能抑制乳腺癌移植瘤生長,與降低移植瘤組織Ki67、N-cadherin 蛋白表達有關(guān)。

綜上所述,shRNA 干擾LncRNA BCYRN1 對乳腺癌MCF-7 細胞增殖、侵襲、遷移能力有抑制作用,其作用機制可能與調(diào)節(jié)細胞增殖、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達有關(guān),還能抑制裸鼠移植瘤生長。乳腺癌惡性行為機制復雜,調(diào)控途徑多樣,本研究還存在未能闡明LncRNA BCYRN1 是通過何種信號途徑調(diào)節(jié)乳腺癌惡性行為,后續(xù)將開展深入探究。