苦蒿素改善新生大鼠急性肺損傷的作用機制

楊亞龍,林文東,林清凡

泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 福建省泉州市,362100

急性肺損傷(acute lung injury,ALI) 是一種由各種原因?qū)е碌姆尾考毙詮浡越櫺圆∽?肺水腫為其主要特征,研究表示有多個有關(guān)炎癥和氧化應(yīng)激的信號通路參與了ALI 的發(fā)生發(fā)展過程[1-2]。ALI 的具體發(fā)病機制尚無臨床統(tǒng)一定論,目前臨床常用的機械通氣法容易刺激患者肺組織,吸入血管舒張劑的治療效果已不如其他方案,實現(xiàn)ALI 有效治療的探索腳步從未停歇[3-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明,苦蒿素是從金龍膽草中提取的具有較強抗炎作用的有效成分,能夠發(fā)揮清熱解毒、止咳化痰,平喘利濕等作用[5-6],目前將苦蒿素應(yīng)用在肺部疾病治療的相關(guān)研究尚少,但基于其藥理特性,認為其可能具備改善ALI 的功效。高遷移率族蛋白/核轉(zhuǎn)錄因子(high mobility group box 1 protein/nuclear transcription factor-κB,HMGB1/NF-κB) 是與炎性反應(yīng)和免疫抑制密切相關(guān)的經(jīng)典信號通路,調(diào)節(jié)機體免疫炎性反應(yīng)幾乎都會經(jīng)過HMGB1/NF-κB信號通路,本研究觀察了苦蒿素對HMGB1/NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)作用,判斷其是否為作用機制之一。地塞米松具有高效抗炎作用,通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制機體炎性反應(yīng)[7]。因此,本研究以地塞米松的抗炎效果作為參考,評估苦蒿素對ALI 大鼠肺部炎癥的改善效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究選用的實驗動物為5～7 周齡的新生Wistar 大鼠60 只,重約200 g,[上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,SCXK (滬) (2017-0005)]。

1.2 試劑與儀器

主要試劑: 苦蒿素標準品(20210526),吉至生化科技有限公司;白細胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)、IL-1β 和腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α,TNF-α),QuicKey Elabscience 公司,檢測范圍: 7.81～500 pg/mL;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和過氧化氫酶(catalase,CAT),韻泰信息科技有限公司;所有單克隆抗體均購于Abcam 公司。

主要儀器: OLYMPUS BX60 型光學(xué)顯微鏡;Bio-Rad iMark680 多功能酶標檢測儀。

1.3 動物分組與造模

將大鼠隨機分為6 組,每組10 只,分別為假手術(shù)組,模型組,苦蒿素低、中、高劑量組和地塞米松組。假手術(shù)組常規(guī)飼養(yǎng),其他組大鼠持續(xù)暴露于25 ℃,60 %～70 %濕度,90 %～95 %常壓氧氣的有機玻璃容器內(nèi)建立ALI 模型[8]。模型建立后,將藥物溶解于二甲基亞砜中,苦蒿素低、中、高劑量組大鼠分別通過腹腔注射7 d 苦蒿素苦蒿素12.5、25、50 mg/kg[9],地塞米松組大鼠通過腹腔注射7 d 地塞米松10 mg/kg[10],模型組和假手術(shù)組大鼠用生理鹽水取代。

1.4 標本采集

注射試劑后第8 天,將大鼠麻醉,之后向大鼠氣管內(nèi)注射無菌PBS 灌洗肺部,獲取支氣管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。在4 ℃、2 184 r/min 條件下離心10 min 以分離BALF上清液。然后分離大鼠肺組織為兩份,一份制備成勻漿組織備用,另一份固定待病理檢查。

1.5 觀測指標

1.5.1 肺水腫 通過吸入異氟烷麻醉動物,從頸主動脈中采集血樣。采用自動血氣分析儀測量PaO2;采用干濕重法測定肺濕重/干重比值,右肺稱重記錄濕重(W),70 ℃下干燥右肺48 h 至恒重,測量干重(D),計算W/D。

1.5.2 肺組織損傷 將上述1.4 中使用4 %多聚甲醛固定好的肺組織樣本進行石蠟包埋,三分之一處連續(xù)切片,采用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE),觀察肺組織損傷圖像。

1.5.3 BALF 中HMGB1、炎性因子和氧化應(yīng)激水平大鼠BALF 中IL-6、IL-1β、TNF-α、SOD、MPO、MDA 和CAT 水平均采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 法測定。

1.5.4 肺組織NF-κB 通路表達 裂解大鼠肺組織勻漿后提取蛋白,隨后行SDS-PAGE 電泳,電子轉(zhuǎn)移到PVDF 膜,將膜與封閉緩沖液孵育并洗滌,與HMGB1 (1∶2 000)、TLR4 (1∶2 000)、NF-κB P65(1∶2 000) 和p-NF-κB P65 (1∶2 000) 一抗孵育過夜。使用HRP 偶聯(lián)二抗(1 ∶4 000,Abcam;1 ∶4 000,Sigma-Aldrich) 孵育膜,室溫條件下孵育2 h,電化學(xué)發(fā)光顯像,以磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH) 作為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 軟件進行分析,W/D、肺損傷評分、PaO2、IL-6、IL-1β、TNF-α、SOD、MPO、MDA、CAT 水平以及HMGB1/NF-κB 蛋白表達等計量資料以() 表示,單因素方差分析差異性,SNK-q比較多組兩兩間差異,P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苦蒿素對肺水腫的效果

通過采用干濕重法對各組大鼠肺水腫進行評估,發(fā)現(xiàn)模型組大鼠PaO2明顯低于假手術(shù)組,W/D 和肺損傷評分明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05),說明ALI 大鼠肺部水腫更嚴重,損傷程度更高;與模型組相比,苦蒿素高劑量組和地塞米松組大鼠PaO2明顯上升,W/D 和肺損傷評分變化趨勢相反,隨著苦蒿素劑量增加,效果更明顯(P＜0.05),說明使用苦蒿素能夠改善大鼠肺損傷,尤其高劑量苦蒿素可以更好改善大鼠肺水腫情況;與苦蒿素高劑量組相比,地塞米松組大鼠肺損傷評分、PaO2和W/D 無明顯差異(P＞0.05)。

說明苦蒿素對肺水腫的改善效果與地塞米松無顯著差異(表1)。

表1 苦蒿素對ALI 新生大鼠肺水腫的影響

2.2 HE 染色檢測苦蒿素對ALI 新生大鼠肺組織病理損傷

HE 染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠肺組織正常,無水腫等明顯病變;模型組和苦蒿素低劑量組細胞結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡腔有明顯滲出,有炎性細胞浸潤,說明低劑量苦蒿素對于ALI 大鼠肺部損傷無明顯作用;苦蒿素中、高劑量組和地塞米松組大鼠肺滲出和浸潤情況得以明顯改善,說明一定濃度的苦蒿素能夠發(fā)揮一定抗炎作用(圖1)。

圖1 HE 染色檢測ALI 新生大鼠肺組織病理損傷(HE 染色,×400)

2.3 苦蒿素對ALI 新生大鼠BALF 中炎癥指標的影響

ELISA 檢測結(jié)果顯示,模型組大鼠BALF 中炎癥水平明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05),說明大鼠發(fā)生ALI 后,肺部炎癥水平增加;苦蒿素高劑量組大鼠和地塞米松組大鼠BALF 中炎癥水平明顯低于模型組,隨著苦蒿素劑量增加,作用更為明顯(P＜0.05);苦蒿素高劑量組和地塞米松組大鼠間無明顯差異(P＞0.05),說明隨著苦蒿素劑量增加,其抗炎效果更明顯,當達到一定濃度后,其效果與地塞米松作用相似(表2)。

表2 苦蒿素對ALI 新生大鼠BALF 中炎癥指標的影響

2.4 苦蒿素對氧化應(yīng)激的影響

ELISA 檢測結(jié)果顯示,模型組新生大鼠SOD和CAT 水平明顯低于假手術(shù)組,MPO 和MDA 水平明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05),以上結(jié)果說明大鼠發(fā)生ALI 后,肺部氧化應(yīng)激水平增加;與模型組相比,苦蒿素高劑量組大鼠和地塞米松組大鼠SOD 和CAT 水平明顯上升,MPO 和MDA 水平明顯下降,隨著苦蒿素劑量增加,上述指標變化更為明顯(P＜0.05),以上結(jié)果說明中、高劑量苦蒿素可能通過減輕大鼠肺組織中氧化應(yīng)激水平,降低自由基對大鼠肺組織的損傷,改善大鼠ALI 癥狀;與苦蒿素高劑量組相比,地塞米松組大鼠中SOD、MPO、MDA 和CAT 水平變化無明顯差異 (P＞0.05) (表3)。

表3 苦蒿素對ALI 新生大鼠BALF 中氧化應(yīng)激指標影響

2.5 苦蒿素調(diào)節(jié)ALI 新生大鼠肺組織NF-κB 信號通路

通過WB 實驗發(fā)現(xiàn),模型組大鼠肺組織HMGB1、TLR4 和p-NF-κB P65/NF-κB P65 表達水平明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05),說明大鼠發(fā)生ALI后,相關(guān)信號通路的蛋白表達發(fā)生改變;苦蒿素高、中劑量組大鼠和地塞米松組大鼠肺組織HMGB1、TLR4和p-NF-κB P65/NF-κB P65 表達水平明顯低于模型組(P＜0.05),隨著苦蒿素劑量增加,其作用更明顯,說明苦蒿素可以抑制該信號通路可以下調(diào)相關(guān)蛋白表達,且濃度越高,抑制作用更明顯(圖2)。

圖2 各組ALI 新生大鼠肺組織HMGB1/NF-κB 信號通路蛋白表達水平

3 討論

ALI 是多原因引起的肺部彌漫性損害臨床綜合征,與體內(nèi)異常的炎癥水平和過度氧化應(yīng)激有關(guān),本研究主要探究了苦蒿素對ALI 的作用效果以及發(fā)揮效應(yīng)可能參與的生理過程[11-14]。

HE 染色結(jié)果說明中、高劑量苦蒿素對ALI 大鼠肺組織損傷具有一定治療效果,對比未經(jīng)苦蒿素干預(yù)的大鼠,高劑量苦蒿素干預(yù)的大鼠肺組織炎性細胞浸潤的情況得以改善,說明一定濃度的苦蒿素能夠發(fā)揮一定抗炎作用。本研究中,苦蒿素高劑量組大鼠PaO2水平明顯高于模型組,W/D 和肺損傷評分明顯低于模型組,并且隨著苦蒿素劑量增加,效果更明顯。說明高劑量苦蒿素可以改善大鼠肺水腫情況,PaO2水平升高提示肺毛細血管攝氧狀況好轉(zhuǎn),肺外呼吸狀況得以改善。研究表明,肺組織損傷后肺水含量增加,其W/D 值較正常肺組織明顯升高,肺泡-毛細血管膜通透性增大,體液和蛋白通過血管腔進入間質(zhì)間隙,引發(fā)肺水腫[13-14]?？噍锼馗深A(yù)后,W/D 值下降說明中、高劑量苦蒿素可以減輕肺組織水腫,其效果具有濃度依賴性。

本研究結(jié)果顯示,苦蒿素高劑量組和地塞米松組大鼠BALF 中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平明顯低于模型組,苦蒿素劑量增加,效果更明顯,當達到一定濃度后,其效果與地塞米松作用相似。普遍研究認為,TNF-α 是介導(dǎo)ALI 的主要細胞因子,是ALI 發(fā)生期間最早釋放的炎性因子之一,抑制其生成可以減輕肺血管內(nèi)皮細胞損傷[15-17];TNF-α 和IL-1β 可以介導(dǎo)中性粒細胞活化,活化的中性粒細胞黏附于血管內(nèi)皮細胞并在炎性反應(yīng)部位聚集,使肺泡上皮細胞和肺血管內(nèi)皮細胞間隙增大,大量血管內(nèi)容物滲出,造成肺損傷;IL-6 能夠通過激活淋巴細胞介導(dǎo)免疫反應(yīng),同時其刺激造血干細胞生長和增加急性期蛋白合成的特性使之在ALI 中占有重要地位。IL-6水平下降表示苦蒿素能夠抑制炎性因子釋放,改善血管通透性,抑制滲出。已知地塞米松是一種具有強大抗炎作用的糖皮質(zhì)激素,將其作為抗炎效應(yīng)的參照物可以對苦蒿素的抗炎能力進行對照,本研究結(jié)果中兩者對炎性因子的調(diào)控效果無明顯差異,一定程度上說明苦蒿素具備強大的抗炎能力,能夠通過抑制炎癥水平,一定程度上改善大鼠肺損傷情況。

SOD 平衡機體氧化與抗氧化;MPO 破壞多種靶物質(zhì),產(chǎn)生炎性反應(yīng);CAT 清除氧自由基,通過降解過氧化氫為無毒的H2O 和O2以降低自由基對肺組織的損傷;MDA 是具有細胞毒性的氧化終產(chǎn)物,其水平與細胞受損程度相關(guān)[18-19]。ELISA 檢測結(jié)果顯示,苦蒿素高、中劑量組大鼠和地塞米松組大鼠SOD 和CAT 水平明顯高于模型組,MPO 和MDA 水平明顯低于模型組,說明中、高劑量苦蒿素具有強大的抗氧化作用,苦蒿素可能通過減輕大鼠肺組織中氧化應(yīng)激水平,降低自由基對肺組織的損傷,改善大鼠ALI 癥狀。蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示,苦蒿素高、中劑量組大鼠和地塞米松組大鼠肺組織HMGB1、TLR4 和p-NF-κB P65/NF-κB P65 表達水平明顯低于模型組。NF-κB 普遍存在于胞漿,其激活是肺部炎癥疾病的重要特征之一,NF-κB P65 是NF-κB 的亞基組成形式,HMGB1 作為促炎因子可以結(jié)合TLR4 等細胞受體,通過激活受體以激活NF-κB,釋放大量IL-1β、IL-6 和TNF-α 等炎性因子,誘導(dǎo)肺組織細胞凋亡[20]。因此,抑制該信號通路可以下調(diào)相關(guān)蛋白表達,從而抑制相關(guān)炎性因子釋放,發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述,苦蒿素可以通過提高抗炎抗氧化能力以及抑制HMGB1/NF-κB 信號通路來減輕由LPS誘導(dǎo)的ALI,但本研究僅初步探討了苦蒿素對抗治療ALI 的可能作用機制。雖然其對ALI 的治療效果具有濃度依賴,但最佳治療劑量還有待進一步的研究證明。