DNA 異常甲基化在口腔鱗癌中的研究進展

許益敏 ,崔丹 ,盧志遠 ,盧楊 ,周夢緣 ,肖燦

1蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科 江蘇省蘇州市,215000 2蘇州市華夏口腔醫(yī)院口腔科 江蘇省蘇州市,215000 3蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 江蘇省蘇州市,215000

口腔癌是頭頸頜面部常見的惡性腫瘤,在全身常見惡性腫瘤中居第六位,其中鱗狀細(xì)胞癌是最為常見類型,約占口腔癌中的90 %[1-3]。口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC) 可發(fā)生于唇、頰粘膜、口底、牙槽嵴和牙齦、舌前三分之二、硬腭和磨牙后三角處,是來源于口腔上皮組織的惡性腫瘤。據(jù)最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示,2020 年全球口腔癌發(fā)病人數(shù)約26.4 萬例,死亡案例約12.5萬例,5 年死亡率高達50 %[4]。盡管治療方式在不斷改進提升,口腔鱗癌的死亡率仍未能大幅降低,因此,為了更準(zhǔn)確有效的診斷及治療,就必須要深入了解OSCC 的發(fā)病機制。

近幾十年的研究發(fā)現(xiàn),惡性腫瘤相關(guān)基因的激活或失活,并不一定要通過DNA 序列改變,表觀遺傳調(diào)控失常亦可致癌[5]。DNA 甲基化作為表觀遺傳學(xué)中的一個研究熱點,可以成為我們研究OSCC 發(fā)病機制的切入點,本文將對該熱點在口腔鱗癌中的研究進展作一綜述。

1 DNA 甲基化的表觀遺傳修飾

惡性腫瘤的發(fā)生過程極為復(fù)雜,目前普遍認(rèn)為其發(fā)生可以歸因于基因和環(huán)境的共同調(diào)控。表觀遺傳是在DNA 序列不變的前提下發(fā)生可遺傳的基因表達或表型的改變,比基因突變更頻繁[6]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象中最為常見且重要的機制之一,也是近期研究熱點之一。其在正常生理過程中承擔(dān)著調(diào)節(jié)基因表達、維持基因組穩(wěn)定性等重要功能。DNA 甲基化異常會引起基因表達的過度或不足,影響細(xì)胞功能和信號通路,導(dǎo)致如癌癥、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的發(fā)生發(fā)展。

DNA 甲基化是DNA 分子上的堿基被添加了甲基的過程,即S-腺苷甲硫氨酸上的甲基在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT 的催化作用下轉(zhuǎn)移至DNA 分子的胞嘧啶或腺嘌呤上[7](圖1),其中雙核苷酸序列中富含C-G 對的區(qū)域被稱為CpG 島,通常處于非甲基化狀態(tài),在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用。DNA 甲基化有不同的修飾形式,如5-甲基胞嘧啶 (5-mC)、5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)、N6-甲基腺嘌呤(6mA) 等,真核生物中最常見且研究最充分的堿基甲基化是5-mC[8-9]。大量研究顯示,惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中多可見DNA 甲基化的身影,主要表現(xiàn)為①腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)全基因組的低甲基化;②特定基因(抑癌基因等) CpG 島的高甲基化[10]。

圖1 位點特異性DNA 甲基化示意圖[11-12]

全基因組的低甲基化一般是通過減少5-mC 來增加染色體的不穩(wěn)定性,尤其是在基因的編碼區(qū)域[13]。而腫瘤特異性基因啟動子CpG 島的超甲基化會直接導(dǎo)致基因失活影響腫瘤進展,尤其是在抑癌基因上發(fā)生,可導(dǎo)致組織細(xì)胞增殖分化異常,進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后[14]。同時,當(dāng)CpG島發(fā)生低甲基化時,之前沉默的原癌基因可能會被激活。這些情況在包括頭頸癌的各類腫瘤中均有被發(fā)現(xiàn)[15]。

甲基化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有異質(zhì)性[16]。腫瘤中CpG 島的高甲基化非常常見,但實際上全基因組低甲基化才是腫瘤惡性發(fā)展的趨勢[17]。高甲基化和低甲基化致癌的作用機制并不一致,在腫瘤發(fā)展中所具有的模式、功能也不同。高甲基化可以阻止轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動子結(jié)合,影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達,導(dǎo)致基因沉默或失活。此外DNA 高甲基化還影響DNA 修復(fù)機制,影響DNA 修復(fù)酶正確識別甲基化位點從而導(dǎo)致DNA 損傷累積。DNA 低甲基化在基因組的全局或局部水平均可發(fā)生。全局低甲基化會導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性增加,癌癥風(fēng)險增加。局部低甲基化則與某些特定的腫瘤相關(guān)基因的表達改變有關(guān)。此外低甲基化還可能影響癌癥相關(guān)的DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶表達,引起更多的DNA 低甲基化事件的發(fā)生[18-19]。目前高甲基化和低甲基化在癌癥進展中如何共同作用的機制尚無明確的定論,因此我們需要對DNA 異常甲基化進行定量分析,或可為癌癥的早期預(yù)警及治療提供重要依據(jù)。

2 DNA 甲基化的檢測

DNA 甲基化檢測中,樣本的類型和來源非常重要。樣本中DNA 的質(zhì)量和純度會直接影響到檢測的結(jié)果。一般來說,DNA 甲基化檢測樣本類型包括固體組織、血液、唾液、尿液、糞便等,其中固體組織樣本最為常見。OSCC 中DNA 甲基化的研究多集中在腫瘤早期診斷和惡性轉(zhuǎn)化指標(biāo)上[20],通常涉及到的樣本類型主要包括固體組織(多集中于健康黏膜、癌旁及腫瘤組織)、血液及唾液。

DNA 甲基化檢測的方法有很多種,主要是區(qū)分DNA 序列中的C 和5-mC 堿基。根據(jù)目的的不同可以分為全基因組和特定CpG 位點的DNA 甲基化水平測量[21]。根據(jù)技術(shù)類型又分為基于甲基化敏感限制性內(nèi)切酶的測量、基于亞硫酸氫鹽的測量和基于親和富集方法的測量,具體歸納見表1[22]。其中,全基因組重亞硫酸氫鹽甲基化測序(whole genome bisufite sequencing,WGBS) 是目前DNA 甲基化檢測方法的金標(biāo)準(zhǔn)。該技術(shù)利用高通量測序技術(shù)對DNA 甲基化位點進行全基因組或全外顯子組的測序分析,能夠全面、高精度地檢測DNA 甲基化狀態(tài)。從整體來看,限制性內(nèi)切酶的測量對檢測樣本的純度、完整性具有較高的要求且主要通過比較酶切片段長度的差異來分析,更適用于檢測CpG密度較低的DNA 序列;基于親和富集的甲基化檢測方法對DNA 質(zhì)量要求相對較低,但對DNA 起始含量的要求較高,更適合CpG 密度較高的序列;基于亞硫酸氫鹽(Bs) 轉(zhuǎn)換的檢測方法對樣本純度和完整性的要求較前兩類方法略低,檢測石蠟包埋的DNA 樣本通常會采用此法。針對低濃度、甲基化水平較低的樣本,也會采用Bs 轉(zhuǎn)換結(jié)合PCR擴增的策略提升檢測的靈敏度[23]。

表1 常見DNA 甲基化檢測技術(shù)的對比

3 OSCC 中的DNA 異常甲基化

3.1 DNA 異常甲基化與OSCC 發(fā)生發(fā)展中的危險因素

OSCC 的發(fā)生受內(nèi)外多因素的調(diào)控,其中煙酒、檳榔是主要的發(fā)病危險因素[24]。Guerrero 和Baba 等[25-27]發(fā)現(xiàn),煙草的使用與全基因組的低甲基化、抑癌基因啟動子高甲基化有關(guān),Supic 等[33]則發(fā)現(xiàn)OSCC 相關(guān)的基因CpG 島高甲基化與長期攝入酒精有關(guān)。同時有研究認(rèn)為吸煙和酒精之所以導(dǎo)致全基因組低甲基化,是因為它與維生素B12水平較低有關(guān),維生素B12是S-腺苷甲硫氨酸合成的重要來源[26]。而維生素B12又主要是從日常食物中攝取而來,因此,我們合理懷疑,節(jié)食可能是影響甲基化機制的另一個因素。除此之外,慢性炎癥[28]、人類乳頭瘤病毒(HPV) 持續(xù)感染和遺傳易感性等因素也可能會導(dǎo)致廣泛的遺傳和表觀遺傳改變進而致癌,這其中就包括DNA 異常甲基化[29]。

Foy 等[11]的研究表明,啟動子區(qū)CpG 島的甲基化表型差異化可能是OSCC 發(fā)展的早期事件。為了深入探究OSCC 的發(fā)病機制,研究人員對OSCC患者和正常人的基因組DNA 進行了測序和甲基化檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),OSCC 患者在某些關(guān)鍵區(qū)域存在顯著的DNA 甲基化差異,這些差異進一步影響相關(guān)基因的表達,并最終導(dǎo)致細(xì)胞功能改變。此外,該研究也闡述了環(huán)境因素和個體遺傳因素會影響頜面部的甲基化模式,進一步增加OSCC 的發(fā)病風(fēng)險。因此,對OSCC 發(fā)展早期事件的深入了解,或能為預(yù)防、診斷和治療提供新思路。

3.2 OSCC 中的DNA 高甲基化

目前DNA 甲基化與OSCC 發(fā)生發(fā)展的顯著相關(guān)性尚無充分及決定性實驗可以證明,但已有文獻報道40 多個腫瘤抑制基因的高甲基化在口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展中有一定的影響[30]。根據(jù)基因名稱、樣本類型、生物學(xué)功能及臨床解讀將這些基因進行整理,結(jié)果見表2。

表2 口腔鱗癌中DNA 高甲基化基因及其生物學(xué)功能

3.3 OSCC 中的DNA 低甲基化

非特異性基因或全基因組低甲基化在口腔鱗癌中的研究較少,本部分對檢索到的文獻歸納整理,結(jié)果見表3。

表3 口腔鱗癌中DNA 低甲基化基因及其生物學(xué)功能

4 DNA 甲基化與OSCC 的診斷、治療及預(yù)后

目前針對OSCC 的治療手段主要是外科手術(shù)輔以放化療,雖然治療策略在不斷改善,但其預(yù)后仍不容樂觀,這多歸因于疾病發(fā)現(xiàn)的時機。大部分鱗癌患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就是晚期[69]。研究顯示,OSCC 在T1 階段確診、治療,5 年生存率為80 %以上,晚期確診則僅20 %～30 %[70]。同時病理活檢是確診口腔鱗癌的金標(biāo)準(zhǔn),這加劇了隱匿性O(shè)SCC 早期發(fā)現(xiàn)的難度,延誤了癌癥的早期診治,這也是各方學(xué)者致力于研究生物標(biāo)志及機制的主要原因。

研究表明,根據(jù)與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的DNA 甲基化標(biāo)志物,可開發(fā)簡單易用易識別的診斷試劑盒用于OSCC 的早篩[63,71]。最常報告的超甲基化位點是p16,p14,DAPK,MGMT[72]。外顯子基因組范圍的甲基化研究也對這些位點進行了驗證。但同時,根據(jù)樣本類型選擇的不同,這些基因的DNA 甲基化水平也不同,例如DAPK甲基化水平在唾液中就明顯降低[73]。這也提示我們甲基化模式具有組織異質(zhì)性,其中的機制仍待我們進一步研究探討。此外,由于唾液的獲取簡單、快速、無創(chuàng),因而對OSCC 唾液表觀遺傳標(biāo)志物的研究也成為了研究熱點方向。

目前研發(fā)表觀遺傳靶向藥物成為OSCC 治療的新途徑,其中DNA 甲基化是藥物研究中的熱點之一,多集中于甲基化異常的位點。目前國內(nèi)外已研發(fā)出針對多種DNA 甲基化的DNMT 抑制劑并應(yīng)用于臨床[5]。同時,放化療依舊在口腔癌的治療中扮演著重要角色,文獻中不乏報道許多表觀基因改變可應(yīng)用于治療的指導(dǎo),如: OSCC 患者中MGMT啟動子甲基化狀態(tài)可用于預(yù)測其化療敏感性[74]。另外,除了上表中統(tǒng)計的與預(yù)后相關(guān)的基因,Imai等[75]發(fā)現(xiàn)SALL2 基因DNA 甲基化也與OSCC 預(yù)后相關(guān),韓宇慶等[63]發(fā)現(xiàn)CD133 和CD147 的甲基化狀態(tài)與患者的生存率有關(guān)。總結(jié)來說這些表觀遺傳標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及研究,對OSCC 的探索有著突破性的意義。

5 小結(jié)

目前DNA 甲基化在OSCC 中的研究有不少的進展,越來越多的生物標(biāo)志物(包括早期診斷、預(yù)后、及治療靶點) 出現(xiàn)在大眾視野,成為OSCC診治過程中的一個參考指標(biāo),但從標(biāo)志物的有效性來看,缺乏敏感性及特異性高的分子標(biāo)志物。從研究位點來看,OSCC 中DNA 甲基化研究多聚焦于候選基因啟動子CpG 島,對全基因組甲基化檢測分析較少。從候選基因來看,OSCC 甲基化研究大部分是通過回顧以往文獻來確定候選基因,有偏倚風(fēng)險,同時個別候選基因序列片段的甲基化改變不能有效說明惡性腫瘤發(fā)生內(nèi)在機制,還需進一步驗證。從樣本來看,研究對象多為健康、癌旁與癌組織,缺少中間進展環(huán)節(jié),例如口腔黏膜白斑、紅斑、糜爛性扁平苔癬等。文獻檢索發(fā)現(xiàn),僅有少量研究在發(fā)育不良的癌前樣本上檢測了部分基因的甲基化模式變化[76-77],而這些連續(xù)的病理變化過程中DNA 甲基化差異表達的變化分析,對OSCC 發(fā)生發(fā)展機制的探討有更顯著更有指導(dǎo)性的意義。

大量研究在分析OSCC 中DNA 甲基化水平時,多結(jié)合煙酒炎癥等危險因素,但通過大量文獻回顧發(fā)現(xiàn),肥胖、糖尿病、高血壓等中國高發(fā)生率疾病與DNA 甲基化亦存在著相關(guān)聯(lián)性,這也提示我們在綜合分析時是否需要考慮其他全身因素對DNA甲基化水平的影響。因此,在對未來研究的展望中,我們應(yīng)對病理各階段特別是癌前病變進行更深入的DNA 甲基化差異表達研究,篩選出最有潛力的基因[24],通過構(gòu)建動物模型,或者建立人口腔癌的DNA 甲基化譜系,綜合分析各樣本類型中的DNA 甲基化水平,為DNA 甲基化在口腔鱗癌中發(fā)生發(fā)展的機制研究奠定基礎(chǔ);為患者的早篩、預(yù)后及治療提供新的突破口。