飼喂四環(huán)素和氨芐西林對(duì)德國(guó)小蠊雄成蟲營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)和3種解毒酶活性的影響*

沈惠芳，張婷，王國(guó)紅，田寶玉*

（細(xì)胞逆境響應(yīng)與代謝調(diào)控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350108）

德國(guó)小蠊屬蜚蠊目蜚蠊科小蠊屬昆蟲，是全球最嚴(yán)重的城市害蟲之一[1]，對(duì)公共衛(wèi)生安全危害極為嚴(yán)重，常在人類居住地中生活，藏匿于浴室、廁所和廚房，德國(guó)小蠊的糞便和脫落的身體部位是過敏原的來(lái)源，會(huì)引發(fā)敏感人群的哮喘癥狀、兒童哮喘和過敏反應(yīng)等[2]。目前，蟑螂種群的管控廣泛依賴于殺蟲劑的使用，但自20世紀(jì)50年代以來(lái)，殺蟲劑耐藥性一直是控制蟑螂的障礙。

研究表明飼喂抗生素會(huì)影響昆蟲的生長(zhǎng)和健康。Chloe等[3]通過給黑腹果蠅喂食鏈霉素，結(jié)果表明與正常黑腹果蠅相比，喂食鏈霉素的個(gè)體需要更長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)發(fā)育并且體重更輕。Zhu等[4]通過研究土壤中存在的抗生素污染對(duì)土壤食物鏈的影響發(fā)現(xiàn)抗生素處理使土壤跳蟲體重的降低。Elena等[5]研究了抗生素甲氧芐啶對(duì)大型水蚤的寄主攝食的變化，結(jié)果表明受抗生素影響后水蚤的攝食和消化能力均下降。Raymann等[6]使用四環(huán)素喂食蜜蜂，研究發(fā)現(xiàn)喂食四環(huán)素影響了昆蟲的健康。長(zhǎng)時(shí)間使用四環(huán)素等廣譜抗生素會(huì)對(duì)昆蟲腸道微生物群落造成強(qiáng)大的選擇壓力，殺滅腸道內(nèi)的敏感菌群，導(dǎo)致腸道微生物菌群多樣性的喪失[7]。Lisa等[8]研究表明四環(huán)素類藥物對(duì)特定微生物的選擇性殺傷將導(dǎo)致這些微生物從腸道微生物群中丟失。Lee等[9]用氨芐西林處理德國(guó)小蠊，結(jié)果顯示氨芐西林處理改變了德國(guó)小蠊腸道微生物群中的細(xì)菌組成。

腸道微生物可以幫助宿主降解有毒或有害物質(zhì)[10]，參與宿主對(duì)殺蟲劑的抗性[11-13]，對(duì)農(nóng)藥和農(nóng)藥抗性的進(jìn)化產(chǎn)生變化，做出反應(yīng)[12]，增加解毒酶的產(chǎn)生使有毒的物質(zhì)被分解等[14-15]。昆蟲體內(nèi)解毒酶包括谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase,GST）和磷酸酶（phosphatase）等。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是一種對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生代謝抗性的重要酶系，參與許多分子的解毒機(jī)制，高水平的GST活性與昆蟲對(duì)殺蟲劑的高抗性有關(guān)[16]。昆蟲體內(nèi)的磷酸酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥也具有極強(qiáng)的水解作用[17]，昆蟲體內(nèi)的磷酸酶又分為酸性磷酸酶（Acid phosphatase,ACP）和堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP或AKP），它們?cè)诶ハx機(jī)體的抗病性、解毒代謝和免疫防御過程發(fā)揮著重要功能[18-21]。

目前對(duì)于抗生素導(dǎo)致的昆蟲腸道微生物紊亂對(duì)宿主的影響主要集中在對(duì)宿主腸道微生物群本身的變化趨勢(shì)等方面，而對(duì)宿主生長(zhǎng)和解毒酶活性方面的研究較少。不同的抗生素具有不同的殺菌譜，本研究選用廣譜類的四環(huán)素并結(jié)合臨床常用的氨芐西林為實(shí)驗(yàn)材料，通過飼喂德國(guó)小蠊鹽酸四環(huán)素溶液以及氨芐西林鈉和四環(huán)素混合溶液擾亂德國(guó)小蠊腸道微生物生態(tài)，以探究抗生素脅迫下的腸道微生物群的改變對(duì)于德國(guó)小蠊體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)和三種解毒酶活性的影響，為解析腸道微生物在昆蟲的營(yíng)養(yǎng)利用和解毒機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

德國(guó)小蠊：由福建省疾病預(yù)防控制中心贈(zèng)送。

1.2 儀器與試劑

總蛋白測(cè)定試劑盒、酸性磷酸酶測(cè)定試劑盒、堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；鹽酸四環(huán)素（Tetracyclin HCl）購(gòu)于北京索萊寶（Solarbio）公司，氨芐西林鈉（Ampicillin Na）購(gòu)于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。

1.3 試蟲飼養(yǎng)

德國(guó)小蠊飼養(yǎng)在 260 mm×180 mm×140 mm 塑料盒中，塑料盒口內(nèi)壁沿邊緣涂抹一層寬約30 mm的凡士林和液體石蠟（1∶2，體積比）混合物以防止德國(guó)小蠊逃跑。盒中放置鼠糧和水作為德國(guó)小蠊的食物，兩個(gè)紙板卷。使用人工智能氣候箱飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為（27±1）℃，相對(duì)濕度（RH）40%～50%，光周期12L∶12D。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，試驗(yàn)組飲用水為相對(duì)應(yīng)的抗生素溶液。

⑴ 四環(huán)素處理組（T）：0.5 mg/mL鹽酸四環(huán)素溶液；⑵ 抗生素混合處理組（AT）：0.5 mg/mL鹽酸四環(huán)素和氨芐西林鈉混合溶液（每mL溶液含0.25 mg鹽酸四環(huán)素+0.25 mg氨芐西林鈉）；⑶ 對(duì)照組（C）。每個(gè)處理組重復(fù)3次，共9個(gè)小組。

試驗(yàn)前將德國(guó)小蠊進(jìn)行隨機(jī)分組，每個(gè)小組300只德國(guó)小蠊（不區(qū)分雌雄）。試驗(yàn)組連續(xù)7 d使用抗生素溶液作為德國(guó)小蠊的飲用水；第8 d換成無(wú)菌水，無(wú)菌水喂養(yǎng)7 d后再將無(wú)菌水換成相對(duì)應(yīng)的抗生素溶液，以此類推進(jìn)行抗生素連續(xù)規(guī)律間隔處理6個(gè)月；對(duì)照組始終使用無(wú)菌水作為飲用水。

抗生素溶液的制備：分別制備10 mg/mL的鹽酸四環(huán)素溶液和氨芐西林溶液，過濾除菌后作為貯備液存于-20 ℃冰箱中備用，使用時(shí)將貯備液用無(wú)菌水稀釋至飼喂?jié)舛取?/p>

1.5 德國(guó)小蠊雄成蟲營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)測(cè)定

營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)測(cè)定試蟲準(zhǔn)備：抗生素連續(xù)間隔處理6個(gè)月后在每個(gè)小組中隨機(jī)取出5只羽化后一周的德國(guó)小蠊雄成蟲，分別將其單獨(dú)飼養(yǎng)于50 mm×36 mm×62 mm 的塑料盒中，飼喂鼠糧和無(wú)菌水，連續(xù)飼喂21 d后饑餓24 h。稱量飼喂前飼料重量，飼喂前和飼喂后雄成蟲鮮重。將雄蟲、雄蟲糞便和剩余餌料放入烘箱，60 ℃烘干至恒重。每個(gè)小組重復(fù)5次，每個(gè)處理組取樣數(shù)為3×5=15（只）。

不同抗生素處理組間雄成蟲干重參照Montandon[22]等的方法測(cè)定，依照下列公式計(jì)算各營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)[23]：

相對(duì)生長(zhǎng)率（RGR）=G/(B×T)；

相對(duì)取食量（RCR）=I/(B×T)；

食物利用率（ECI）=G/I×100%；

食物轉(zhuǎn)化率（ECD）=G/(I-F)×100%；

近似消化率（AD）=(I-F)/I×100%；

增重率（WG）=（飼喂后鮮重-飼喂前鮮重）/飼喂前鮮重×100% 。

公式中：

G 為蟲體增重，G=飼喂后干重－飼喂前干重；

B 為試驗(yàn)期間的平均體重，B=（飼喂前干重+飼喂后干重）/2；

I 為取食量，I=飼喂前食物干重-飼喂后食物干重；

F 為糞便干重；

T 為實(shí)驗(yàn)天數(shù)。

1.6 酶源制備

將抗生素處理6個(gè)月后的德國(guó)小蠊雄成蟲饑餓24 h 后，取雄成蟲除去翅、足和頭部后一起稱重，按質(zhì)量（g）與提取液（mL）為1∶9的比例加入9倍體積預(yù)冷的PBS冰浴勻漿，4 ℃溫度下 8000 r/min離心10 min，取上清液作為酶源，測(cè)定時(shí)再稀釋。每個(gè)抗生素處理重復(fù)3次，每個(gè)小組取3只德國(guó)小蠊冰浴勻漿混為一個(gè)樣品。酶活測(cè)定按照試劑盒說明書進(jìn)行，總蛋白測(cè)定使用考馬斯亮藍(lán)法，試驗(yàn)按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素處理對(duì)德國(guó)小蠊雄成蟲營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)的影響

2.1.1 不同抗生素處理對(duì)德國(guó)小蠊雄成蟲取食量和體重影響

由表1可知，四環(huán)素處理組的德國(guó)小蠊經(jīng)四環(huán)素處理后體重較對(duì)照組低，且差異顯著（p＜0.05），但與抗生素混合處理組（AT）無(wú)顯著差異（p＞0.05）。兩試驗(yàn)組（T、AT）增重率與對(duì)照組（C）相比無(wú)顯著差異（p＞0.05）。對(duì)照組德國(guó)小蠊取食量為31.05 mg顯著高于四環(huán)素處理組（T）和抗生素混合處理組（AT）（p＜0.05）。

2.1.2不同抗生素處理對(duì)德國(guó)小蠊雄蟲的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

由表2可知，抗生素處理對(duì)德國(guó)小蠊雄成蟲的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)與對(duì)照組相比差異顯著（p＞0.05），對(duì)照組雄成蟲的相對(duì)取食量顯著高于兩試驗(yàn)組（T、AT）（p＞0.05），兩實(shí)驗(yàn)組（T、AT）間相對(duì)取食量無(wú)顯著差異（p＞0.05）。對(duì)照組（C）的食物利用率達(dá)12.97% ，顯著高于四環(huán)素處理組（T）和抗生素混合處理組（AT）（p＞0.05），四環(huán)素處理組（T）和抗生素混合處理組（AT）的食物利用率分別為8.34%和6.90% ，兩組間無(wú)顯著差異（p＞0.05）。四環(huán)素組（T）的近似消化率達(dá)73.25% ，顯著高于對(duì)照組（C）（p＞0.05），與抗生素混合處理組（AT）無(wú)顯著差異。兩試驗(yàn)組（T、AT）的相對(duì)生長(zhǎng)量和食物轉(zhuǎn)化率與對(duì)照組（C）相比無(wú)顯著差異（p＞0.05）。

組別T AT C取食量（mg）22.64±3.89b 20.72±4.02b 31.05±5.20a初始濕重（mg）41.33±2.24a 43.47±4.17a 43.73±5.42a 21 d后濕重（mg）45.67±2.68b 47.47±3.99ab 49.53±5.72a濕重增重率(10.60±5.66)%a(9.43±4.94)%a(13.47±4.39)%a

2.2 抗生素處理對(duì)德國(guó)小蠊雄成蟲解毒酶活性的影響

2.2.1 處理后各組間德國(guó)小蠊雄成蟲體內(nèi) ACP的活力比較

由圖1可以看出四環(huán)素組（T）ACP活性最高，抗生素混合處理組（AT）ACP 活力最低。其中四環(huán)素組（T）的ACP活力為0.0066 金氏單位/gprot , 抗生素混合處理組（AT）ACP活力為0.0035金氏單位/gprot，對(duì)照組（C）ACP活力為0.0042金氏單位/gprot，但是三組間無(wú)顯著差異（p＞0.05）。

圖1 處理后各組ACP活力比較

2.2.2 處理后各組間德國(guó)小蠊雄成蟲體內(nèi) AKP的活力比較

由圖2可以看出四環(huán)素組（T）AKP活性最高，抗生素混合處理組（AT）AKP 活力最低。其中四環(huán)素組（T）的AKP活力為0.00047 金氏單位/gprot ,抗生素混合處理組（AT）AKP活力為0.000324金氏單位/gprot，對(duì)照組（C）AKP活力為0.00041金氏單位/gprot，但是三組間無(wú)顯著差異（p＞0.05）。

圖2 處理后各組AKP活力比較

2.2.3 處理后各組間德國(guó)小蠊體內(nèi) GST的活力比較

由圖3可以看出四環(huán)素組（T）GST活性最高，對(duì)照組GST 活力最低。其中四環(huán)素組（T）的GST活力為3.63金氏單位/gprot , 抗生素混合處理組（AT）GST活力為3.60金氏單位/gprot，對(duì)照組（C）GST活力為3.27金氏單位/gprot，三組間無(wú)顯著差異（p＞0.05）。

圖3 處理后各組GST活力比較

3 討論

腸道菌群在德國(guó)小蠊的營(yíng)養(yǎng)代謝中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，抗生素的使用會(huì)對(duì)腸道微生物群產(chǎn)生多種負(fù)面影響，包括物種多樣性降低、代謝活動(dòng)改變和抗生素耐藥微生物的選擇，這反過來(lái)又將影響宿主的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)代謝[24]。本研究試驗(yàn)結(jié)果顯示抗生素的處理對(duì)德國(guó)小蠊雄成蟲的營(yíng)養(yǎng)利用有顯著影響，其中四環(huán)素處理和抗生素混合處理顯著降低了德國(guó)小蠊雄成蟲的相對(duì)取食量（p＜0.05）和食物利用率（p＜0.05），顯著提高了四環(huán)素組的近似消化率（p＜0.05），顯著降低了四環(huán)素處理組的德國(guó)小蠊的體重（p＜0.05）。研究表明腸道微生物群會(huì)影響宿主飲食中的能量收集和能量?jī)?chǔ)存[25]，是宿主能量攝取和儲(chǔ)存的重要調(diào)節(jié)劑[26]。腸道微生物群可以通過調(diào)節(jié)宿主的多種內(nèi)分泌、神經(jīng)和免疫途徑來(lái)影響宿主的基本功能，包括消化、能量代謝等[27]。

先前研究表明腸道菌群在德國(guó)小蠊的代謝解毒機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，抗生素的處理將導(dǎo)致德國(guó)小蠊腸道微生物群的結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生變化，這種變化可能會(huì)對(duì)宿主的殺蟲劑耐藥性產(chǎn)生影響[28]。然而，關(guān)于腸道微生物如何影響德國(guó)小蠊解毒機(jī)制尚不清晰。本文通過實(shí)驗(yàn)顯示抗生素處理后的德國(guó)小蠊體內(nèi)酸性磷酸酶、堿性磷酸酶以及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性與對(duì)照組相比沒有顯著性差異，結(jié)果表明德國(guó)小蠊腸道微生物的改變不會(huì)顯著影響宿主本身的解毒酶活性。當(dāng)然，抗生素處理后的宿主本身代謝活性的穩(wěn)定也很可能與抗生素間隔處理的方式和處理時(shí)間有關(guān)。有研究表明因抗生素處理導(dǎo)致的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及微生物種類、組成、豐度等的變化會(huì)在一定的時(shí)間內(nèi)在一定程度上有所恢復(fù)[29,30]?？股靥幚聿伙@著影響德國(guó)小蠊體內(nèi)解毒酶活性也可能是因?yàn)槟c道微生物對(duì)宿主解毒機(jī)制的影響不是通過誘導(dǎo)體內(nèi)解毒酶活性，而是通過腸道微生物本身對(duì)殺蟲劑的解毒作用，降低了殺蟲劑的濃度和毒性[31-34]。

對(duì)于長(zhǎng)期接觸抗生素對(duì)腸道微生物群所造成的生態(tài)后果，包括抗生素耐藥性等的了解仍然是有限的。在這里，我們研究了長(zhǎng)期接觸單一種抗生素和多種抗生素混合對(duì)德國(guó)小蠊雄成蟲營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)指標(biāo)和解毒酶活性所造成的變化，發(fā)現(xiàn)腸道菌群生態(tài)紊亂降低了德國(guó)小蠊的體重和取食量，對(duì)德國(guó)小蠊的營(yíng)養(yǎng)利用有顯著影響；而對(duì)德國(guó)小蠊解毒酶活性沒有顯著影響，且在長(zhǎng)期的抗生素選擇壓力中，腸道微生物受單種抗生素和多種抗生素共同脅迫的后果對(duì)其解毒酶活性沒有顯著差異。本試驗(yàn)為抗生素的使用和腸道微生物的功能提供科學(xué)思路。