茶葉中的微生物多樣性及有害微生物污染的檢測

陳思琪

[福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院 國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（福州），福建 福州 350002]

茶被譽為世界三大飲料之一，當前，我國茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展基礎(chǔ)雄厚，品牌效應(yīng)顯著，逐漸成為多個省份經(jīng)濟的支柱性產(chǎn)業(yè)。隨著茶文化的普及和物質(zhì)生活水平的提高，人們對市場中的茶葉及其制品安全的要求也逐漸提高，同時，國家對茶葉安全的監(jiān)管力度也在不斷加大，針對不同茶葉制定了對應(yīng)的行業(yè)標準。如何進一步提升對茶產(chǎn)品質(zhì)量管控力度問題，逐漸引起大眾的熱議。

從茶樹的培育、病蟲害的防治、茶葉加工的生物發(fā)酵、到茶葉的儲存和功能成分制備，茶葉的微生物的應(yīng)用覆蓋面極廣，在茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中發(fā)揮著具有顯著的作用。但是，茶葉中有害微生物的存在會對人體健康造成一定的風險，也影響著茶葉出口貿(mào)易的發(fā)展。

1 茶葉中的微生物應(yīng)用

1.1 茶樹培育與病蟲害防治中的微生物應(yīng)用

茶園土壤的生態(tài)系統(tǒng)能夠直接影響茶樹的生長，繼而影響茶葉的品質(zhì)，微生物作為生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要媒介，在茶樹的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著巨大的作用。長期以來，隨著專業(yè)人員對茶園土壤微生物系統(tǒng)中的不斷研究，茶樹根際微生物的作用也為人所熟知。茶園土壤微生物群落種類繁多、數(shù)量龐大，能夠通過新陳代謝分解土壤中的物質(zhì)增加土壤的養(yǎng)分，從而提高茶葉品質(zhì)，特定的微生物還具有固氮、促進氮磷鉀等微量元素的吸收、促進發(fā)芽、提高生長速度等作用。有效利用微生物菌劑作為培育茶樹的綠色肥料，不僅能夠增強茶樹耐受力、提高茶葉產(chǎn)量，對于改善濫用化肥導致的農(nóng)藥殘留重金屬超標問題也具有促進作用[1,2]。

茶樹的病蟲害防治一直以來是茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的關(guān)鍵問題。生物農(nóng)藥在茶樹病蟲害綜合治理當中的應(yīng)用被逐漸推廣，研究表明多種細菌、真菌及病毒對特定的病蟲害具有針對性的防治作用[1-3]。例如：應(yīng)用廣泛的蘇云金芽孢桿菌生物制劑可以在昆蟲腸道中產(chǎn)生伴孢晶體蛋白毒素從而殺滅害蟲，主要用于防治鱗翅目昆蟲；分離的芽孢桿菌能有效抑制多種茶樹葉斑病；白僵菌等真菌生物農(nóng)藥可以通過制劑噴灑孢子侵染昆蟲，從而抑制其生長代謝達到防治害蟲的目的；病毒生物農(nóng)藥在防控茶毛蟲、茶尺蠖上也具有相關(guān)制劑，可有效防控對應(yīng)的病蟲害[1-3]。

1.2 茶葉加工中的微生物應(yīng)用

1.2.1 茶產(chǎn)品的微生物發(fā)酵

品種繁多的茶樹是茶產(chǎn)品多樣化的重要原因，產(chǎn)品制作工藝的不同大大豐富了茶葉產(chǎn)品的種類。微生物發(fā)酵長期應(yīng)用于黑茶、紅茶、茶飲料等產(chǎn)品的生產(chǎn)制作過程，大量微生物隨著渥堆環(huán)境溫、濕度等條件的變化與茶葉產(chǎn)生化學反應(yīng)，形成茶葉特有的色、香、味[4]。茯磚茶的“發(fā)花”工藝則是茶葉生產(chǎn)中典型的微生物應(yīng)用，在冠突散囊菌、黑曲霉、毛霉等微生物等作用下形成其特殊的風味[5]。在紅茶及茶飲料的生產(chǎn)加工中，乳酸菌、酵母菌、真菌的應(yīng)用也極為廣泛。

微生物發(fā)酵極大程度豐富了茶葉的食品功能，在調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、消食、解膩等多種保健功能上也取得一定成效。此外，茶產(chǎn)品生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的茶渣廢料通過微生物發(fā)酵作用可以制備成營養(yǎng)元素豐富的肥料、飼料等副產(chǎn)品，或通過提取其木質(zhì)素纖維酶、葡萄糖、果膠酶等有效成分進一步擴大其經(jīng)濟價值[3]。

1.2.2 茶葉的儲存及功能成分制備

良好的茶葉貯藏關(guān)鍵在于做好密封、防潮、防異味，貯藏環(huán)境宜遠離污染源且無異味，有一定的防潮、防塵措施，避免日光照射以及合適的環(huán)境溫度。目前，微生物在茶葉貯藏上已經(jīng)得到應(yīng)用，有研究發(fā)現(xiàn)將嫌氣性蠟樣芽孢桿菌經(jīng)過低溫處理成菌粉，按比例添加于茶葉中密封，存放在陰涼干燥處能夠?qū)Σ枞~起到隔氧保鮮的作用[3]。

茶葉中含有茶氨酸、茶多糖、茶多酚、氨基酸等對人體有益的功能成分，利用微生物發(fā)酵可產(chǎn)生用于合成茶氨酸的三種主要催化酶，即谷氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶。有研究發(fā)現(xiàn)一種含有谷氨酰胺酶的細菌香茅醇假單胞菌，在特定堿性條件下能夠快速催化合成茶葉功能成分茶氨酸[3]。

2 茶葉中微生物污染及檢測方法

在茶葉的制作、儲存、運輸過程中有可能產(chǎn)生茶葉污染問題，不僅影響茶葉品質(zhì)，嚴重會引起健康問題。污染問題除了出現(xiàn)在農(nóng)藥殘留、重金屬超標等領(lǐng)域，有害微生物污染也普遍存在。研究發(fā)現(xiàn)茶葉中的細菌污染主要包括一些腸道細菌如大腸桿菌、沙門氏菌，真菌污染主要是霉菌及其代謝出現(xiàn)的真菌毒素。

2.1 細菌污染

2.1.1 大腸菌群污染

大腸菌群與腸道致病菌有著密切的聯(lián)系，一些特殊血清型的大腸桿菌已被列為典型的病原菌，能夠?qū)е赂篂a、炎癥、敗血癥等癥狀，對人體健康產(chǎn)生一定的危害。在食品微生物檢測中的常規(guī)項目主要包括大腸菌群、總大腸菌群、耐熱大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌等。由于大腸菌群廣泛存在于環(huán)境和人體腸道中，具有較高的傳播率及環(huán)境耐受力，因此容易在茶葉加工或儲存過程中造成污染。近年來，研究人員在茉莉花茶、普洱茶、綠茶等多種茶葉中都檢測到大腸菌群的存在[4-8]。

當前大腸菌群檢測方法主要有平板法、乳糖管發(fā)酵法、LST肉湯發(fā)酵法、疏水柵格濾膜法、熒光實時PCR法、PCR試紙條快速檢測法、環(huán)介導恒溫擴增法（LAMP）、MPCR-DHPLC色譜法、酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）等。雖然可用的檢測方法種類較多，但考慮到技術(shù)難度以及檢測成本問題，現(xiàn)有的食品檢測還是以傳統(tǒng)的平板法以及多管發(fā)酵法較為普及[9]。

2.1.2 沙門氏菌污染

沙門氏菌作為食源性疾病的主要誘發(fā)病原菌之一，能夠引起腸胃炎型、敗血癥型、類傷寒型、類感冒型以及霍亂型等五種疾病，已經(jīng)成為眾多食品安全檢測中的常規(guī)項目。研究表明，沙門氏菌在對抗惡劣環(huán)境下能夠維持VBNC狀態(tài)，這種狀態(tài)為活態(tài)具有一定代謝活力但不可在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，極可能逃避傳統(tǒng)的檢測方法[10]。因此，由于沙門氏菌可生長溫度范圍廣，營養(yǎng)需求不高，具有較強的耐干、耐熱性的特性，在茶葉生產(chǎn)過程中具有易污染、易存活的特點，且研究發(fā)現(xiàn)熱水沖泡不能完全殺死茶葉中存活的沙門氏菌，存在較大的污染風險[10]。

目前沙門氏菌的檢測方法有常規(guī)增菌法、聚合酶鏈式反應(yīng)法、酶聯(lián)免疫法、實時熒光PCR檢測法、垂直膜過濾法、環(huán)介導恒溫擴增法（LAMP）、免疫色譜反應(yīng)法等。

2.2 霉菌污染

霉菌由于其孢子繁殖特性能夠在環(huán)境中大面積傳播，具有較強的污染性，不僅能夠誘發(fā)茶樹的病蟲害，在茶葉加工、存放過程中也極易存活。數(shù)據(jù)表明，不論是包裝成品茶還是散裝茶都存在霉菌污染的情況，茶葉霉菌污染的優(yōu)勢屬有曲霉屬、青霉屬、雜霉屬等[11]。霉菌毒素是霉菌的次生代謝物，種類繁多難以分類，當被攝入吸收時可以導致動植物患病或死亡。研究發(fā)現(xiàn)，霉菌的這些有毒次生代謝物可以在茶葉生產(chǎn)的任一階段開始積累，存在較大的健康危害。

當前針對食品微生物霉菌的計數(shù)檢測方法主要參照國家推薦標準GB/T 4789.15—2016，也可采用實時熒光定量PCR針對特定種的霉菌進行分子檢測，如黃曲霉、煙曲霉、環(huán)曲霉等，而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法能夠?qū)Χ喾N霉菌毒素進行測定。

3 茶葉微生物檢測標準

我國食品安全檢測技術(shù)已經(jīng)形成較為完整的檢測體系，與微生物相關(guān)檢測項目覆蓋了多種食品類別中，并設(shè)定了對應(yīng)的定量或定性指標。國家食品安全監(jiān)管部門針對茶產(chǎn)品質(zhì)量安全問題出臺了許多監(jiān)管措施，包括一系列的檢測標準。這些茶產(chǎn)品標準涵蓋了多方面，其中，感官品質(zhì)包括外形、湯色、香氣、滋味、葉底，理化成分包括茶多酚、游離氨基酸總量、咖啡堿、兒茶素等，農(nóng)藥殘留包括六六六、滴滴涕、三氯殺螨醇、氰戊菊酯等，營養(yǎng)元素包括鉀、鈣、鈉、鎂、鋁等，污染物包括鉛、銅、鉻、鎘、錫等。

相比之下，我國在茶葉微生物檢測要求上尚未制定國家強制性標準，主要參照食品的相關(guān)檢驗方法。通過對檢驗標準的查詢發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)行的與茶有關(guān)檢測推薦性國家標準中，有明確注明致病菌檢測指標的標準有GB/T 21733—2008《茶飲料》、GB/T 22111—2008 《地理標志產(chǎn)品 普洱茶》，檢測項目包括沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌，其中茶飲料的微生物檢測指標還包括菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌、酵母以及商業(yè)無菌檢測。涉及大腸菌群檢測指標的國家推薦性標準有GB/T 18745—2006《地理標志產(chǎn)品 武夷巖茶》、GB/T 20354—2006《地理標志產(chǎn)品 安吉白茶》、GB/T 20360—2006《地理標志產(chǎn)品 烏牛早茶》。GB/T 9833.3—2013《緊壓茶 第3部分：茯磚茶》中明確了茯磚茶的冠突散囊菌檢測考核指標。此外，GB/Z 21722—2008《出口茶葉質(zhì)量安全控制規(guī)范》中將出口茶葉微生物污染列為其他檢驗項目。

4 茶葉微生物檢測展望

茶葉顯然已經(jīng)成為我國重要的發(fā)展產(chǎn)業(yè)，當前我國從茶園開墾、道路水利系統(tǒng)、施肥管理、茶葉生產(chǎn)、再到后期的茶葉儲存都已出臺較詳細的茶葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范，對于茶葉產(chǎn)品的農(nóng)殘、重金屬等檢測標準也較為完整，這些逐年完善的檢測標準不僅加大了對茶企的監(jiān)管力度，更為茶葉質(zhì)量提升發(fā)揮了積極的作用，但我國對于茶葉有害微生物卻尚未出臺強制檢測指標。

美國、日本及部分歐盟發(fā)達國家已經(jīng)將茶葉有害微生物列為試驗項目，有害微生物污染問題便成為我國茶葉出口的限制原因之一。數(shù)據(jù)顯示，在我國出口茶葉中曾檢出大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌及黃曲霉等有害微生物，在一定程度上限制了我國茶出口產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[12]?；诰G色茶葉的標準在未來有逐漸提升的趨勢，而茶葉的有害微生物污染危及人體健康，這一方面要求國家應(yīng)該嚴格把控茶產(chǎn)業(yè)的每一環(huán)節(jié)，另一方面顯示我國應(yīng)該加快完善茶產(chǎn)業(yè)的微生物檢測標準。而且茶葉微生物的檢測能夠在一定程度上反映茶葉生產(chǎn)加工過程中的規(guī)范程度。茶葉微生物檢測標準的推行存在一定的必要性，應(yīng)對具有典型污染的微生物設(shè)定檢測指標，以推動茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。