基于GPX4通路調控細胞鐵死亡探討中醫(yī)“瘀證”與骨質疏松癥的關系

宋重東，蔣宜偉，?，麻永勝，周玉英，郝東昶，劉沛，楊洋

（1. 甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000； 2. 甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是最常見的骨骼疾病，是一種以骨量低，骨組織微結構損壞，導致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病，分為原發(fā)性、繼發(fā)性和特發(fā)性三大類。由于該病的發(fā)病過程較為隱匿，加之人口老齡化，預計未來OP 的患病率將顯著升高。OP 主要發(fā)生在絕經(jīng)后婦女和老年男性中，截至2018年，全球大約2億人患有OP，大約890萬人骨折由骨質疏松性骨折引起，這些骨折發(fā)生主要在髖部、椎骨和前臂遠端，并呈現(xiàn)高發(fā)病率、高病死率和生活質量下降等特點，不僅歸因于骨折本身，也與合并癥的高發(fā)生率息息相關［1］，且其帶來的經(jīng)濟負擔也越來越重。中醫(yī)學關于OP的診療多從肝、脾、腎三臟虛證著手，筆者通過查閱古籍發(fā)現(xiàn)，“虛”與“瘀”關系密切，當聯(lián)合論治。但是現(xiàn)代醫(yī)學有關中醫(yī)“瘀證”的相關研究尚不完善，從其理論出發(fā)治療OP缺乏強有力的現(xiàn)代醫(yī)學證據(jù)支撐。DIXON 等［2］在2012 年首次提出了鐵死亡這個概念，其與既往的細胞凋亡、自噬、壞死、焦亡等細胞死亡形式不同，是一種鐵依賴性的、脂質過氧化反應物堆積的細胞死亡方式。在多種疾病中鐵死亡均發(fā)揮重要作用。筆者從GPX4 通路調控細胞鐵死亡研究的角度出發(fā)，將OP與“瘀”之間的聯(lián)系作一綜述，繼而為“虛瘀共治”，即在傳統(tǒng)的補腎、滋肝、健脾的治法上聯(lián)合活血祛瘀療法提供新思路。

1 中醫(yī)學“瘀證”理論與OP辨證機理

1.1 “瘀證”的中醫(yī)學認識

瘀者，《辭源》釋義：“淤，積血之病也”，此釋義說明“瘀”的病理狀態(tài)，《說文解字》曰：“瘀，積血也”，言及“瘀”為病理產(chǎn)物。中醫(yī)學認為“瘀”可分為血瘀與瘀血，其不僅是一種病癥，也是一種病理產(chǎn)物，由各種致病因素而生，在體內已成瘀之后又可滋生他病。

1.2 中醫(yī)學“瘀證”與OP的聯(lián)系

中醫(yī)學雖早有“瘀證”之論，但并無OP 的病名，然翻閱醫(yī)籍可以發(fā)現(xiàn)OP當屬“骨痹”“骨痿”之類?！端貑枴ゐ粽撈吩疲骸澳I氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”。《素問·逆調論篇》云：“太陽氣衰，腎脂枯不長；一水不能勝兩火，腎者水也，而生于骨，腎不生，則髓不能滿，故寒甚至骨也……病名曰骨痹，是人當攣節(jié)也?！監(jiān)P作為一種增齡性骨代謝疾病，在現(xiàn)代臨床中表現(xiàn)出的骨痛乏力、脊柱變形、骨折等癥狀與古籍記載中隨著年齡增長腎虛骨枯而出現(xiàn)的一系列癥狀極為切合。OP的臨床癥狀與“瘀證”之間存在緊密的聯(lián)系，瘀血致病易生阻滯，氣血津液無法濡養(yǎng)周身臟腑及筋骨肌肉，筋骨肌肉也由榮致痿。唐容川曾言“瘀血不去，新血不生”，瘀血已然生成后，積而不行，停留于經(jīng)絡關節(jié)處，新血無從生成，進而血虛也進一步加重，虛中夾瘀，不榮而生痛，《證治要訣》曰：“痛則不通，通則不痛?！毖鲎铚?，也進一步加重了骨質疏松的相關癥狀［3］。

1.3 “瘀證”與臟腑及OP的關系

歷代醫(yī)家關于“瘀證”多有論著，現(xiàn)代中醫(yī)普遍認為“瘀”為一個繼發(fā)性病因，故而多有兼證。如《素問·調經(jīng)論篇》言：“血有余則怒，不足則恐，血氣未并，五藏安定，孫絡水溢，則經(jīng)有留血”，此語說明臟腑安定時，外邪無以擾亂血氣，臟腑不安則邪氣攪擾孫絡，瘀血乃成?！梆鲎C”與整體聯(lián)系密切，“瘀”成則兼證存。第一，瘀必兼氣滯，中醫(yī)言血為氣之母，氣運依賴血載，母瘀而凝塞，子失其載所，無以運行，所以血瘀必有氣滯。氣機條達依賴肝的疏泄功能，氣血暢通與人運動功能密切相關，《素問·五藏生成篇》曰：“肝受血而能視，足受血而能步，掌受血而能握，指受血而能攝。”氣滯血瘀則周身失卻血受，影響運動功能，久之而致骨痿。第二，瘀多氣虛，氣為血之帥，氣能攝血且助推血液運行，氣虛則無以行血，故而成瘀?！夺t(yī)宗金鑒·內治雜證法》云：“筋骨間作痛者，肝腎之氣傷也?！备文I氣虛也是導致OP 的重要因素。第三，瘀久必致臟腑虛，中醫(yī)學認為人無時無刻不處于“變動”之中，“變動”重在氣血津液運行，運行通暢則周身皆得以濡養(yǎng)。如“瘀”形成，則臟腑經(jīng)絡都失其養(yǎng)，失去正常功能。OP的病機多責之于腎，腎精虛衰是主要原因，但臟腑之間互相影響，多臟腑之間病理互相作用導致了OP。肺與腎為相生關系，同時肺虛失卻肅降會導致腎不納氣，影響腎封藏功能，腎精不藏則無以生髓，會導致骨痿發(fā)生。脾虛無以運化，無法輸布精微物質給予周身，如《脾胃論》曰：“脾病則下流乘腎，土克水，則骨乏無力，是為骨蝕。”可見脾虛也會導致OP 發(fā)生。肝與OP 也有著密切聯(lián)系，《諸病源候論·虛勞諸病上》言：“肝主筋而藏血，腎主骨而生髓，虛勞損血耗髓，故傷筋骨也?！备文I虛損致使筋骨失用，繼而發(fā)為骨痿。臟腑虛衰且互相作用，久之變成氣血皆虛，津傷液耗的虛證，從而“因瘀致虛”，導致OP的發(fā)生或加劇。

2 GPX4通路調控鐵死亡與骨代謝

2.1 細胞鐵死亡

細胞死亡是機體最基本單位層面上的生命終結，細胞死亡對于機體生長發(fā)育、內平衡以及預防癌癥等細胞增殖性疾病至關重要。2017 年細胞死亡命名委員會（Nomenclature Committee on Cell Death，NCCD）［4］從形態(tài)學、生化和功能的角度對細胞死亡進行了新的詮釋，從多種途徑展開并揭示了協(xié)調多種細胞死亡途徑的新機制，囊括了多種細胞死亡方式，包括內在凋亡（intrinsic apoptosis）、外在凋亡（extrinsic apoptosis）、線粒體通透性轉變（mitochondrial permeability transition，MPT）驅動的壞死（MPT－driven necrosis）、壞死性凋亡（necroptosis）、焦亡（pyroptosis）、對聚ADP 核糖聚合酶1 依賴性死亡（parthanatos）、嵌頓細胞死亡（entotic cell death）、中性粒細胞細胞外陷阱細胞死亡（NETotic cell death）、溶酶體依賴性細胞死亡（lysosomedependent cell death）、自噬依賴性細胞死亡（autophagydependent cell death）、免疫原性細胞死亡（immunogenic cell death）、細胞衰老（cellular senescence）、有絲分裂崩潰（mitotic catastrophe）和鐵死亡（ferroptosis）。其中鐵死亡是2012年由DIXON 等人提出的，定義為由細胞內微環(huán)境的特定擾動引發(fā)的、引起嚴重的脂質過氧化，導致細胞內活性氧（reactive oxidative species，ROS）大量堆積和鐵依賴的一種新的細胞死亡形式。鐵死亡的形態(tài)學改變不同于其他細胞死亡方式，通過電子顯微鏡，可以觀察到其呈現(xiàn)壞死性改變：以線粒體改變?yōu)橹?，包括皺縮、膜密度的增加、嵴減少/消失、核大小正常但缺乏染色質聚集、細胞膜起泡與無破裂［5］。

2.2 GPX4與鐵死亡

目前已知引起鐵死亡有兩大類誘導劑：第一類可以通過胱氨酸－谷氨酸轉運蛋白（system XC－）發(fā)揮作用，包括柳氮磺胺吡啶和谷氨酸，而第二類可以直接抑制谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）的活性如RSL3 和DP17［6］。ANGELI 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，由RSL3 直接靶向的GPX4 通過催化依賴谷胱甘肽的脂質過氧化物還原為脂醇來限制脂質過氧化，從而成為鐵死亡的主要內源性抑制劑［8-9］。越來越多的證據(jù)表明GPX4的促生存功能有助于組織發(fā)育和維持機體內動態(tài)平衡。GPX4-/-小鼠模型表現(xiàn)出胚胎致死性和完全外顯性［6，9-11］。此外GPX4在小鼠體內誘導的鐵死亡或組織特異性消融可引起多種病理情況，包括急性腎或肝損傷［12-13］、神經(jīng)變性［14-15］，以及對感染的免疫力下降［16］。SMITH等［17］發(fā)現(xiàn)GPX4的突變導致脊椎干骺端發(fā)育不良，這些損傷及病理性改變都可以通過抑制鐵死亡來預防或減輕。因此，GPX4是細胞鐵死亡最為主要的內源性抑制劑，并且GPX4通路調控鐵死亡對多種疾病以及機體內變化產(chǎn)生著重要的影響。

2.3 細胞鐵死亡與OP

鐵代謝紊亂，包括缺鐵和鐵過載均可導致OP［18-21］。OP 總屬于骨代謝疾病，破骨細胞的骨吸收作用和成骨細胞的骨重建作用之間的平衡共同維持著骨代謝穩(wěn)態(tài)和骨組織完整性［22］。破骨細胞與成骨細胞如發(fā)生鐵死亡則均可導致骨代謝穩(wěn)態(tài)失衡，從而導致OP的發(fā)生。有研究表明鐵離子可通過產(chǎn)生ROS 促進破骨細胞分化和骨吸收［23］。鐵螯合劑（desferoxamine，DFO）在體外抑制破骨細胞形成［24］，破骨細胞分化過程中常氧條件下的鐵饑餓反應和鐵蛋白吞噬證實了GPX4 通路介導下鐵死亡的參與［25］。先前的研究表明，鐵對骨髓間充質干細胞成骨分化的抑制作用被提出，并且小鼠中的鐵過載與致密骨骨祖細胞中鐵蛋白增加及Runt 相關轉錄因子（Runt－related transcription factor，RUNX）家族中RUNX2 水平降低有關［21］。大劑量地塞米松可通過下調GPX4 和system XC－激活成骨細胞誘導鐵死亡［26］。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導的成骨細胞前體細胞系MC3T3－EI 中GPX4 顯著降低，ROS 水平升高，線粒體通常更小，管狀更少，膜染色更深，內膜折疊明顯被破壞。此外，MC3T3－EI 細胞分化為成骨細胞和礦化結節(jié)形成的能力在高糖環(huán)境中降低，在小鼠的成骨細胞中也觀察到了類似的現(xiàn)象［27-28］。從上述研究結果中不難得出結論，破骨細胞的鐵死亡會減少骨吸收的發(fā)生，而成骨細胞的鐵死亡會導致骨形成減少，那么由破骨細胞與成骨細胞共同維系的骨代謝穩(wěn)態(tài)則會失衡，進而導致OP 的發(fā)生。

3 “活血祛瘀”療法與GPX4調控細胞鐵死亡治療OP的相關性

GPX4 通路調控細胞鐵死亡的發(fā)現(xiàn)是現(xiàn)代醫(yī)學和細胞生物學的一大進展，不但在多領域被廣泛應用，而且通過分析鐵死亡與OP 之間的關系，也為OP 的認識與治療提供了新思路。歷代醫(yī)家及現(xiàn)代中醫(yī)學治療OP 多以虛證論治，筆者于前文已詳述，在傳統(tǒng)補虛療法中增加活血祛瘀的中藥應用于OP 臨床治療中效果顯著，且在多種臨床及基礎研究中發(fā)現(xiàn)，“活血祛瘀”方藥可經(jīng)GPX4 通路調控細胞鐵死亡進而在疾病治療中發(fā)揮重要作用。

3.1 “活血祛瘀”聯(lián)合補虛療法在OP治療中的應用

在OP診療中歷代醫(yī)家多以臟腑虧虛立論，補益臟腑的各類療法也取得了良好的治療效果［29］，但臟腑虧虛與“瘀證”之間關系密切，應當聯(lián)和論治。付仁婷［30］用自擬補腎活血湯治療2 型糖尿病性骨質疏松患者38 例，有效率達91.7%。王金華［31］采用自擬補腎活血壯骨湯治療老年骨質疏松性腰痛，有效率高達95.31%。湯志利等［32］用補腎活血湯（熟地黃、杜仲、枸杞子、補骨脂、菟絲子、當歸尾、沒藥、山茱萸、紅花、獨活及肉蓯蓉）治療絕經(jīng)后OP，取得了顯著效果。張鵬等［33］采用補腎及活血化瘀中藥治療OP患者，發(fā)現(xiàn)活血化瘀中藥能夠抑制破骨細胞活性而治療OP，“祛瘀”法治療有效率79.2%，遠高于其他組，能夠緩解臨床癥狀，效果明顯。以“活血”“祛瘀”聯(lián)合補虛為治則，施以補腎、活血中藥而成的補腎活血方對于治療多種類型的OP療效確切［34-36］。

3.2 “活血祛瘀”療法與GPX4通路調控細胞鐵死亡的關系

有學者研究發(fā)現(xiàn)活血解毒法可通過影響GPX4 通路調控鐵死亡進而治療腦出血火毒證，而用活血解毒中藥醒腦靜注射液治療后能夠顯著降低腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）大鼠病灶腦組織轉鐵蛋白受體、IRP－2 mRNA 蛋白表達，升高FPN－1 mRNA蛋白表達，對于減輕腦神經(jīng)損傷和腦組織鐵代謝改變等可取得良好效果，從而證實其對ICH大鼠腦組織鐵代謝有調控作用［37］。何信用［38］采用“活血”“祛瘀”法，使用二陳湯合桃紅四物湯含藥血清干預氧化低密度脂蛋白（ox－LDL）誘導的細胞氧化損傷及鐵死亡后，抗氧化系統(tǒng)相關標志GPX4、GPX4 mRNA等蛋白表達明顯上調，表明“活血祛瘀”法對該細胞氧化損傷及鐵死亡具有一定抑制作用?！盎钛铕觥鳖愔嗅t(yī)藥復方對GPX4介導的細胞鐵死亡引起的疾病確有療效，同時，具有活血化瘀功效的單味中藥及單體成分在抑制GPX4 介導的細胞鐵死亡中所發(fā)揮的作用也逐步被證實，如中華獼猴桃［39］、二氫異丹參酮Ⅰ［39］、隱丹參酮［40］、銀杏黃酮［41］等。

綜上所述，從“瘀”論治OP具有良好的臨床效果，結合GPX4調控細胞鐵死亡治療“瘀證”類疾病相關研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GPX4 調控細胞鐵死亡治療OP 或以“活血祛瘀”療法為基礎，因此基于GPX4 通路調控細胞鐵死亡探討中醫(yī)“瘀證”與OP的關系具有重要的研究意義。

4 總結與展望

OP作為臨床上常見的一種全身代謝性骨病，防治該病的相關研究一直是學界關注的熱點和難點。OP的發(fā)病機制復雜，其中鐵死亡作為一種重要的細胞死亡方式，在研究和治療OP中意義重大，尤其GPX4作為介導細胞鐵死亡的關鍵通路，通過調控成骨細胞及破骨細胞的鐵代謝平衡及ROS含量，進而維持骨代謝穩(wěn)態(tài)，達到防治OP的目的。而中醫(yī)學在辨證論治OP時多以“虛”著眼，通過總結相關研究發(fā)現(xiàn)，“瘀證”理論在OP防治中十分關鍵，“活血祛瘀”類方藥與GPX4通路調控細胞鐵死亡具有緊密聯(lián)系。目前相關研究報道對GPX4介導細胞鐵死亡及“瘀證”和OP之間的關系尚未闡釋清楚，希冀后續(xù)更多研究能夠闡明中醫(yī)“活血祛瘀”類方藥通過GPX4 通路調控細胞鐵死亡途徑防治OP 的機制，基于GPX4通路為臨床防治OP新藥研發(fā)提供更多思路及靶點，同時也為中醫(yī)藥防治OP提供科學的依據(jù)。