急性冠脈綜合征氣虛血瘀患者LC－MS血清代謝組學(xué)分析

陳婷，任廣勝，李姍珊?，徐燕

（1. 上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，上海 201899； 2. 上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院，上海 201899；3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203）

2019 年調(diào)查顯示，每5例死亡病例中就有2例死于心血管病（cardiovascular disease，CVD），推算冠心病患者1 139萬，且CVD給國家及個人造成嚴(yán)重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，缺血性心臟?。╥schemic heart disease，IHD）的次均住院費(fèi)用為14 060.20元，其中心絞痛15 486.51元、急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）30 368.54元［1］。急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）是冠心病中的急危重癥，發(fā)病后病死率高（一年后病死率約15%，五年后病死率約20%［2］），包括ST段抬高型心肌梗死（ST elevated myocardial infarction，STEMI）、非ST 抬高型心肌梗死（non ST elevated myocardial infarction，NSTEMI）以及不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina pectoris，UAP）。ACS屬“胸痹心痛”“真心痛”“卒心痛”范疇，常見本虛標(biāo)實或者虛實夾雜，本虛常見“氣虛、陽虛、陰虛、血虛”，標(biāo)實常見“血瘀、寒凝、氣滯、痰凝”，其中氣虛血瘀證是“胸痹心痛”病中的常見證型。代謝組學(xué)通過檢測代謝物水平的整體和動態(tài)變化，提取相關(guān)的生物代謝標(biāo)志物群體或標(biāo)志物簇［3］，有助于發(fā)現(xiàn)不同證型的特殊生物標(biāo)記物，加強(qiáng)對疾病發(fā)展過程中物質(zhì)代謝的了解［4］，促進(jìn)疾病證型診斷的客觀化［5］，更幫助了解“證”的內(nèi)涵與實質(zhì)。因此，本研究采用LC-MS非靶向法分析急性冠脈綜合征氣虛血瘀患者與健康人的代謝產(chǎn)物，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2020年9月—2022年6月在上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院門診或急診確診為ACS同時辨證符合氣虛血瘀證型的40例患者作為觀察組，其中男性31例、女性9例，年齡（64.75 ± 11.77）歲，體重指數(shù)（26.3 ± 2.51） kg/m2，吸煙27例，合并高血壓34例［病程（7.32 ± 3.03）年，平均收縮壓（139.09 ± 14.23） mm Hg，平均舒張壓（80.18 ± 18.75） mm Hg］，合并血脂異常者28例，合并糖尿病16 例，合并慢性腎臟病8 例。本研究同時納入同期在我院體檢的健康人群為對照組，其中男性23 例、女性17 例，年齡（51.88 ± 6.97）歲，體重指數(shù)（25.38 ± 1.88） kg/m2，吸煙16例。本研究已通過上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號：JZY201906。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

ACS 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照非ST 段抬高型急性冠狀動脈綜合征基層診療指南（2019 年）［6］及急性ST 段抬高型心肌梗死診斷和治療指南（2019）［7］。中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》［8］中氣虛血瘀證辨證標(biāo)準(zhǔn)，胸悶胸痛，心悸氣短，神倦乏力，面色紫暗，舌淡紫，脈弱而澀。健康人群中醫(yī)診斷參照《中醫(yī)體質(zhì)分類與判定》［9］中平和質(zhì)的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

主動脈夾層、肺栓塞等非冠脈堵塞引起的胸痛；嚴(yán)重心力衰竭；嚴(yán)重肺功能不全；肝功能衰竭；腎功能衰竭；惡性腫瘤；精神疾病患者；受孕或哺乳期女性，意識障礙等。

1.4 標(biāo)本采集和制備

觀察組取治療前在室溫下釆取靜脈血4 mL，對照組取清晨空腹靜脈血4 mL，3 000 r/min 離心10 min后收集血清置1.5 mL Eppendorf 管中，轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 代謝物檢測和分析

代謝組學(xué)的檢測和分析由上海百趣生物科技有限公司完成，包括樣品的處理、LC－MS 非靶向血清代謝組檢測和數(shù)據(jù)處理分析。

1.5.1 主要實驗儀器與試劑

超高效液相（Thermo Fisher Scientific，型號：Vanquish）；質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific，型號：Orbitrap Exploris 120）；離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific，型號：Heraeus Fresco17）；天平（Sartorius，型號：BSA124S－CW）；超聲儀（深圳市雷德邦電子有限公司，型號：PS－60AL）。

甲 醇（CNW Technologies） ；乙 腈（CNW Technologies）；乙酸銨（SIGMA－ALDRICH）；氨水（Fisher Chemical）；超純水（屈臣氏）。

1.5.2 樣品處理及檢測

移取50 μL 樣品至EP 管中，加入200 μL 提取液，甲醇∶乙腈=1∶1（V/V），含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物（正離子模式含氧化三甲胺－d、9 N－氧化物、4－氨基丁酸－2，2，3，3，4，4－d6、L－亮氨酸－5，5，5－d3；負(fù)離子模式含琥珀酸－2，2，3，3－d4、L－亮氨酸－5，5，5－d3、馬尿酸－d5），渦旋混勻30 s，超聲冰水浴10 min，-40 ℃靜置1 h； 將樣品4 ℃，12 000 r/min［離心力13 800 ×g，半徑8.6 cm］離心15 min；取上清于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測。使用Vanquish 超高效液相色譜儀，通過Waters ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm））液相色譜柱對目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離 。液相色譜A 相為水相，含25 mmol/L 乙酸銨和25 mmol/L 氨水，B 相為乙腈。樣品盤溫度：4 ℃，進(jìn)樣體積：2 μL。Orbitrap Exploris 120 質(zhì)譜儀能夠在控制軟件控制下進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用ProteoWizard 軟件將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)成mzXM 格式后，經(jīng)自主編寫的R程序包（內(nèi)核為XCMS）進(jìn)行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理 ，然后與BiotreeDB（V2.1）自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋，算法打分的Cutoff 值設(shè)為0.3。數(shù)據(jù)釆用平均中心化或 Pareto 標(biāo)度化進(jìn)行預(yù)處理之后釆用PCA分析。為強(qiáng)化組間差異，進(jìn)一步采用偏最小二乘法－判別分析（PLS－DA）分析。基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析包括數(shù)據(jù)預(yù)處理，PCA 分析，PLS－DA 分析，正交偏最小二乘法－判別分析（OPLS－DA），差異化合物篩選和鑒定。高級數(shù)據(jù)分析包括代謝通路分析。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)量控制

所有樣品另取等量上清混合成質(zhì)量控制（quality control，QC）樣品，QC 樣品相關(guān)性越接近于1（至少應(yīng) >0.8），說明整個方法穩(wěn)定性越好以及數(shù)據(jù)質(zhì)量越高。正負(fù)離子QC 樣品相關(guān)性分析見圖1、圖2，可以看出QC樣品相關(guān)性很高，說明本次實驗方法穩(wěn)定性高以及數(shù)據(jù)質(zhì)量也很高。

圖2 負(fù)離子QC樣品相關(guān)性分析

2.2 兩組正交偏最小二乘法－判別分析（OPLS－DA）比較

觀察組對對照組的OPLS－DA 模型由置換檢驗的點(diǎn)狀圖見圖3、圖4。正離子模式（positive ion mode，POS）下兩組間模型對Y 變量數(shù)據(jù)集的可解釋度（R2Y值）為 0.973、模型可預(yù)測度（Q2值）為 0.93，負(fù)離子模式（negative ion mode，NEG）下兩組間R2Y 值分別為0.961、Q2值分別為 0.914，說明觀察組與對照組兩者有良好的區(qū)分特性，兩者之間存在顯著的差異。

圖3 觀察組對對照組OPLS－DA模型的置換檢驗結(jié)果柱狀圖（POS）

圖4 觀察組對對照組OPLS－DA模型的置換檢驗結(jié)果柱狀圖（NEG）

2.3 觀察組與對照組的差異代謝物比較

本研究使用的卡值標(biāo)準(zhǔn)基于以下指標(biāo)：t檢驗的P值 < 0.05，OPLS－DA模型第一主成分的變量投影重要度（VIP） > 1，以及二級匹配的打分（MS2 score）取值［0，1］，數(shù)值越大越好。Q值是假設(shè)檢驗統(tǒng)計量（P值）經(jīng)多重假設(shè)檢驗校正之后的結(jié)果，是對P值的再統(tǒng)計。由此篩選出32 個符合條件的差異代謝物，POS 模式下分別為蕨內(nèi)酰胺、煙酰胺、次黃嘌呤、乙酰肼、7－甲基鳥嘌呤、苯丙氨酸、三丙酸甘油酯等，NEG 模式下分別為左旋纈氨酸、左旋正亮氨酸、谷氨酸、乙醇酸、花生四烯酸、α－D－葡萄糖、肌酐等。見表1。

表1 差異代謝物質(zhì)信息匯總

2.4 觀察組與對照組的代謝通路比較

本研究共得出58 條可能受差異代謝物擾動的代謝通路，其中8 條通路P值 < 0.05，11 條通路Impact ≥0.1，說明這些通路受差異代謝物擾動較大，可作為ACS 氣虛血瘀患者病理機(jī)制的潛在通路，其中4 條代謝通路（精氨酸和脯氨酸代謝，嘧啶代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，谷胱甘肽代謝）同時滿足P< 0.05及Impact ≥ 0.1，可能是與代謝物差異相關(guān)性最高的關(guān)鍵通路。見表2。

表2 差異代謝物代謝通路匯總表

2.5 差異代謝物的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

在取得每組對比差異代謝物的匹配信息后，分別對對應(yīng)物種human（hsa）的KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路搜索和調(diào)控互作網(wǎng)絡(luò)分析。調(diào)控分析的結(jié)果以網(wǎng)絡(luò)圖展示，結(jié)果見圖5。

圖5 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析圖

3 討論

冠心病是一種與炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的復(fù)雜人類疾病，代謝組學(xué)有助于闡明冠心病發(fā)生和發(fā)展的潛在機(jī)制［10］。ACS屬“胸痹心痛”范疇，《金匱要略》描述“胸痹之病，喘息咳唾，胸背痛，短氣，寸口脈沉而遲”，指出其病機(jī)為“陽微陰弦”，認(rèn)為胸痹是由于胸陽不振，氣虛血停瘀滯不通，陰邪下盛，導(dǎo)致氣機(jī)不暢，不通則痛。所以胸痹病虛實夾雜，而氣虛血瘀則是其重要的證型。自古以來，中醫(yī)藥一直是治療胸痹心痛的有效且重要的手段，但是無法客觀化、標(biāo)準(zhǔn)化一直是困擾中醫(yī)藥發(fā)展的難題。利用代謝組學(xué)檢測提取相關(guān)的生物代謝標(biāo)志物簇，有助于發(fā)現(xiàn)不同證型的差異代謝物及代謝通路、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步了解疾病發(fā)展過程中的物質(zhì)代謝，幫助了解疾病及證型的本質(zhì)，為中醫(yī)藥防治疾病提供理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，ACS 氣虛血瘀患者與健康人的顯著差異代謝物32 種，蕨內(nèi)酰胺、煙酰胺、次黃嘌呤、乙酰肼、7－甲基鳥嘌呤、苯丙氨酸、三丙酸甘油酯、L－纈氨酸、L－正亮氨酸、谷氨酸、乙醇酸、花生四烯酸、α－D－葡萄糖、肌酐、黃嘌呤、十二酸、假尿嘧啶核苷、左旋別蘇氨酸、甘油酸、D 木糖及D－絲氨酸等代謝物可作為鑒別二者的潛在生物標(biāo)志物。動脈粥樣硬化伴IHD 涉及兩個方面：第一是氧化應(yīng)激，過量產(chǎn)生降低谷胱甘肽（GSH）水平的活性氧（ROS），第二就是炎癥［11］。蕨內(nèi)酰胺是一種生物活性較強(qiáng)的谷胱甘肽酶，谷氨酸是谷胱甘肽的組成成分，兩者是體內(nèi)谷胱甘肽代謝的重要催化物及底物。谷胱甘肽是體內(nèi)能維持足夠的氧化還原細(xì)胞信號以控制生命過程所必需的氧化應(yīng)激的生理水平，還能限制導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷的過度氧化應(yīng)激，對生命至關(guān)重要［11］。煙酰胺主要用作維生素B3的營養(yǎng)補(bǔ)充，而維生素B3可以被用于合成輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）以助細(xì)胞能量代謝和防御，煙酰胺還可恢復(fù)細(xì)胞NAD 池和線粒體能量，減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)［12］。次黃嘌呤（HX）是黃嘌呤的前體，是嘌呤代謝的重要原料，HX 在黃嘌呤氧化酶（X0D）催化下形成尿酸，而尿酸升高是冠心病的重要危險因素［13］。甲基鳥嘌呤是一種抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP－1）的天然化合物，PARP－1 被公認(rèn)為與DNA修復(fù)有關(guān)，所以甲基鳥嘌呤可能阻止遺傳毒性DNA 的復(fù)制［14］。假尿嘧啶核苷目前常用于基因調(diào)控，在癌癥RNA 編輯修飾中應(yīng)用廣泛，常用于闡述基因表達(dá)、功能和潛在的分子機(jī)制［15］。苯丙氨酸、左旋纈氨酸、左旋正亮氨酸、左旋別蘇氨酸、D－絲氨酸等主要被用來合成人體蛋白質(zhì)，以達(dá)到機(jī)體蛋白質(zhì)的不斷更新和修復(fù)?；ㄉ南┧嵩诩?xì)胞內(nèi)主要通過環(huán)氧合酶（COX）途徑、脂氧合酶（LOX）途徑、細(xì)胞色素P450 單氧化酶（CYP450）途徑等進(jìn)行代謝［16］，可以產(chǎn)生大量的活性物質(zhì)，具有促炎和促血小板聚集作用，可能增加冠心病的風(fēng)險［17］。D－木糖與葡萄糖的化學(xué)性質(zhì)相似，參與磷酸戊糖代謝途徑（pentosephosphate pathway，PPP）。研究發(fā)現(xiàn)，脾胃氣虛、脾失健運(yùn)會導(dǎo)致代謝失調(diào)，出現(xiàn)消化動力不足、腸道吸收功能障礙，出現(xiàn)為血清D－木糖降低及尿D－木糖排出水平下降［18－20］。D－絲氨酸參與大腦發(fā)育、神經(jīng)元興奮、突觸可塑性以及學(xué)習(xí)和記憶的調(diào)節(jié)［21］，D－絲氨酸生成、氧化代謝途徑與糖尿病、癲癇、阿爾茨海默病等的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系［22］。

本研究共得出4 條（精氨酸和脯氨酸代謝，嘧啶代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，谷胱甘肽代謝）代謝通路可能是ACS 氣虛血瘀患者代謝物差異相關(guān)性最高的關(guān)鍵通路。MARTIN 等［23］發(fā)現(xiàn)，精氨酸－脯氨酸代謝可以被確定為監(jiān)測動脈粥樣硬化、ACS 和恢復(fù)的新靶點(diǎn)，不管是基于動物模型還是人類的代謝研究中，在ACS 中共同的代謝途徑是精氨酸和脯氨酸代謝以及谷胱甘肽代謝。DURANTE［24］發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化和動脈損傷中，精氨酸酶活性增加，鳥氨酸合成多胺，組織中多胺水平升高，激活的多胺抑制血小板聚集，與ACS 事件密切相關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)，在冠心病患者中心肌嘌呤和嘧啶核苷酸含量存在一定的紊亂，推測這些紊亂在肌肉功能障礙的發(fā)病機(jī)制中起一定作用［25］，但由于證據(jù)比較久遠(yuǎn)，還需進(jìn)一步試驗論證。甘氨酸和絲氨酸以及蘇氨酸代謝常被用于抗生素及耐藥性等相關(guān)試驗，未見與冠心病相關(guān)報道，可能與ACS 發(fā)生后炎癥因子的清除有關(guān)。此外，ACS 氣虛血瘀患者代謝物差異相關(guān)性較高的通路為牛磺酸和亞?；撬岽x，咖啡因代謝，氨酰tRNA 合成酶，氮代謝，二羧酸代謝，磷酸戊糖途徑，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，D－谷氨酰胺和D－谷氨酸代謝，組氨酸代謝，苯丙氨酸代謝和亞油酸代謝，其中?；撬岷蛠喤；撬岽x、氨酰tRNA 合成酶、氮代謝、組氨酸代謝、苯丙氨酸代謝是體內(nèi)的氨基酸代謝的重要途徑；二羧酸代謝、亞油酸代謝與體內(nèi)脂肪代謝有關(guān)；PPP 是體內(nèi)重要的糖代謝途徑，除了提供能量，PPP 向細(xì)胞提供核糖－5－磷酸（R5P）和NADPH，后者在消除細(xì)胞內(nèi)的活性氧、還原生物合成中起關(guān)鍵作用［26］。

本研究證明ACS 氣虛血瘀患者血清代謝譜發(fā)生了特異性變化，除了氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，能量代謝、脂肪代謝、氨基酸代謝均發(fā)生了紊亂，可以為ACS 氣虛血瘀證型提供一定的證據(jù)，但樣本量少，未進(jìn)行ACS患者的進(jìn)一步分型，仍需進(jìn)一步實驗論證。