有氧運(yùn)動抑制炎癥反應(yīng)改善ApoE-/-動脈粥樣硬化小鼠心肌纖維化機(jī)制研究

秦芳，馬甜甜，于子夫，劉西花

1.250355 山東省濟(jì)南市，山東中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院

2.250014 山東省濟(jì)南市，山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)科

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是腦梗死、冠心病等多種心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機(jī)制與脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)之間復(fù)雜的相互作用有關(guān)［1］。研究表明，AS發(fā)展過程中存在心肌纖維化等心肌改變，進(jìn)而使心肌適應(yīng)能力下降，導(dǎo)致心室收縮和舒張功能異常，最終引發(fā)心力衰竭等嚴(yán)重心血管?。?］。因此抑制AS、限制心肌纖維化的進(jìn)程對預(yù)防患者發(fā)生心力衰竭等心血管事件具有重要意義。心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，受到多種因素的調(diào)節(jié)和控制，其中炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是重要的發(fā)病機(jī)制［3］。長期AS導(dǎo)致缺血和缺氧的環(huán)境使炎癥因子釋放增多，激活轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）信號通路，加速了促纖維化作用的TGF-β1的釋放。同時(shí)，AS發(fā)生發(fā)展過程中，miR-132誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成會影響心肌細(xì)胞的收縮機(jī)制，同時(shí)還介導(dǎo)巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的相互作用，導(dǎo)致組織氧化應(yīng)激損傷，此為心肌纖維化的關(guān)鍵因素［4-6］。

有規(guī)律的運(yùn)動已被證明可以預(yù)防心血管疾病，改善心臟功能，緩解心肌纖維化，并加強(qiáng)防止心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制［7-8］。既往研究表明，長期低強(qiáng)度的體育鍛煉可以改善心力衰竭大鼠的心肌纖維化［9］。但是有氧運(yùn)動改善AS心肌纖維化具體分子學(xué)機(jī)制的研究尚不全面，其改善機(jī)制是否與減輕炎癥反應(yīng)及發(fā)揮抗氧化作用有關(guān)目前研究較少。為此，本研究基于動物模型，探討有氧運(yùn)動改善AS心肌纖維化的作用以及對炎性因子的影響，旨在為有氧運(yùn)動改善AS小鼠心肌纖維化的作用機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究時(shí)間

2022年2—8月。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取27只8周齡的雄性ApoE-/-小鼠（20～24 g）作為實(shí)驗(yàn)對象，購自中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心（中國上海），許可證號［SCXK（京）2019-0008］。所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，溫度為（22±1）℃，濕度為45%～55%，光照/黑暗周期為12 h，自由飲水和飲食。本研究通過了山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（AWE-2022-004）。

1.2.2 主要試劑與儀器 NOD受體3（NLRP3）抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號：WL02635）；TGF-β1抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號：WL02193）；白介素（IL）-1β抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號：WL00891）；β-actin（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號：WL01372）；超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號：WLA110）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）試劑盒（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號：WLA107）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號：WLA004）；蘇木素（北京索萊寶科技有限公司，貨號：H8070）；超速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號：H-2050R）；顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號：BX53）；石蠟切片機(jī)（德國Leica儀器有限公司，型號：RM2235）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組：將小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和有氧運(yùn)動組，每組9只。

1.3.2 AS小鼠模型制備：模型組和有氧運(yùn)動組小鼠飼以12周“西方類型”膳食飼料（21%脂肪，0.15%膽固醇）建立AS模型，對照組以普通飼料喂養(yǎng)12周。

1.3.3 運(yùn)動訓(xùn)練方案：模型組和對照組小鼠不進(jìn)行運(yùn)動訓(xùn)練，有氧運(yùn)動組小鼠在小動物跑臺上進(jìn)行遞增運(yùn)動強(qiáng)度及時(shí)間的耐力性運(yùn)動，參考基因缺陷小鼠的運(yùn)動量標(biāo)準(zhǔn)［10］。跑臺坡度設(shè)置為0，前4周的運(yùn)動量由10 m/min、30 min/d逐漸增加至13 m/min、60 min/d，剩余8周的運(yùn)動量為13 m/min，60 min/d。運(yùn)動5次/周，與建模同時(shí)進(jìn)行，連續(xù)運(yùn)動12周。

1.3.4 Masson染色：將心肌組織進(jìn)行Masson染色，包埋、切片脫蠟至水，滴加蘇木素染液、麗春紅酸性品紅液，使染液完全覆蓋組織染漿。以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，再向每張切片組織上滴加1%磷鉬酸水溶液分化。用苯胺藍(lán)復(fù)染后脫水、透明、封片，于顯微鏡下觀察染色效果，400×鏡下拍照。

1.3.5 蘇木素-伊紅（HE）染色：石蠟切片脫蠟后用蘇木素染色3～5 min，自來水洗凈后進(jìn)行分化處理，再次自來水洗后進(jìn)行返藍(lán)處理，之后再次流水沖洗，切片脫水后入伊紅染液染色5 min。在顯微鏡下觀察染色效果。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測心肌組織NLRP3、IL-1β、TGF-β1：取小鼠新鮮心肌組織，以低溫冷凍離心法提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，以RIPA裂解液調(diào)整蛋白樣本終濃度為2mg/mL。配制5%濃縮膠和14%分離膠，每孔上樣40 μg蛋白（20 μL），電泳2.5 h，轉(zhuǎn)膜1.5 h，用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h后，抗NLRP3（1∶500稀釋）、抗IL-1β（1∶1 000稀釋）、抗TGF-β1（1∶400稀釋），室溫孵育45 min，以肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，分析各電泳帶灰度值。將膠片進(jìn)行掃描，用Gel-Pro-Analyzer處理軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.3.7 試劑盒檢測SOD和GSH-Px表達(dá)量：準(zhǔn)確稱取心肌組織重量，按重量（g）∶體積（mL）=1∶9加入0.9%氯化鈉溶液，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，2 500 r/min離心10 min，半徑15 cm，取上清液按照試劑盒說明步驟測定SOD和GSH-Px表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Masson染色

心肌內(nèi)膠原纖維被苯胺藍(lán)染成藍(lán)色，肌纖維被酸性品紅和麗春紅染成紅色。對照組心肌組織紅潤，藍(lán)染面積??；模型組心肌組織纖維化較對照組明顯加重；有氧運(yùn)動組心肌組織纖維化較模型組明顯改善，見圖1。

圖1 心肌組織Masson染色結(jié)果（400×）Figure 1 Results of Masson staining of myocardial tissue

2.2 HE染色

HE染色結(jié)果顯示，對照組小鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)、大小、間隙正常，細(xì)胞核分布均勻；模型組小鼠心肌細(xì)胞排列較錯(cuò)亂，細(xì)胞形態(tài)、大小異常，細(xì)胞間隙增大，存在炎性細(xì)胞浸潤；有氧運(yùn)動組小鼠心肌細(xì)胞排列尚整齊，細(xì)胞形態(tài)、大小異常，細(xì)胞間隙基本正常，見圖2。

圖2 HE染色心肌組織形態(tài)變化（400×）Figure 2 HE staining results of morphological changes in heart tissues

2.3 3組小鼠心肌組織Western blotting檢測結(jié)果

3組小鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），組間比較結(jié)果顯示，模型組NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白表達(dá)高于對照組，有氧運(yùn)動組NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白表達(dá)低于模型組、高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖3。

表1 3組小鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白表達(dá)情況（±s）Table 1 Expression of NLRP3，IL-1β，TGF-β1 protein in myocardial tissue of 3 groups of mice

表1 3組小鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白表達(dá)情況（±s）Table 1 Expression of NLRP3，IL-1β，TGF-β1 protein in myocardial tissue of 3 groups of mice

注：NLRP3=NOD受體3，IL-1β=白介素1β，TGF-β1=轉(zhuǎn)化生長因子β1；a表示與對照組比較P＜0.05，b表示與有氧運(yùn)動組比較P＜0.05。

組別只數(shù)NLRP3IL-1βTGF-β1對照組91.123±0.1101.136±0.1191.162±0.184模型組95.741±0.220ab6.447±0.524ab7.906±0.658ab有氧運(yùn)動組92.851±0.279a3.724±0.140a2.624±0.244a F值353.02201.52215.98 P值＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 3組小鼠心肌組織SOD和GSH-Px表達(dá)量

3組小鼠心肌組織中SOD、GSH-Px表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），組間比較結(jié)果顯示，模型組SOD、GSH-Px表達(dá)量低于對照組，有氧運(yùn)動組SOD、GSH-Px表達(dá)量高于模型組、低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 3組小鼠心肌組織SOD、GSH-Px表達(dá)量比較（±s，U/mg）Table 2 Comparison of SOD and GSH-Px expression in myocardial tissue of mice in 3 groups

表2 3組小鼠心肌組織SOD、GSH-Px表達(dá)量比較（±s，U/mg）Table 2 Comparison of SOD and GSH-Px expression in myocardial tissue of mice in 3 groups

注：SOD=超氧化物歧化酶，GSH-Px=谷胱甘肽過氧化物酶；a表示與對照組比較P＜0.05，b表示與有氧運(yùn)動組比較P＜0.05。

組別只數(shù)SODGSH-Px對照組932.325±0.75425.464±1.067模型組912.879±0.133ab8.672±1.056ab有氧運(yùn)動組921.615±0.432a15.990±0.608a F值314.13729.53 P值＜0.001＜0.001

3 討論

AS及其相關(guān)的心肌纖維化是心血管疾病防治的主要方向［11］，臨床上治療主要以抗炎、降脂等藥物治療為主，但治療效果有限。運(yùn)動有助于降低心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，運(yùn)動訓(xùn)練明顯改善了心肌梗死引起的心臟功能障礙和纖維化［12］。此外，也有研究證明運(yùn)動訓(xùn)練減輕了因年老導(dǎo)致的心肌纖維化，并促進(jìn)了血管內(nèi)皮生長因子的釋放［7］。上述研究表明，有氧運(yùn)動可能在改善AS引起的心肌纖維化方面也發(fā)揮重要作用。

運(yùn)動訓(xùn)練可以預(yù)防或減輕心肌纖維化，其機(jī)制與運(yùn)動訓(xùn)練抑制心肌細(xì)胞炎癥和細(xì)胞凋亡，清除胞質(zhì)內(nèi)受損蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物等有關(guān)［13-14］。本研究顯示，模型組小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)、大小、間隙均有所增寬，存在炎性細(xì)胞的浸潤，這表明AS激活了炎癥反應(yīng)。免疫炎癥反應(yīng)在加重心肌損傷和纖維化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［15］。NLRP3炎癥小體作為AS中調(diào)節(jié)炎癥的關(guān)鍵因子，其激活可以加劇心肌纖維化的進(jìn)程［16-17］。也有研究證明，抑制NLRP3炎癥小體激活可以通過調(diào)節(jié)IL-1β分泌來減少巨噬細(xì)胞的募集，同時(shí)對成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化也有抑制作用，以此改善心肌纖維化［18］。IL-1β是另一個(gè)致AS的關(guān)鍵因子，主要來源于血管內(nèi)皮細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞，可以誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子IL-6和IL-8的表達(dá)以及其他參與纖維化的蛋白表達(dá)增加［19］。此外，IL-1β還可通過加速心肌細(xì)胞凋亡來促進(jìn)心肌纖維化［20］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AS模型組小鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)均顯著升高，經(jīng)12周的有氧運(yùn)動后，小鼠NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)顯著減少，炎性損傷和心肌纖維化均減輕。蒲詠秋［21］的研究也表明，跑臺運(yùn)動顯著降低了心力衰竭小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-1β和IL-6的水平，改善心肌功能并減弱心肌損傷。

作為調(diào)節(jié)纖維化過程的關(guān)鍵生長因子，TGF-β1活性在心肌損傷后顯著增加，并參與調(diào)節(jié)所有促進(jìn)心肌纖維化細(xì)胞的表型和功能［22］。許多研究已經(jīng)表明血管緊張素、醛固酮等多種因素導(dǎo)致的心肌纖維化與TGF-β信號傳導(dǎo)通路的激活有關(guān)［23-24］。本研究與劉亞等［25］的研究結(jié)果大致吻合，均顯示運(yùn)動可以減少TGF-β1的水平，從而改善心肌纖維化。其原因可能是：TGF-β1是AS心肌纖維化的主要開關(guān)之一，AS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和慢性炎癥環(huán)境使TGF-β1表達(dá)增加，以發(fā)揮抑制過度炎癥反應(yīng)的作用。慢性炎癥反應(yīng)使TGF-β1受體表達(dá)發(fā)生改變的同時(shí)激活了TGF-β1信號通路，刺激成纖維細(xì)胞的增殖和分化，活化的TGF-β1還會誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，加重心肌纖維化［26-27］。有氧運(yùn)動具有抗炎、抗氧化的作用，可以減輕AS小鼠炎癥反應(yīng)，減少TGF-β1的過度釋放，從而減緩AS心肌纖維化。

ROS的過度釋放會觸發(fā)多種信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及轉(zhuǎn)化生長因子的過量產(chǎn)生，促進(jìn)心肌纖維化［28-29］。SOD和GSH-Px是心肌組織內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠間接反映心肌氧化應(yīng)激水平和自由基的代謝水平，保護(hù)組織免受氧化應(yīng)激的損傷［30］。研究表明，抗氧化酶活性的增加在抑制糖尿病大鼠心肌纖維化方面發(fā)揮潛在作用［26］。有研究報(bào)道，抑制自發(fā)性高血壓心肌組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，可以抑制高血壓導(dǎo)致的心肌纖維化［31］。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組的抗氧化指標(biāo)SOD和GSH-Px較對照組低，有氧運(yùn)動后小鼠心肌組織中抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性較模型組有所升高。其機(jī)制可能是有氧運(yùn)動激活小鼠的酶促抗氧化系統(tǒng)，調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激，增強(qiáng)AS小鼠抗氧化能力，抑制了ROS產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子以及轉(zhuǎn)化生長因子的某些通路，從而改變心肌纖維化的進(jìn)程。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，有氧運(yùn)動減輕AS小鼠心肌纖維化可能與抑制小鼠心肌組織炎癥反應(yīng)、激活抗氧化應(yīng)激水平，發(fā)揮心臟保護(hù)作用有關(guān)。然而需要指出的是，本研究僅是對該方面做了初步探討，有氧運(yùn)動改善AS小鼠心肌纖維化的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

作者貢獻(xiàn)：秦芳負(fù)責(zé)文章構(gòu)思；馬甜甜、于子夫負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、繪制圖表；劉西花對整體研究方案、設(shè)計(jì)、研究實(shí)施過程等進(jìn)行指導(dǎo)，對論文整體負(fù)責(zé)。

本文無利益沖突。