復(fù)合菌群強(qiáng)化修復(fù)石油-氯酚污染土壤

李 婧，于鈞瀧，趙曉東，左 帥，劉其友，張秀霞，2

(1.中國石油大學(xué)(華東) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266580；2.石油石化污染物控制與處理國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

作業(yè)年限較長的油田井場或石化污染場地不僅石油烴污染嚴(yán)重，有機(jī)氯化合物也大量存在[1]，原油中天然存在的有機(jī)氯化物含量一般較少[2]，但在采油、煉油過程中因含氯化學(xué)助劑的使用，使得原油有機(jī)氯含量變高[3]。裴芳等[4]對某煉油廠退役場地監(jiān)測結(jié)果表明，該場地石油和氯苯酚類物質(zhì)污染嚴(yán)重，主要分布在儲油罐所在地；葛鋒等[5]調(diào)查分析了東北4個(gè)石化工業(yè)基地，主要污染物有總石油烴(TPHs)、多環(huán)芳烴(PAHs)、氯代烴等。由于石油烴和有機(jī)氯化合物的復(fù)雜性、持久性和致癌、致畸、致突變的“三致”效應(yīng)，若不及時(shí)加以處理，環(huán)境問題便隨之而來，甚至?xí)斐商褐禄?、人類致癌、生物中毒等危害[6]。因此，需要采取合適的方法解決石油烴和有機(jī)氯化合物復(fù)合污染問題。

石油烴和有機(jī)氯化合物復(fù)合污染的去除方法有物理法、化學(xué)法和生物法[7-8]。物理修復(fù)法和化學(xué)修復(fù)法可在短時(shí)間內(nèi)有效去除污染物，但往往需要較高的能源消耗和設(shè)備成本。生物法因成本低及環(huán)境友好的特點(diǎn)，被譽(yù)為最具有發(fā)展前景的修復(fù)技術(shù)之一。由于石油烴和有機(jī)氯化合物復(fù)合污染對功能微生物具有較強(qiáng)的毒性或抑制性，單一降解菌的降解能力往往比微生物聯(lián)合體要弱，污染物的降解需要多種酶和微生物的參與來完成，且不同微生物對石油烴和有機(jī)氯化合物各組分耐受性存在一定差異[9-10]。因此，構(gòu)建復(fù)合菌群不僅可在復(fù)雜環(huán)境中提高微生物的降解能力，也可使微生物通過“分工協(xié)作”增強(qiáng)降解底物的廣譜性[11]。已有研究者開展了相關(guān)復(fù)合菌群的效果研究，Steliga等[12]構(gòu)建了復(fù)合物菌群M1，通過生物強(qiáng)化作用可在6個(gè)月時(shí)間內(nèi)對多氯聯(lián)苯實(shí)現(xiàn)降解率84.5%，石油烴的降解率可達(dá)到70.8%；黃霞[13]分離的微生物菌群可有效降解石油烴和氯代烴等有機(jī)混合污染物；Zhao等[14]研究表明，復(fù)合菌群中微生物的協(xié)同作用可以增強(qiáng)菌群的穩(wěn)定性和耐受性?；谏鲜鲅芯浚瑯?gòu)建微生物復(fù)合菌群修復(fù)石油-氯酚污染場地這一科學(xué)問題取得一定進(jìn)展，尚需進(jìn)一步探究。

筆者選取氯酚類化合物2，4-二氯苯酚與石油構(gòu)建復(fù)合污染體系，以實(shí)驗(yàn)室篩選的石油烴降解菌和有機(jī)氯降解菌作為實(shí)驗(yàn)菌株構(gòu)建復(fù)合菌群，強(qiáng)化修復(fù)石油-氯酚模擬污染土壤，考察修復(fù)過程中不同菌群對土壤石油及2，4-二氯苯酚降解率、微生物總數(shù)、脫氫酶活性和土壤群落結(jié)構(gòu)的影響，為石油-氯酚復(fù)合污染場地的修復(fù)提供理論支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

菌株：實(shí)驗(yàn)所用石油烴降解菌S4(糞產(chǎn)堿菌，AlcaligenesfaecailsY5)和S5(芽孢桿菌，Bacillussp.7614)是以某油田污染土壤為菌源、勝利原油為唯一碳源篩選馴化所得土著菌，菌株S4和S5在原油質(zhì)量濃度為2 g/L的無機(jī)鹽原油培養(yǎng)基中，對石油烴的7 d降解率分別為26.46%和37.54%；有機(jī)氯降解菌L3(馬氏芽孢桿菌，Bacillusmarisflavistrain BCB4-1)和L4(水芽孢桿菌，BacillusaquimarisT 172)是以某污水處理廠二沉池活性污泥為菌源、2，4-二氯苯酚為唯一碳源篩選馴化所得，菌株L3、L4在2，4-二氯苯酚質(zhì)量濃度為50 m g/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，對2，4-二氯苯酚7 d的降解率分別達(dá)到68.63%、71.84%。菌株S4和S5按體積比3∶2構(gòu)建石油烴降解菌群，菌株L3和L4按體積比為3∶2構(gòu)建有機(jī)氯降解菌群，S4、S5、L3和L4按體積比1∶2∶2∶1構(gòu)建復(fù)合菌群。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(1 L)成分為牛肉浸膏5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、氯化鈉5.0 g，固體培養(yǎng)基添加15.0 g瓊脂粉；孟加拉紅培養(yǎng)基(36.6 g/L)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；pH值調(diào)至7.0～7.3，在1×105Pa、121 ℃條件下滅菌20 min。

胰蛋白胨、牛肉浸膏、瓊脂粉、氯化鈉、石油醚(60～90 ℃)、石油醚(30～60 ℃)、正己烷、磷酸二氫鉀、硝酸鈉，均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、2，4-二氯苯酚(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)，均為色譜純，購自上海麥克林生化科技有限公司。原油來自勝利油田某采油廠，密度(20 ℃)為891 kg/cm3，運(yùn)動(dòng)黏度(50 ℃)為31.05 mm2/s。供試土壤，取自校園內(nèi)綠植土壤，取樣后去除動(dòng)植物殘?bào)w并在自然環(huán)境下風(fēng)干，經(jīng)破碎研磨，過2 mm篩后備用，主要性質(zhì)見表1。

1.2 模擬污染土壤的制備

根據(jù)油田污染井場實(shí)際情況，設(shè)置模擬污染土壤中石油烴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 g/kg，2，4-二氯苯酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為500 g/kg。將原油和石油醚(30～60 ℃)按照體積比1∶4進(jìn)行混合，然后按石油烴質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 g/kg均勻摻入供試土壤中，自然風(fēng)干7 d至石油醚揮發(fā)完全；然后用磷酸二氫鉀和硝酸鈉調(diào)節(jié)土壤中元素C、N、P的質(zhì)量比為100∶10∶1[15]得到含油土壤樣品。配制質(zhì)量濃度為4 g/L的2，4-二氯苯酚儲備液，按2，4-二氯苯酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5 g/kg均勻摻入含油土壤樣品中，置于通風(fēng)櫥中老化平衡2 d后得到石油-2，4-二氯苯酚復(fù)合污染土壤樣品，即為模擬污染土壤樣品。

1.3 模擬污染土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)

將500 g模擬污染土壤樣品平均分成4份置于花盆中，4個(gè)花盆對應(yīng)土壤的4種修復(fù)方式：①自然修復(fù)(A)；②石油烴降解菌S4、S5修復(fù)(B)；③有機(jī)氯降解菌L3和L4修復(fù)(C)；④石油與有機(jī)氯降解菌S4、S5、L3、L4修復(fù)(D)。每種處理方式下菌液均按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的接種量接種于花盆土壤。在溫度35 ℃、修復(fù)時(shí)間130 d的條件下進(jìn)行模擬污染土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)，修復(fù)過程中調(diào)節(jié)土壤含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%～20%，每7 d翻土一次并進(jìn)行采樣分析。在石油-氯酚模擬污染土壤修復(fù)過程中的第7、14、28、42、56、70、98、130 d取樣，分別測定修復(fù)土壤樣品中的石油烴含量、2，4-二氯苯酚含量、微生物總數(shù)以及土壤脫氫酶活性，并對以上4種修復(fù)方式在不同時(shí)間內(nèi)對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行了檢測。

模擬污染土壤的石油烴降解率(η1，%)按式(1)進(jìn)行計(jì)算。

(1)

式(1)中：ws，0為模擬污染土壤中石油烴質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；ws，t為模擬污染土壤經(jīng)過不同時(shí)間t修復(fù)后土壤中石油烴的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg。

模擬污染土壤的2，4-二氯苯酚降解率(η2，%)按式(2)進(jìn)行計(jì)算。

(2)

式(2)中：wd，0為模擬污染土壤中2，4-二氯苯酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；wd，t為模擬污染土壤經(jīng)過不同時(shí)間t修復(fù)后土壤中2，4-二氯苯酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg。

1.4 高通量實(shí)驗(yàn)

取模擬污染土壤經(jīng)過4種修復(fù)方式(A、B、C、D)處理修復(fù)7 d(修復(fù)平衡的第一周)后的土壤樣品作為初始樣品，分別記作A1、B1、C1、D1，修復(fù)130 d后的土壤樣品記作A2、B2、C2、D2，委托上海美吉生物醫(yī)藥有限公司對土壤樣品進(jìn)行高通量測序，對土壤修復(fù)過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化分析進(jìn)行補(bǔ)充[16]。高通量測序方法流程：利用土壤DNA提取試劑盒提取土壤樣品的總DNA，然后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性與純度，放入-20 ℃冰箱備用，利用V3-V4區(qū)的通用引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化，接著對PCR產(chǎn)物定量與均一化，然后構(gòu)建PE文庫，最終進(jìn)行Illumina測序。

1.5 土壤樣品分析方法

采用上海元析儀器公司生產(chǎn)的UV-6000P型紫外可見分光光度計(jì)，利用超聲萃取-紫外分光光度法測定土壤樣品中石油含量[17]。采用《土壤和沉積物石油烴(C10～C40)的測定——?dú)庀嗌V法》(HJ 1021—2019)對土壤石油烴(C10～C40)組分進(jìn)行定性分析，選用索式提取法進(jìn)行提取，經(jīng)濃縮、凈化后測試，使用安捷倫科技有限公司生產(chǎn)的7890B-5977C型氣相色譜儀進(jìn)行檢測，氣相色譜測試條件：載氣為高純氦氣，流量1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度320 ℃，進(jìn)樣量1.0 μL，進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比10∶1，HP-5MS色譜柱，程序升溫，初始溫度60 ℃，保留2 min，以15 ℃/min升至320 ℃，保留2 min。采用高效液相色譜法測定2，4-二氯苯酚濃度，土壤中2，4-二氯苯酚用甲醇提取[18]，使用日本島津公司生產(chǎn)的LC-20A型高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，測定條件為：檢測波長284 nm，V(甲醇)∶V(純水)=50∶50，進(jìn)樣量10 μL，色譜柱為Shim-pack GIST-HP C18，流速0.5 mL/min。采用稀釋涂布平板法測定土壤可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌的數(shù)量[19-20]。采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)還原法測定土壤脫氫酶活性[21]。

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤修復(fù)過程中石油烴降解率變化

采用4種修復(fù)方式(A、B、C、D)對模擬污染土壤進(jìn)行修復(fù)實(shí)驗(yàn)，不同修復(fù)時(shí)間下模擬污染土壤中石油烴降解率的變化結(jié)果見圖1。

A—Natural remediation；B—Petroleum hydrocarbon degrading bacteria；C—2，4-Dichlorophenol degrading bacteria；D—Petroleum hydrocarbon and 2，4-dichlorophenol degrading bacteria

由圖1可以看出，D組模擬污染土壤第130 d時(shí)的石油烴降解率達(dá)到77.68%，此時(shí)土壤樣品中石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2353.82 mg/kg，符合第二類建設(shè)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)篩選值(4500 mg/kg)的標(biāo)準(zhǔn)，比相同條件下B、C組土壤中石油烴降解率分別提高18.14和19.78百分點(diǎn)，這可能是石油烴降解菌群和有機(jī)氯降解菌群之間具有協(xié)同作用促進(jìn)了菌群對石油烴的降解。加入的有機(jī)氯降解菌可以降解2，4-二氯苯酚，證明菌株體內(nèi)含有相關(guān)的雙加氧酶、脫鹵酶及脫氫酶基因[22]。有機(jī)氯降解菌也可降解部分石油烴中含有的芳香烴，因此復(fù)合菌群擴(kuò)大了不同微生物降解石油烴的范圍，多種菌混合后可實(shí)現(xiàn)降解能力的互補(bǔ)[23-24]。

2.2 土壤修復(fù)過程中石油烴組分變化

為進(jìn)一步考察石油-有機(jī)氯復(fù)合菌群對土壤石油烴(C10～C40)組分強(qiáng)化降解作用，對4種修復(fù)方式(A、B、C、D)處理模擬污染土壤130 d后的土壤中提取出的石油烴進(jìn)行氣相色譜法分析，以石油烴類峰強(qiáng)的高低代表石油烴的降解程度，結(jié)果見圖2。

A—Natural remediation；B—Petroleum hydrocarbon degrading bacteria；C—2，4-Dichlorophenol degrading bacteria；D—Petroleum hydrocarbon and 2，4-dichlorophenol degrading bacteria

由圖2可知，B、D組模擬污染土壤在第130 d時(shí)，石油烴中C27-所有烴類峰的強(qiáng)度均顯著降低，且D組土壤樣品的效果更明顯，與Schink[25]得出的石油烴中C4～C20中更易被微生物降解的結(jié)論一致，復(fù)合菌群的添加更好地利用并降解短鏈烴。而C27+烴類由于其碳鏈長、相對分子質(zhì)量大等原因，使得土壤微生物對這部分烴類利用度較低[26-27]。而C組土壤中碳數(shù)烴類的峰降低幅度都比較小，表明該菌群對石油烴的降解率低，這可能是單一的有機(jī)氯降解菌具有降解底物的專一性，對石油烴不敏感所致。

2.3 修復(fù)過程中2，4-二氯苯酚降解率變化

采用4種修復(fù)方式(A、B、C、D)對模擬污染土壤進(jìn)行修復(fù)實(shí)驗(yàn)，不同修復(fù)時(shí)間下模擬污染土壤中2，4-二氯苯酚降解率的結(jié)果見圖3。

A—Natural remediation；B—Petroleum hydrocarbon degrading bacteria；C—2，4-Dichlorophenol degrading bacteria；D—Petroleum hydrocarbon and 2，4-dichlorophenol degrading bacteria

由圖3可知：修復(fù)時(shí)間在130 d時(shí)，A組模擬污染土壤中2，4-二氯苯酚降解率為46.74%，可見土壤中2，4-二氯苯酚揮發(fā)性較強(qiáng)。D組土壤中2，4-二氯苯酚降解率持續(xù)上升，在第70 d時(shí)達(dá)到100%；C組土壤中2，4-二氯苯酚的降解速率略低于D組，其降解率在第100 d時(shí)達(dá)到100%。修復(fù)過程中前60 d，C和D組土壤的降解率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而60 d后D組降解率繼續(xù)升高，這是由于復(fù)合菌群對土壤環(huán)境適應(yīng)性更強(qiáng)，更利于維持2，4-二氯苯酚的穩(wěn)定降解[28-30]。第130 d時(shí)，B組土壤中降解率為69.74%，測得此時(shí)2，4-二氯苯酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為150.54 mg/kg，符合第一類建設(shè)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管制值(234 mg/kg)的標(biāo)準(zhǔn)。綜上，向石油-氯酚復(fù)合污染土壤中添加復(fù)合菌群，在促進(jìn)2，4-二氯苯酚降解的同時(shí)保證了菌群降解能力的穩(wěn)定性。

2.4 土壤修復(fù)過程中微生物總數(shù)變化

微生物數(shù)量反映土壤微生物群落大小，是土壤生物活性的重要組成部分，微生物的增殖、選擇和競爭過程實(shí)際上就是土壤中石油烴和2，4-二氯苯酚的降解過程。在模擬污染土壤修復(fù)過程中分別對A、B、C、D組土壤樣品在第7、14、28、42、56、70、98、130 d取樣，測定這4組土壤樣品中的細(xì)菌總數(shù)和真菌總數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

A—Natural remediation；B—Petroleum hydrocarbon degrading bacteria；C—2，4-Dichlorophenol degrading bacteria；D—Petroleum hydrocarbon and 2，4-dichlorophenol degrading bacteria

由圖4(a)可知：在前28 d中，A組模擬污染土壤中細(xì)菌總數(shù)小幅增加，這是由于土壤中土著菌也會以石油烴和2，4-二氯苯酚作為碳源，促進(jìn)了土著菌群的繁殖；D組土壤中細(xì)菌總數(shù)增長最快，其細(xì)菌總數(shù)在第28 d時(shí)達(dá)到最大值(9.2×107CFU/g soil)，表明復(fù)合菌群在石油-氯酚復(fù)合污染土壤中對環(huán)境的適應(yīng)能力最強(qiáng)[31]。而B、C組土壤中細(xì)菌總數(shù)較少，這是由于單一種類微生物對污染物更加敏感。4組土壤中的微生物數(shù)量達(dá)到最大值后便有下降趨勢，與陳凱麗等[32]的研究結(jié)果類似，同時(shí)結(jié)合圖2中第130 d時(shí)碳數(shù)在27以上的烴類殘留量較高，表明復(fù)合菌群難以利用相對分子質(zhì)量較大的污染物作為碳源，導(dǎo)致其生長受到抑制。因此修復(fù)130 d后，B、C、D組土壤中的細(xì)菌總數(shù)基本恢復(fù)到修復(fù)前水平。圖4(b)顯示了4組土壤中真菌總數(shù)的變化，其變化趨勢與細(xì)菌總數(shù)類似。D組土壤中真菌數(shù)量最多，其最大值為6.5×105CFU/g soil，B、C組土壤中真菌數(shù)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明向石油烴-氯酚復(fù)合污染土壤中加入復(fù)合菌群可以促進(jìn)真菌的生長。有研究表明，部分真菌含有利于芳環(huán)類化合物開環(huán)的酶[33]，由此可推測真菌在修復(fù)污染土壤的過程中也發(fā)揮了作用。

2.5 土壤修復(fù)過程中土壤脫氫酶活性變化

脫氫酶可促進(jìn)石油的脫氫，菌株可以通過脫氫酶作用于石油中的氫原子，使之激活并將其轉(zhuǎn)移至受氫體[34]，2，4-二氯苯酚的降解也離不開脫氫酶的催化作用。不同修復(fù)方式處理模擬污染土壤修復(fù)過程中土壤脫氫酶活性隨時(shí)間的變化結(jié)果見圖5。

A—Natural remediation；B—Petroleum hydrocarbon degrading bacteria；C—2，4-Dichlorophenol degrading bacteria；D—Petroleum hydrocarbon and 2，4-dichlorophenol degrading bacteria

由圖5可知，隨著修復(fù)時(shí)間的延長，4組土壤中脫氫酶活性均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，與圖4的變化趨勢相一致。D組土壤中脫氫酶活性始終高于其余組，其最高值可達(dá)到0.79 mg TPF/(g soil·h-1)，這歸因于添加復(fù)合菌群土壤中較多的微生物數(shù)量，且菌群機(jī)體內(nèi)代謝活動(dòng)旺盛[35]。在修復(fù)后期，各組土壤脫氫酶活性降低，這是因?yàn)橥寥赖纳锢枚戎饾u降低，抑制了酶活性，從而減弱了微生物的代謝能力。

2.6 土壤微生物總數(shù)、脫氫酶活性與石油及2，4-二氯苯酚降解率的相關(guān)性

通過上述討論，證明了修復(fù)過程中土壤微生物總數(shù)及酶活性對石油及2，4-二氯苯酚降解率存在一定關(guān)系。采用SPSS 26.0軟件分析D組模擬污染土壤修復(fù)130 d后的土壤樣品中土壤細(xì)菌、真菌總數(shù)、脫氫酶活性與污染物降解率之間的相關(guān)性，結(jié)果見表2。

表2 土壤微生物總數(shù)、脫氫酶活性與石油烴降解率(η1)及2，4-二氯苯酚降解率(η2)的相關(guān)性

由表2可以看出，土壤細(xì)菌、真菌總數(shù)、脫氫酶活性與石油烴降解率及2，4-二氯苯酚的降解率均成正相關(guān)，相關(guān)性顯著，且土壤真菌總數(shù)與石油烴降解率及2，4-二氯苯酚降解率相關(guān)性系數(shù)最高，分別為0.606、0.636，表明真菌對石油烴和2，4-二氯苯酚2種污染物的去除方面作用明顯。結(jié)合圖4和圖5可知，添加復(fù)合菌群的土壤中微生物總數(shù)及脫氫酶活性均高于添加單一降解菌的土壤。可見，細(xì)菌、真菌總數(shù)與脫氫酶在石油烴和2，4-二氯苯酚降解過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

2.7 高通量測定群落結(jié)構(gòu)變化

2.7.1 Alpha多樣性分析

對模擬污染土壤經(jīng)過4種修復(fù)方式(A、B、C、D)處理7 d后采集的土壤樣品A1、B1、C1、D1和130 d后采集的土壤樣品A2、B2、C2、D2進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)分析，結(jié)果見表3。

表3 模擬污染土壤經(jīng)過4種修復(fù)方式處理7 d和130 d后的土壤樣品的微生物多樣性指數(shù)

由表3可知，模擬污染土壤進(jìn)行處理修復(fù)130 d后，樣品A2和B2的Simpson指數(shù)略有增大，這歸因于污染物的加入刺激了土壤中具有降解能力的優(yōu)勢微生物種群的生長[36]。然而其余多樣性指數(shù)較第7 d時(shí)均有不同程度的下降，這表明模擬土壤中微生物群落物種和多樣性均降低，添加的石油烴和2，4-二氯苯酚破壞了土壤環(huán)境，隨著修復(fù)時(shí)間的推移，土壤微生物群落的多樣性、豐富度以及均勻度均降低，從而影響土壤微生物種群的代謝活性[37]，使得復(fù)合菌群在修復(fù)污染土壤后期對污染物的代謝速率逐漸降低。

2.7.2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

對模擬污染土壤經(jīng)過4種修復(fù)方式(A、B、C、D)處理7 d后采集的土壤樣品A1、B1、C1、D1和130 d后采集的土壤樣品A2、B2、C2、D2進(jìn)行微生物的門水平和屬水平的相對豐度分析，結(jié)果見圖6和圖7。

A—Natural remediation；B—Petroleum hydrocarbon degrading bacteria；C—2，4-Dichlorophenol degrading bacteria；D—Petroleum hydrocarbon and 2，4-dichlorophenol degrading bacteria

由圖6可知，4組模擬污染土壤樣品中的主要菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteriota)和變形菌門(Proteobacteria)。當(dāng)修復(fù)過程進(jìn)行到第7 d時(shí)，B、C、D組土壤樣品中厚壁菌門均成為優(yōu)勢菌門，其相對豐度顯著增大，均達(dá)到60%以上，而A組土壤樣品中厚壁菌門的相對豐度基本不變。厚壁菌門豐度的增加主要是來源于添加的菌群中的芽孢桿菌屬，而該菌屬對降解石油及氯酚具有重要作用[38]。當(dāng)修復(fù)過程進(jìn)行到第130 d時(shí)，B、C、D組土壤樣品中厚壁菌門的相對豐度相較于第7 d有不同程度的增加，這說明修復(fù)過程中添加的芽孢桿菌屬受土壤污染物刺激生長。

由圖7可知，與A組相比，B、C、D組土壤中修復(fù)后芽孢桿菌屬(Bacillus)和蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)成為優(yōu)勢菌屬。D組土壤中修復(fù)后芽孢桿菌屬和蒼白桿菌屬的相對豐度略有增長，表明這兩類菌屬在污染土壤中生長代謝穩(wěn)定，芽孢桿菌屬來源于添加的有機(jī)氯降解菌L3、L4和石油烴降解菌S5，研究表明芽孢桿菌屬對石油及氯酚化合物有很好的降解能力[39]。產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)來自添加的石油烴降解菌S4。A組土壤優(yōu)勢菌屬由節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)和Norank_f_norank_o_norank_c_KD4-96菌屬轉(zhuǎn)變?yōu)橹Z卡氏菌屬(Nocardioides)、紅球菌屬(Rhodococcus)，這兩類菌在修復(fù)石油烴污染土壤及氯酚污染土壤中均有廣泛研究[40]。在B組土壤中，蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)的相對豐度變化不大，芽孢桿菌屬(Bacillus)豐度明顯增多，推測是添加的菌株S5具有較強(qiáng)的生存繁殖能力，相比較于D組土壤，B組土壤在第130 d后產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)豐度的降低更為明顯，這可能是由于加入的石油烴和2，4-二氯苯酚抑制其生長代謝，2，4-二氯苯酚的存在抑制了其對石油的降解效果，這也進(jìn)一步表明在D組土壤中，有機(jī)氯降解菌的存在可以提高石油烴降解菌S4的生存能力[37]。對于C組土壤，修復(fù)前后各微生物菌屬相對豐度變化不大，恢復(fù)到初始土壤微生態(tài)群落結(jié)構(gòu)，表明土壤微生物菌群在受污染土壤恢復(fù)及維持群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面發(fā)揮了重要作用。

3 結(jié) 論

(1)制備含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%～20%、石油烴質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 g/kg、2，4-DCP質(zhì)量分?jǐn)?shù)500 mg/kg的模擬污染土壤，采用不同的修復(fù)方式進(jìn)行土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：添加石油-有機(jī)氯復(fù)合降解菌群進(jìn)行模擬污染土壤修復(fù)的效果最佳，修復(fù)130 d后石油烴降解率為77.68%，2，4-二氯苯酚降解率為100%，比僅添加石油烴降解菌群或有機(jī)氯降解菌群的修復(fù)方式下的石油烴降解率分別提高18.14和19.78百分點(diǎn)。其中，被降解的石油烴主要為碳數(shù)小于27的中短鏈烴。

(2)添加石油-有機(jī)氯復(fù)合降解菌群進(jìn)行模擬土壤修復(fù)后的土壤樣品中脫氫酶活性最高，微生物總數(shù)最多，脫氫酶活性及細(xì)菌、真菌數(shù)量在修復(fù)28 d前呈升高趨勢，28 d后有所下降，且三者與石油烴降解率及2，4-二氯苯酚降解率之間呈正相關(guān)。

(3)在石油烴-有機(jī)氯的復(fù)合污染脅迫下，模擬污染土壤經(jīng)過不同修復(fù)方式處理后的土壤中微生物Alpha多樣性指數(shù)降低。高通量測序分析表明，添加菌群強(qiáng)化的土壤中在修復(fù)前后厚壁菌門(Firmicutes)均為優(yōu)勢菌門，放線菌門(Actinobacteria)所占比例下降；同時(shí)，添加石油-有機(jī)氯復(fù)合菌群的土壤中修復(fù)后芽孢桿菌屬(Bacillus)和蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)成為優(yōu)勢菌屬，所占比例上升。