腫瘤壞死因子-α對(duì)糖尿病大鼠鈉潴留的調(diào)控

張冬瑞,韋青清,劉 佳,薛 嵩,鄧佳豪,張 楊,隋洪玉

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

糖尿病是一種復(fù)雜的慢性代謝紊亂性疾病,由多因素導(dǎo)致胰島素分泌不足和/或利用障礙而引起,臨床特征主要表現(xiàn)為高血糖和多種并發(fā)癥。其中,糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1],而鈉潴留被認(rèn)為是DKD早期腎功能改變的重要指標(biāo),其發(fā)病機(jī)制涉及諸多因素,如糖基化終末產(chǎn)物沉積、血流動(dòng)力學(xué)改變、炎性細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激及某些特異基因表達(dá)異常等,其中炎性細(xì)胞因子發(fā)揮重要作用[2]。大量研究表明,促炎因子TNF-α與糖尿病的發(fā)病過(guò)程密切相關(guān),但它是否參與了DKD中鈉潴留的形成鮮有報(bào)道。本研究旨在探討TNF-α對(duì)糖尿病腎臟疾病大鼠鈉潴留的影響,以期為探索DKD的發(fā)病機(jī)制及早期防治提供新的研究思路和作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD (sprague-dawley)大鼠180～220g,購(gòu)于佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

Actin抗體購(gòu)于Affinity公司,TNF-α抗體及CLCNK抗體均購(gòu)于Abcam公司,鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)購(gòu)于Sigma公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

40只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機(jī)分成4組,分別為:正常對(duì)照組(NC,n=10)、糖尿病模型組(DM,n=10)、正常+TNF-α阻斷劑組(NC+TNFR:Fc,n=10、糖尿病+TNF-α阻斷劑組(DM+TNFR:Fc,n=10)。

NC組腹腔注射與DM組等量的檸檬酸緩沖液;DM組按60mg/kg劑量腹腔注射STZ制備糖尿病模型;NC+TNFR:Fc組腹腔注射與DM組等量的檸檬酸緩沖液,并在注射前一天按2mg/kg劑量皮下注射TNFR:Fc,依2次/周的方式連續(xù)注射至3周;DM+TNFR:Fc組按60mg/kg劑量腹腔注射STZ,并在注射前一天按2mg/kg劑量皮下注射TNFR:Fc,依2次/周的方式連續(xù)注射至3周。

1.3.2 蛋白免疫印跡技術(shù)

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離,首先取50μg蛋白樣品上樣后進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后選用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)印,然后將轉(zhuǎn)印膜置于5%脫脂奶粉溶液中室溫下封閉1h,隨后加入相應(yīng)特異抗體進(jìn)行一抗孵育并4℃過(guò)夜,洗膜后室溫下二抗孵育1h,洗膜后使用ECL發(fā)光液顯影并進(jìn)行凝膠成像分析。

1.3.3 單通道膜片鉗技術(shù)

使用Multiclamp700B放大器記錄TAL管周膜氯通道電流,通道活動(dòng)度用NPo表示,是通道開(kāi)放概率(Po)與通道開(kāi)放數(shù)(N)的乘積,NPo=∑(1t1+2t2+……+iti),ti為通道開(kāi)放時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 空腹血糖

在實(shí)驗(yàn)第72 h和3周時(shí)檢測(cè)大鼠空腹血糖。結(jié)果顯示:與NC組相比,DM組空腹血糖明顯升高(表1,n=8,P<0.01)。結(jié)果表明糖尿病模型制備成功。

表1 兩組大鼠空腹血糖的變化

2.2 TAL組織中TNF-α蛋白表達(dá)

應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測(cè)TAL組織中TNF-α的蛋白表達(dá)(圖1)。結(jié)果顯示:與NC組相比,DM組TNF-α的蛋白表達(dá)明顯升高(n=3,P<0.01)。

圖1 TAL組織中TNF-α的蛋白表達(dá)(與NC組比較,**P<0.01)

2.3 24h鈉平衡指數(shù)

利用“鈉平衡=鈉攝入量-鈉排出量”測(cè)定3周時(shí)各組大鼠24h鈉平衡指數(shù),以判斷鈉潴留情況(表2)。結(jié)果顯示:與NC組相比,DM組鈉平衡指數(shù)升高(n=8,P<0.05);與DM組相比,DM+TNFR:Fc組鈉平衡指數(shù)下降(n=8,P<0.05)。

表2 各組大鼠24h鈉平衡指數(shù)的變化

2.4 TAL管周膜氯通道蛋白表達(dá)

應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測(cè)TAL管周膜氯通道的蛋白表達(dá)(圖2)。結(jié)果顯示:與NC組相比,DM組CLCNK蛋白表達(dá)明顯升高(n=3,P<0.01);與DM組相比,DM+TNFR:Fc組CLCNK蛋白表達(dá)下降(n=3,P<0.05)。

圖2 TNF-α對(duì)TAL管周膜氯通道蛋白表達(dá)的影響(**P<0.01,##P<0.01)

2.5 TAL管周膜氯通道NPo

應(yīng)用細(xì)胞貼附式膜片鉗技術(shù)高阻封接TAL管周膜后記錄氯通道電流,2～3min后向浴槽內(nèi)加入10nM的TNF-α,觀察記錄氯通道電流NPo的變化。結(jié)果顯示:與NC組相比,DM組氯通道電流NPo明顯升高(圖3,n=5,P<0.01)。

圖3 TNF-α對(duì)TAL管周膜氯通道NPo的影響(**P<0.01)

3 討論

糖尿病是全球常見(jiàn)的代謝性疾病之一,具有“發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高”的典型特征,嚴(yán)重威脅著當(dāng)代人類(lèi)的健康和生活質(zhì)量。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)預(yù)測(cè),全世界糖尿病患者人數(shù)至2035年將達(dá)到5.52億,而中國(guó)已成為糖尿病人口第一大國(guó)[3],由此可見(jiàn),深入開(kāi)展疾病的相關(guān)研究已迫在眉睫。而DKD是誘發(fā)終末期腎病最常見(jiàn)的原因,亦是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的主要病因之一,因此,其已成為不可忽視的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題[4]。

DKD的發(fā)病原因較為復(fù)雜,尚未完全闡明。越來(lái)越多的證據(jù)表明DKD患者存在著明顯的微炎性反應(yīng)狀態(tài),表現(xiàn)為單核巨噬系統(tǒng)激活后引發(fā)全身循環(huán)持續(xù)、低水平的炎性因子升高,如TNF-α、IL-6、TGF-β等,因這種炎癥有別于傳統(tǒng)的病原微生物感染所致的炎癥,故而被稱為“微炎癥”[5,6]。其中,TNF-α是一種主要由活化單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多效性炎性細(xì)胞因子,參與機(jī)體多種生理免疫過(guò)程,包括糖尿病腎臟疾病形成的病理過(guò)程。大量研究表明,TNF-α作為一種細(xì)胞毒性因子能夠?qū)δI臟造成直接損傷,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死、導(dǎo)致腎臟血流動(dòng)力失衡;還可誘導(dǎo)活性氧類(lèi)系統(tǒng)的激活,破壞腎小球?yàn)V過(guò)膜的通透性,產(chǎn)生蛋白尿[7],但是否參與到DKD鈉潴留的形成中尚不十分明確。目前,一般認(rèn)為鈉潴留的發(fā)生主要是由腎遠(yuǎn)端小管介導(dǎo)的,而腎遠(yuǎn)端小管對(duì)鈉的重吸收又主要發(fā)生在髓袢升支粗段,生理情況下,小管液中20%～25%的NaCl可經(jīng)TAL管腔膜Na+-K+-2Cl-(NKCC2)同向轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入腎上皮細(xì)胞,再經(jīng)管周膜上的鈉泵和氯通道轉(zhuǎn)運(yùn)至組織間液。由于Cl-濃度升高使細(xì)胞超極化,其擴(kuò)散電位增大,促進(jìn)Cl-出胞的同時(shí)亦驅(qū)動(dòng)了NKCC2的轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)而增加Na+的重吸收[8],因此,管周膜氯通道活性的大小可以調(diào)控小管液中Na+的重吸收。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白免疫印跡和膜片鉗等技術(shù)觀察了糖尿病大鼠模型腎組織中TNF-α的蛋白表達(dá)、TNF-α對(duì)鈉平衡指數(shù)及TAL管周膜氯通道活性的影響,結(jié)果顯示,DKD大鼠腎組織TNF-α蛋白水平顯著上升;鈉平衡指數(shù)及TAL管周膜氯通道蛋白表達(dá)水平顯著上升,給予其阻斷劑后二者均下降;在體外TAL組織中給予TNF-α后,氯通道開(kāi)放率明顯增加。說(shuō)明TNF-α可能是通過(guò)增加TAL管周膜氯通道活性而促進(jìn)了糖尿病大鼠鈉潴留的形成,但TNF-α增加氯通道活性是通過(guò)哪條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的尚不清楚,在今后的實(shí)驗(yàn)研究中將進(jìn)一步探索。本研究為探尋TNF-α對(duì)糖尿病性鈉潴留的形成過(guò)程提供了新的理論依據(jù),亦為DKD的靶向治療指出了新的方向。