HPV感染對(duì)宮頸免疫微環(huán)境的影響

桂芳 黃娟 陽(yáng)大慶

[摘要] 目的 比較高危型和低危型人乳頭瘤病毒（HPV）感染后宮頸局部細(xì)胞因子和陰道微生態(tài)指標(biāo)變化情況，分析不同HPV感染對(duì)宮頸局部免疫微環(huán)境的影響。 方法 收集2017年3月～2018年7月在湖南醫(yī)藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院門診就診的婦女宮頸和陰道分泌物標(biāo)本，用PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)HPV，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將155例標(biāo)本分為高危型HPV組（55例）、低危型HPV組（40例）和未感染HPV的對(duì)照組（60例），用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定宮頸細(xì)胞保存液中的γ干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素4（IL-4）和IL-21含量，并按全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程做真菌、陰道滴蟲、線索細(xì)胞、清潔度和pH檢查。 結(jié)果 與對(duì)照組和低危型HPV組比較，高危型HPV組的IFN-γ和IL-21含量均顯著降低（P < 0.01），但I(xiàn)L-4含量顯著升高（P < 0.01）；與對(duì)照組比較，低危型HPV組的IFN-γ含量顯著降低（P < 0.01），但I(xiàn)L-4和IL-21含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。經(jīng)相關(guān)性分析，高危型HPV組、低危型HPV組和對(duì)照組的IL-21與IFN-γ含量均呈正相關(guān)（r = 0.74，P < 0.01；r = 0.70，P < 0.01；r = 0.66，P < 0.01），高危型和低危型HPV組的IL-4與IFN-γ含量均呈負(fù)相關(guān)（r = -0.33，P < 0.05；r = -0.44，P < 0.01）；高危型HPV組的IL-21與IL-4含量呈負(fù)相關(guān)（r = -0.30，P < 0.05）。此外，三組間真菌、陰道滴蟲、線索細(xì)胞、清潔度和pH等微生態(tài)指標(biāo)的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 高危型HPV比低危型HPV感染后更易引起宮頸局部IL-4和IFN-γ的表達(dá)異常，可能與具有免疫促進(jìn)作用的IL-21低表達(dá)有關(guān)。因此，維持宮頸局部正常免疫微環(huán)境、恢復(fù)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能對(duì)機(jī)體清除HPV、阻斷HPV的持續(xù)感染非常重要。

[關(guān)鍵詞] 人乳頭瘤病毒；免疫；微環(huán)境；細(xì)胞因子

[中圖分類號(hào)] R373.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）05（a）-0163-04

Effects of HPV infection on cervical immune microenviroment

GUI Fang1 HUANG Juan1 YANG Daqing2 LIU Liyan1

1.School of Laboratory Medicine， Hu′nan University of Medicine， Hu′nan Province， Huaihua 418000， China； 2.Department of Clinical Laboratory， the First Affiliated Hospital of Hunan University of Medicine， Hu′nan Province， Huaihua 418000， China

[Abstract] Objective To compare the changes of cervical local cytokines and vaginal microecological indicators after the infection of high-risk and low-risk human papillomavirus （HPV）， and to analyze the effects of different HPV infections on the cervical local immune microenvironment. Methods Collection in March 2017 to July 2018 in the First Affiliated Hospital of Hu′nan University of Medicine Outpatient Clinic women specimens of cervical and vaginal secretions was carried out， PCR - reverse dot hybridization method was used to detect HPV， according to the results， the 155 cases were divided into high risk type HPV group（55 cases）， low-risk HPV group （40 cases） and control group （60 cases）， who were not infected with HPV. Cervical cell preservation solution enzyme linked immunosorbent test was carried out in the gamma interferon （IFN-γ）， interleukin 4 （IL-4） and IL-21 content， and according to the national clinical inspection procedures， the fungi， vaginal trichomoniasis， clue cell， cleanliness， and pH checks were carried out. Results Compared with the control group and low-risk HPV group， the content of IFN-γ and IL-21 in high-risk HPV group was significantly decreased （P < 0.01）， but the content of IL-4 was significantly increased （P < 0.01）. Compared with the control group， the IFN-γ content of low-risk HPV group was significantly reduced （P < 0.01）， but the difference between IL-4 and IL-21 was not statistically significant （P > 0.05）. After correlation analysis， IL-21 was positively correlated with IFN-γ content in high-risk HPV group， low-risk HPV group and control group （r = 0.74， P < 0.01）， r = 0.70， P < 0.01； r = 0.66， P < 0.01）， IL-4 and IFN-γ contents in the high-risk and low-risk HPV groups were negatively correlated （r = -0.33， P < 0.05； r = -0.44， P < 0.01）； IL-21 was negatively correlated with IL-4 in the high-risk HPV group （r = -0.30， P < 0.05）. In addition， there were no statistically significant differences among the three groups in microecological indicators such as fungi， vaginal trichomonas， clue cells， cleanliness and pH （P > 0.05）. Conclusion High-risk HPV is more likely to cause abnormal expression of local IL-4 and IFN-γ in the cervix after HPV infection than low-risk HPV infection， which may be related to the low expression of IL-21 with immune-promoting effect. Therefore， it is very important to maintain the local normal immune microenvironment in the cervix and restore the immune regulatory function of the body to remove HPV and block the continuous infection of HPV.

[Key words] Human papillomavirus； Immune； Microenviroment； Cytokines

高危型人乳頭瘤病毒是引起宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和宮頸癌的主要病因。人乳頭瘤病毒（HPV）感染在有性活動(dòng)的人群中較為常見，大多數(shù)女性感染HPV后可自發(fā)清除病毒，僅少數(shù)發(fā)生持續(xù)感染并發(fā)展為宮頸癌[1]，感染的發(fā)生發(fā)展一方面取決于HPV的感染型別，另一方面與宮頸局部微環(huán)境的免疫功能密切相關(guān)[2-3]。宮頸局部免疫微環(huán)境與陰道微生態(tài)系統(tǒng)、黏膜免疫系統(tǒng)、免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子水平和功能密切相關(guān)[4]。在免疫應(yīng)答過(guò)程中，以γ干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、IL-21為代表的細(xì)胞因子在細(xì)胞免疫、體液免疫和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。據(jù)此，本研究通過(guò)觀察高危型和低危型HPV感染者宮頸局部IFN-γ、IL-4、IL-21水平和陰道微生態(tài)指標(biāo)變化，進(jìn)而分析不同HPV感染對(duì)宮頸局部免疫功能的影響及其機(jī)制，對(duì)阻斷HPV的持續(xù)感染和預(yù)防CIN具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年3月～2018年7月在湖南醫(yī)藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院門診就診的女性作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①1周內(nèi)無(wú)陰道用藥；②1周內(nèi)未服用抗菌藥物；③1周內(nèi)無(wú)性生活。排除標(biāo)準(zhǔn)：①月經(jīng)期、妊娠期和哺乳期；②其他原因引起的陰道出血。同時(shí)，在分組時(shí)排除HPV多重感染情況。共篩選出155名受試者，年齡23～65歲，平均（40.81±9.53）歲，根據(jù)HPV分型檢測(cè)結(jié)果分為三組：未感染HPV的對(duì)照組60例，年齡23～63歲，平均（39.35±10.01）歲；高危型HPV組55例，年齡25～65歲，平均（41.25±8.85）歲；低危型HPV組40例，年齡25～62歲，平均（42.33±9.36）歲。三組人群的年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 儀器與試劑

ETC811型PCR儀（蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司）；YN-H16型分子雜交儀（深圳市亞能生物技術(shù)有限公司）；MB-530型酶標(biāo)儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司）；PCR-反向點(diǎn)雜交法HPV基因分型檢測(cè)試劑盒（深圳市亞能生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：QX201 817029）；Human IL-4、IL-21、IFN-γ ELISA試劑盒（深圳市雨朵生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：E20171201A）。

1.3 標(biāo)本采集

標(biāo)本由婦科醫(yī)師采集，用鹽水濕潤(rùn)的棉拭子在陰道上1/3處旋轉(zhuǎn)一圈，要求棉拭子與陰道的接觸時(shí)間不少于25 s，將棉拭子取出放入無(wú)菌試管中。另取一支棉拭子將宮頸口過(guò)多的分泌物擦去，再將一次性無(wú)菌宮頸采樣器伸入宮頸內(nèi)順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)3～6圈，緩慢抽出宮頸刷，置于裝有細(xì)胞保存液的樣本管中，于2～8℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 方法

1.4.1 HPV分型檢測(cè) 用PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)HPV，基本步驟為：①HPV DNA的提取；②PCR擴(kuò)增；③雜交；④洗膜；⑤顯色。所有操作步驟和結(jié)果判定均嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行。試劑盒檢測(cè)的23種HPV分為高危型和低危型二類，其中高危型HPV有16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82型，低危型HPV有6、11、42、43、81和83型。

1.4.2 細(xì)胞因子檢測(cè) 采用ELISA雙抗夾心法檢測(cè)宮頸細(xì)胞保存液中的IFN-γ、IL-4和IL-21含量。按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔OD值，結(jié)果判斷時(shí)應(yīng)將各試驗(yàn)孔OD值減去空白孔OD值。用試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品制作OD450值與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣本中IFN-γ、IL-4和IL-21的含量。

1.4.3 陰道微生態(tài)指標(biāo)檢測(cè) ①病原體檢測(cè)：取陰道分泌物直接涂片，光學(xué)顯微鏡觀察有無(wú)真菌和陰道滴蟲感染；同時(shí)，將陰道分泌物涂片染色后鏡檢有無(wú)線索細(xì)胞，據(jù)此診斷細(xì)菌性陰道炎。②陰道清潔度檢測(cè)：將陰道分泌物做生理鹽水直接涂片、鏡檢，根據(jù)上皮細(xì)胞、白細(xì)胞、乳酸桿菌和雜菌數(shù)量比例分為Ⅰ～Ⅳ度，判定標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第四版[5]。③陰道pH值檢測(cè)：采用精密pH試紙測(cè)定陰道分泌物的pH值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。采用Pearson線性相關(guān)分析方法作兩變量間的相關(guān)分析。分類變量資料采用率或構(gòu)成比來(lái)進(jìn)行描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染組型別分布情況

根據(jù)該院各型HPV的檢出情況，分別選擇55例高危型HPV感染者和40例低危型HPV感染者作為試驗(yàn)組，其中高危型HPV組包括16、18、31、33、39、45、51、52、53、56、58、59、68和82型；低危型HPV組包括6、11、42、43、81和83型。

2.2 三組IL-4、IFN-γ、IL-21含量比較

三組人群的IFN-γ、IL-4和IL-21含量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。其中，與對(duì)照組和低危型HPV組比較，高危型HPV組的IFN-γ和IL-21含量均降低，但I(xiàn)L-4含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；與對(duì)照組比較，低危型HPV組的IFN-γ含量降低（P < 0.01），但兩組的IL-4和IL-21含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.3 三組IL-4、IFN-γ、IL-21指標(biāo)的線性相關(guān)分析

高危型HPV組、低危型HPV組和對(duì)照組的IL-21與IFN-γ含量均呈正相關(guān)（P < 0.01），高危型HPV組的IL-21與IL-4、IL-4與IFN-γ含量均呈負(fù)相關(guān)（P < 0.05），低危型HPV組的IL-4與IFN-γ含量呈負(fù)相關(guān)（P < 0.01）。見表2。

2.4 陰道微生態(tài)檢測(cè)結(jié)果

對(duì)高危型HPV組、低危型HPV組和對(duì)照組的陰道分泌物真菌、陰道滴蟲、線索細(xì)胞、pH值和清潔度檢查結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，三組間各指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。

3 討論

HPV是一種無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)100多個(gè)型別，其中至少有40余種亞型可造成女性生殖系統(tǒng)感染?，F(xiàn)已證明，高危型HPV的持續(xù)感染是導(dǎo)致CIN及宮頸癌的重要因素[6-7]。HPV感染在有性活動(dòng)的人群中較為常見，機(jī)體感染HPV后大部分情況下可清除病毒，是否發(fā)生持續(xù)感染及感染后的轉(zhuǎn)歸與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)，其中，陰道和宮頸黏膜免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵抗HPV感染的一道重要防線，其功能受局部微生態(tài)系統(tǒng)、免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子等多種因素影響[8-10]。因此，了解宮頸局部微環(huán)境改變有助于探討HPV持續(xù)感染并導(dǎo)致CIN及癌變的可能機(jī)制，可為宮頸癌的防治提供新思路。

本研究發(fā)現(xiàn)，與未感染HPV的對(duì)照組比較，高危型HPV感染者宮頸局部IL-4含量明顯升高，而IFN-γ含量顯著降低。在免疫應(yīng)答過(guò)程中，IFN-γ和IL-4是二種重要的免疫效應(yīng)分子，IL-4主要由Th2細(xì)胞分泌，能促進(jìn)Th2細(xì)胞的增殖，發(fā)揮體液免疫效應(yīng)，并抑制Th1細(xì)胞增殖；IFN-γ則主要由Th1細(xì)胞分泌，能促進(jìn)Th1細(xì)胞的增殖，發(fā)揮細(xì)胞免疫效應(yīng)，同時(shí)抑制Th2細(xì)胞增殖。因此，IFN-γ和IL-4含量的變化提示高危型HPV感染有可能導(dǎo)致Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答向Th2型體液免疫應(yīng)答漂移，這與其他研究[11-12]一致。

Th1/Th2漂移的形成機(jī)制目前尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV感染后宮頸局部IL-21含量降低，并與IFN-γ含量呈正相關(guān)，而與IL-4含量呈負(fù)相關(guān)。IL-21是IL-2細(xì)胞因子的一個(gè)家族成員，主要由活化的CD4+T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞17、自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）等免疫細(xì)胞分泌產(chǎn)生，也可由纖維細(xì)胞等非免疫細(xì)胞產(chǎn)生，其受體分布廣泛[13]，具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能，能增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[14]、促進(jìn)IFN-γ的分泌及抗體的產(chǎn)生，并有助于T細(xì)胞抵抗Treg細(xì)胞的免疫抑制作用，進(jìn)而加強(qiáng)T細(xì)胞活性[15]。因此，宮頸局部IL-21減少提示患者的免疫調(diào)節(jié)功能出現(xiàn)異常，這可能是引起Th1/Th2漂移的原因之一，并由此導(dǎo)致IFN-γ的分泌減少、T細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性降低，使機(jī)體的抗病毒和抗腫瘤功能下降，進(jìn)而引起HPV的持續(xù)感染和CIN。

此外，與高危型HPV感染不同的是，低危型HPV感染后僅IFN-γ含量減少，而IL-4和IL-21含量無(wú)明顯改變，提示機(jī)體的抗病毒功能雖有下降，但可能尚未出現(xiàn)明顯的Th細(xì)胞漂移，因此更有利于機(jī)體清除病毒，不易出現(xiàn)HPV的持續(xù)感染。

HPV的持續(xù)感染除與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)外，還與陰道微生態(tài)系統(tǒng)有關(guān)[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，高危型和低危型HPV感染者陰道局部真菌、陰道滴蟲、線索細(xì)胞、pH值、清潔度等指標(biāo)與對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），這與其他報(bào)道[18-20]不盡相同。其原因可能是標(biāo)本來(lái)源有差異，例如患者感染的HPV型別、年齡分布、標(biāo)本的采集時(shí)間等都可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)此尚需做進(jìn)一步研究。

綜上所述，HPV感染與宮頸免疫微環(huán)境之間相互作用、相互影響，高危型HPV比低危型HPV感染后更易引起宮頸局部IL-4和IFN-γ的表達(dá)異常，推測(cè)局部可能發(fā)生Th1/Th2漂移，其原因可能與具有免疫促進(jìn)作用的IL-21低表達(dá)有關(guān)。局部細(xì)胞免疫功能下降有利于HPV的持續(xù)增殖，進(jìn)而引起宮頸出現(xiàn)病理性改變甚至CIN。因此，維持宮頸局部正常免疫微環(huán)境、恢復(fù)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能對(duì)機(jī)體清除HPV和預(yù)防CIN具有非常重要的臨床意義。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 趙靜，陳汶，劉植華，等.常見陰道微生態(tài)異常與高危型HPV感染及子宮頸癌相關(guān)性研究進(jìn)展[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2018，18（11）：1099-1102.

[2] Piersma SJ. Immunosuppressive tumor microenvironment in cervical cancer patients [J]. Cancer Microenviron，2011， 4（3）：361-375.

[3] Barros MR，de Melo CML，Barros MLCMGR，et al. Activities of stromal and immune cells in HPV-related cancers [J]. J Exp Clin Cancer Res，2018，37（1）：137.

[4] 曹建芳，郝敏，趙衛(wèi)紅.宮頸微環(huán)境免疫功能與宮頸癌[J].國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2015，42（3）：249-252.

[5] 尚紅，王毓三，申子瑜.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2015：196-197.

[6] Stone SC，Rossetti RA，Lima AM，et al. HPV associated tumor cells control tumor microenvironment and leukocytosis in experimental models [J]. Immun Inflamm Dis，2014， 2（2）：63-75.

[7] Haedicke J，Iftner T. Human papillomaviruses and cancer [J]. Radiother Oncol，2013，108（3）：397-402.

[8] 茹普霞，李東燕.陰道微生態(tài)平衡與持續(xù)性高危型HPV感染分析[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，48（12）：1288-1290.

[9] 陶瑞，朱丹，孫鹥，等.人乳頭瘤病毒感染與宮頸局部細(xì)胞因子相關(guān)性研究[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2017，38（15）：2028-2033.

[10] Xue J，Wang Y，Chen C，et al. Effects of Th17 cells and IL-17 in the progression of cervical carcinogenesis with high-risk human papillomavirus infection [J]. Cancer Med，2018，7（2）：297-306.

[11] 洪慧，王鶴.HPV16、58型感染導(dǎo)致宮頸微環(huán)境中免疫因子變化及宮頸細(xì)胞中病毒整合的初步研究[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2014，30（10）：1378-1382.

[12] Feng Q，Wei H，Morihara J，et al. Th2 type inflammation promotes the gradual progression of HPV-infected cervical cells to cervical carcinoma [J]. Gynecol Oncol，2012， 127（2）：412-419.

[13] Hamming OJ，Kang L，Svensson A，et al. Crystal structure of interleukin-21 receptor （IL-21R） bound to IL-21 reveals that sugar chain interacting with WSXWS motif is integral part of IL-21R [J]. J Biol Chem，2012，287（12）：9454-9460.

[14] Davis MR，Zhu Z，Hansen DM，et al. The role of IL-21 in immunity and cancer [J]. Cancer Lett，2015，358（2）：107-114.

[15] 方麗娟.IL-21在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].國(guó)際免疫學(xué)雜志，2006，29（3）：189-193.

[16] Castro Sobrinho JM，Rabelo Santos SH，F(xiàn)ugueiredo Alves RR，et al. Bacterial vaginosis and inflammatory response showed association with severity of cervical neoplasia in HPV-positive women [J]. Diagn Cytopathol，2016，44（2）：80-86.

[17] 楊少巖，吳瀟，李杰，等.陰道微環(huán)境改變與宮頸病變的相關(guān)性分析[J].中國(guó)臨床保健雜志，2017，20（3）：247-250.

[18] 陳憶，吳丹，李柱南，等.細(xì)菌性陰道病和陰道微生態(tài)改變與高危型人乳頭瘤病毒感染的臨床分析[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2018，15（21）：86-89.

[19] Godoy-Vitorino F，Romaguera J，Zhao C，et al. Cervicovaginal Fungi and Bacteria Associated With Cervical Intraepithelial Neoplasia and High-Risk Human Papillomavirus Infections in a Hispanic Population [J]. Front Microbiol，2018，23（9）：2533.

[20] 謝建萍，楊志紅，伊芳，等.宮頸高危型人乳頭瘤病毒感染與陰道菌群及宮頸局部免疫功能的關(guān)系[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2017，27（10）：2336-2339.

（收稿日期：2018-11-12 本文編輯：封 華）