TP53基因單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性肝細(xì)胞癌預(yù)后的關(guān)系

唐豪言，潘正龍，劉小方

在世界范圍內(nèi)肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)病率和死亡率位居惡性腫瘤第6 位和第4 位［1］，主要由乙型肝炎病毒慢性感染所致。中國(guó)是乙肝大國(guó)，肝癌發(fā)病率高居我國(guó)惡性腫瘤的第4位［2］。目前，HCC 有許多既定的治療方法，包括化療、射頻消融、肝移植及手術(shù)切除等。然而，即使早期已接受相關(guān)治療的患者生存率也比較低，手術(shù)作為最常見(jiàn)的治療手段，術(shù)后5 年內(nèi)的肝癌復(fù)發(fā)率也高達(dá)60%~70%［3-4］。研究HCC患者術(shù)后預(yù)后的危險(xiǎn)因素，對(duì)提高肝癌的治療效果具有重要意義。TP53基因作為一個(gè)高度突變的抑癌基因，涉及人類多數(shù)腫瘤。該基因位于染色體17p13.1，由12 個(gè)外顯子和10 個(gè)內(nèi)含子組成，其蛋白產(chǎn)物p53 維持著細(xì)胞正常的基本活動(dòng)，如細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡和DNA損傷修復(fù)［5-6］。TP53基因突變作為HCC里最常見(jiàn)的突變［7］，其改變不僅與腫瘤增殖、遷移、生長(zhǎng)、侵襲及化療藥物的耐藥性相關(guān)［8-9］，同時(shí)具有TP53基因突變的患者肝癌復(fù)發(fā)時(shí)間和總生存期也會(huì)受到影響［10］。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）作為基因重要的變異形式，廣泛參與各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［11］。近年來(lái)，與腫瘤預(yù)后有關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)被相繼報(bào)道，但關(guān)于HCC預(yù)后的研究相對(duì)較少。本研究旨在探討HCC 患者預(yù)后的影響因素，并探究TP53基因SNP與HCC患者預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2014 年1 月—2020 年9 月在青島大學(xué)附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院接受手術(shù)治療且住院資料完整的HCC患者213例。納入標(biāo)準(zhǔn)：已行肝惡性腫瘤切除手術(shù)；病理組織學(xué)診斷為HCC；采集血液樣本前未行放療或化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有其他腫瘤病史；同期合并其他器官惡性腫瘤。研究參與者對(duì)試驗(yàn)知情同意，且通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：煙毓醫(yī)倫理審2019-169號(hào)）。

1.2 收集指標(biāo) 通過(guò)查閱病歷和標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)卷收集研究對(duì)象年齡、性別，吸煙、飲酒情況，乙型病毒性肝炎感染病史、手術(shù)方式及圍術(shù)期輸血病史。同時(shí)收集患者相關(guān)臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)，包括腫瘤T分期、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、肝硬化、門靜脈癌栓情況等。

1.3 隨訪 通過(guò)電話或門診進(jìn)行隨訪。術(shù)后前2年每3個(gè)月進(jìn)行1次，從術(shù)后第3年起每6個(gè)月進(jìn)行1次。隨訪終點(diǎn)事件為患者死亡或隨訪截止時(shí)間（截至2021年9月1日）。

1.4 SNP位點(diǎn)的選擇和基因分型 基于以往相關(guān)腫瘤報(bào)道，尤其是涉及HCC預(yù)后文獻(xiàn)，并利用TRANSFACR預(yù)測(cè)軟件及NCBI dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）篩選出TP53基因功能性SNP位點(diǎn)。其選擇標(biāo)準(zhǔn)為：SNP位點(diǎn)的最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.05。最終篩選出3 個(gè)SNP 作為研究對(duì)象，即TP53 基因rs1625895、rs9895829和rs28934578。

取靜脈血5 mL，采用血液基因組提取試劑盒（北京博奧醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司）提取DNA，DNA片段需完整性好，無(wú)降解，無(wú)小片段RNA 污染，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用聚合酶鏈反?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)（PCR-RFLP）對(duì)基因型進(jìn)行鑒別。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］。TP53 rs1625895引物序列：上游5'-TGGCCATCTACAAGCAGTCA-3'，下游5'-TTGCACATCTCATGGGGTTA-3'。TP53 rs9895829 引物序列：上游5'-GCACCTCCTGCAACCCACTAGCGAT-3'，下游5'-CTCTCAAAGAGGCCAAGGCAGGCAG-3'。TP53 rs28934578 引物序列：上游5'-GTCTCTGCTAGGGGGCTGGACTTGG-3'，下游5'-CAGGAGTGCTTGGGTTGTGGTGAAA-3'。各SNP 位點(diǎn)均需要1 條延伸引物和2 條PCR 擴(kuò)增引物。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，45 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將PCR 產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶消化，消化程序：37 ℃40 min，85 ℃5 min。按照延伸反應(yīng)擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR產(chǎn)物的延伸，所得產(chǎn)物采用樹(shù)脂板進(jìn)行純化。采用MassARRAY?質(zhì)譜分析儀（美國(guó)Agena Bioscience 公司）對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析，檢測(cè)數(shù)據(jù)使用Typer 4.0 分析軟件分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示。運(yùn)用單因素或多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型計(jì)算危險(xiǎn)比（HR）及其95%CI并校正混雜因素，采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，采用Log-rank 檢驗(yàn)比較不同基因型之間的生存率差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象一般資料及臨床特征與HCC 預(yù)后的關(guān)系 單因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示腫瘤大小、腫瘤T 分期、手術(shù)方式、圍術(shù)期輸血、腫瘤數(shù)目及肝硬化情況與肝癌預(yù)后相關(guān)（P＜0.05），但年齡、性別、吸煙、飲酒、HBV感染史、肝癌家族史與及門靜脈癌栓方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1 Relationship between clinical characteristics and the prognosis of hepatocellular carcinoma patients表1 HCC患者臨床特征與預(yù)后的關(guān)系［例（%）］

2.2TP53SNPs 與HCC 預(yù)后的關(guān)系TP53基因rs1625895、rs9895829、rs28934578 位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg 平衡，具有群體代表性。采用Kaplan-Meier、單因素Cox 回歸分析rs1625895、rs9895829、rs28934578 位點(diǎn)后發(fā)現(xiàn)：TP53基因rs1625895 除顯性模型外，其共顯性模型（HR=2.190，95%CI：1.142～4.201，P=0.018）和隱性基因模型（HR=2.275，95%CI：1.225～4.227，P=0.009）與肝癌患者預(yù)后相關(guān)，見(jiàn)圖1、表2。由于大多數(shù)肝癌患者確診時(shí)年齡較大，老年患者的中位生存時(shí)間均短于年輕患者，故對(duì)年齡進(jìn)行分層分析。結(jié)果顯示在年齡≥60歲的人群中，共顯性模型和隱性模型中AA基因型患者預(yù)后表現(xiàn)更差。TP53基因rs9895829、rs28934578位點(diǎn)基因多態(tài)性與HCC預(yù)后無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表3。

Fig.1 TP53 gene rs1625895 Kaplan-Meier survival curve in patients with hepatocellular carcinoma patients圖1 HCC患者TP53基因rs1625895位點(diǎn)不同遺傳模型的生存曲線

Tab.2 Relationship between TP53 SNPs and the prognosis of hepatocellular carcinoma patients表2 TP53 SNPs與HCC患者預(yù)后的關(guān)系［例（%）］

Tab.3 Relationship between TP53 gene rs1625895 and prognosis of HCC patients after age stratification表3 年齡分層后TP53基因rs1625895位點(diǎn)多態(tài)性與HCC患者預(yù)后的關(guān)系［例（%）］

2.3 HCC預(yù)后的影響因素分析 采用多因素Cox回歸分析影響HCC 患者術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立因素。變量賦值：腫瘤T 分期（T1+T2＝0，T3+T4＝1）；腫瘤大?。ǎ? cm＝0，≥5 cm＝1）；rs1625895（AG/GG＝0，AA＝1）；手術(shù)方式（根治性切除＝0，姑息性切除＝1）；圍術(shù)期輸血（否＝0，是＝1）；腫瘤數(shù)目（單發(fā)＝0，多發(fā)＝1）；肝硬化（否＝0，是＝1）。結(jié)果顯示腫瘤T3+T4 分期、腫瘤直徑≥5 cm、TP53rs1625895 AA 基因型、腫瘤姑息性切除、圍術(shù)期輸血、腫瘤多發(fā)以及患有肝硬化是影響肝癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表4。

Tab.4 Cox regression analysis of the prognosis of hepatocellular carcinoma patients表4 HCC患者預(yù)后多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸結(jié)果

3 討論

本研究探討TP53基因多態(tài)性與HCC 預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示rs1625895位點(diǎn)多態(tài)性與肝癌術(shù)后生存期相關(guān)，AA 基因型患者較AG/GG 基因型患者術(shù)后預(yù)后更差，這一情況在年齡≥60歲人群中更為明顯。

3.1TP53基因SNP研究現(xiàn)狀TP53基因SNP在多個(gè)與癌癥相關(guān)的途徑中發(fā)揮核心作用［12］。p53通路里存在許多涉及不同腫瘤且功能復(fù)雜的SNP 位點(diǎn)，它們結(jié)構(gòu)變異或異常表達(dá)能不同程度地影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，最終影響患者預(yù)后并體現(xiàn)于患者的生存周期上。目前已證實(shí)TP53基因多態(tài)性位點(diǎn)與多種腫瘤預(yù)后相關(guān)。Assad Samani 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在伊朗人群中，rs1625895位點(diǎn)攜帶A等位基因的乳腺癌患者早期死亡風(fēng)險(xiǎn)是攜帶G 等位基因患者的3 倍。Voropaeva 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，rs1625895 多態(tài)性會(huì)影響彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者化療方案的治愈率，大大降低患者生存周期。在TP53基因多態(tài)性與低位直腸癌的生物學(xué)行為相關(guān)研究中，Zhang等［15-16］發(fā)現(xiàn)p53蛋白表達(dá)受TP53基因rs1042522多態(tài)性影響，這使得腫瘤更快發(fā)展到晚期，間接縮短了患者的生存期。

3.2TP53基因SNP 與HCC 的關(guān)系 本研究發(fā)現(xiàn)TP53基因rs1625895位點(diǎn)多態(tài)性與肝癌術(shù)后人群生存周期相關(guān)。rs1625895 位于TP53基因第6 內(nèi)含子上，由等位基因A和G組成，該區(qū)域的SNP通常會(huì)影響TP53mRNA 的加工（如剪接）步驟及DNA 鏈和蛋白分子之間的相互作用，同時(shí)引起細(xì)胞DNA 損傷修復(fù)及凋亡能力下降，加速腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展［13，17-18］。TP53基因該點(diǎn)的多態(tài)性是因限制性內(nèi)切酶MspI上的鳥(niǎo)嘌呤與腺嘌呤之間的替換所引起的，這會(huì)影響到限制性內(nèi)切酶的正常功能，進(jìn)而導(dǎo)致TP53基因表達(dá)減少，并可能破壞細(xì)胞周期停滯和凋亡所需的靶基因轉(zhuǎn)錄激活的過(guò)程［19］。特別是當(dāng)這種突變與有缺陷的腫瘤抑制因子或紡錘體檢查位點(diǎn)相結(jié)合時(shí)，更容易引起基因組不穩(wěn)定［20-21］。有研究表明TP53基因該位點(diǎn)的多態(tài)性可能會(huì)讓其失去抑制腫瘤的功能，相反會(huì)獲得一種推進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的新能力。楊怡等［22］研究發(fā)現(xiàn)TP53基因的變異會(huì)促進(jìn)血管新生，肝臟腫瘤病灶轉(zhuǎn)移發(fā)生率增高，腫瘤更具侵襲性，最終使得患者的生存周期明顯縮短。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織學(xué)分級(jí)不光與TP53基因突變有關(guān)，突變患者的總體生存期、疾病特異性生存期、無(wú)進(jìn)展生存期和無(wú)病生存期也明顯差于無(wú)突變的患者［6］。

3.3 HCC預(yù)后的影響因素 本研究多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤T3+T4分期、腫瘤直徑≥5 cm、腫瘤姑息性切除、圍術(shù)期輸血、腫瘤多發(fā)及患有肝硬化同樣是影響肝癌患者術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。分析其原因如下：（1）T分期較晚的患者往往肝功能已嚴(yán)重受損，行肝切除術(shù)時(shí)會(huì)增大術(shù)中大出血及術(shù)后出現(xiàn)肝功能衰竭的風(fēng)險(xiǎn)［23］。（2）腫瘤大小和微血管侵襲之間存在顯著的關(guān)聯(lián)，即腫瘤體積較大者發(fā)生術(shù)后腹腔轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高，從而降低了患者生存期［24］。（3）多發(fā)腫瘤較單發(fā)腫瘤更易轉(zhuǎn)移，同時(shí)多發(fā)腫瘤更易導(dǎo)致抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的基因突變［25］。（4）肝硬化常伴有凝血功能的異常，這不僅增加出血風(fēng)險(xiǎn)同時(shí)還增大了手術(shù)難度［26］。（5）根治性肝切除的患者殘存肝臟的負(fù)荷會(huì)增大，而姑息性手術(shù)的患者則會(huì)因殘留的癌細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)［27］。（6）圍術(shù)期輸血會(huì)降低機(jī)體外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量，降低免疫功能，可能會(huì)增加殘余肝臟內(nèi)新生腫瘤的復(fù)發(fā)［28］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TP53基因rs1625895 位點(diǎn)與HCC患者術(shù)后的預(yù)后相關(guān)，尤其對(duì)老年群體術(shù)后OS影響更大。但同時(shí)也存在一定局限性，SNP位點(diǎn)分布頻率可能會(huì)受到地域、人種等因素的影響，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)果的偏差。本研究樣本量相對(duì)較小，今后將增大樣本量并采用前瞻性研究進(jìn)一步證實(shí)。目前關(guān)于TP53基因多態(tài)性與HCC 預(yù)后的報(bào)道相對(duì)較少，其中的分子機(jī)制還尚未完全闡明，對(duì)于未來(lái)肝癌相關(guān)基因多態(tài)性位點(diǎn)研究的方向，功能驗(yàn)證將是重要的一環(huán)，這需要進(jìn)一步深入探究。