柿葉黃酮通過激活自噬與抗氧化應(yīng)激協(xié)同作用改善NAFLD大鼠肝臟脂肪變性

王蓮，肖繼椿，田垚，李錫晶，王璐瑤，王嵐，楊博涵，張榮泉

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是全球流行的慢性肝病，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，其患病率逐年增高，全球的患病率高達17%~33%［1］，高風(fēng)險人群可達25%~40%［2］。該病是指除酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征［3-4］；病程包括肝臟脂肪變性、脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝細胞肝癌［5-6］；病因機制復(fù)雜，涉及胰島素抵抗、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、自噬等多個因素。近年的研究表明，自噬與氧化應(yīng)激關(guān)系密切，極有可能是通過自噬受體蛋白Sequestosome-1/Protein62（SQSTM-1/P62）相關(guān)聯(lián)，刺激釋放核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Nrf2），激活下游基因表達，提高肝細胞抗氧化應(yīng)激能力［7］；兩者作為人體2個主要細胞防御機制，是NAFLD 發(fā)病的重要因素，也是改善NAFLD 的潛在治療靶點。柿葉黃酮（persimmon leaf flavonoids，PLF）是柿葉提取物中的主要活性成分，具有抗氧化［8］、抗炎［9］、降血脂［10］、降血糖、保護肝臟［11］等多種藥理作用。本實驗旨在研究PLF是否通過激活自噬與抗氧化應(yīng)激的協(xié)同作用促進NAFLD大鼠抗氧化能力，從而對肝臟起到保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠34只，6~7周齡，體質(zhì)量90~110 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0008。于天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所實驗動物中心SPF 級環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)，溫度20~25 ℃，相對濕度40%~70%，光照/黑暗12 h交替。

1.2 試劑與儀器 PLF、高脂飼料（配方為基礎(chǔ)飼料88%、豬油10%、膽固醇2%）由天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所天然產(chǎn)物與功能性食品研究室提供；水飛薊賓膠囊（水林佳，35 mg/粒，國藥準字H20040299）購自天津天士力圣特制藥有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA），兔源微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、Nrf2 一抗購于Immunoway 公司；P62 抗體、山羊抗兔二抗購于Boster 公司；β-actin 抗體購于CST 公司。TOSHIBATBA40-FR 全自動生化分析儀購于日本東芝公司；Mini-protean Tetra System 電泳儀購于美國Bio-Rad公司；LAS500凝膠成像發(fā)光一體機購于美國GE公司；Eclipse Ci-L顯微鏡、NIS-BRML圖像分析系統(tǒng)購于日本尼康公司；EG1150H自動生物組織包埋機購于德國徠卡公司。

1.3 研究方法

1.3.1 PLF的制備 以河北產(chǎn)干燥柿葉為原料，使用70%乙醇回流提取3次，過濾。在濾液中加入20%NaOH 至pH值為9~10，以石油醚反復(fù)萃取后，向水相中加入15%HCl 調(diào)至pH值為5~6，以乙酸乙酯反復(fù)萃取，收集乙酸乙酯濃縮干燥，得PLF粗樣品。以蘆丁為對照品，使用紫外分光光度法檢測樣品中PLF含量為30%。

1.3.2 造模、分組及給藥 SD大鼠于實驗開始前1周置于實驗環(huán)境中，自由進食進水，自然晝夜節(jié)律。將大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組（8只）和造模組（26只），對照組予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，造模組給予高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)12周，期間無死亡。在12周末從對照組和造模組中各隨機取2只大鼠麻醉處死，檢測血清肝功能。取肝臟組織，蘇木素-伊紅（HE）染色后進行組織病理學(xué)觀察，當造模組丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）明顯升高，且肝組織呈現(xiàn)明顯脂肪空泡時，可確定模型建立成功。

將造模成功的24只大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、陽性藥物對照組（水林佳組）、PLF 干預(yù)組（PLF 組）、PLF+自噬抑制劑組（PLF+3-MA 組），每組6 只。對照組和模型組給予PBS灌胃；水林佳組給予28 mg/kg水林佳灌胃［12］；PLF組給予PLF 200 mg/kg 灌胃［13］；PLF+3-MA 組給予PLF 200 mg/kg 灌胃及2 mg/kg3-MA 腹腔注射［14］。以上各組均每日給藥1 次，干預(yù)6周，給藥結(jié)束后再按照實驗路線圖對相關(guān)檢測指標進行測定，見圖1。

Fig.1 Experimental technology roadmap圖1 實驗技術(shù)路線圖

1.3.3 血脂水平檢測 于末次給藥次日上午空腹取血，以3 000 r/min 離心15 min，分離血清。使用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的含量。

1.3.4 肝組織病理學(xué)評價及肝功能檢測 稱取大鼠體質(zhì)量，解剖分離肝臟，濾紙吸凈殘余血液，稱取肝質(zhì)量，比較各組大鼠體質(zhì)量和肝質(zhì)量水平，計算肝指數(shù)（肝指數(shù)=肝質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）。取各組大鼠肝臟右葉組織，一部分于-80 ℃冷凍保存，另一部分于4%中性甲醛固定后，經(jīng)脫水、透明，石蠟包埋，切片、封片后，進行HE染色，于正置顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變。使用全自動生化分析儀檢測ALT和AST。

1.3.5 氧化應(yīng)激指標檢測 稱取適量大鼠肝臟右葉組織，按照質(zhì)量體積比1︰10加入提取液，進行冰浴勻漿，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液。按照微量法試劑盒說明書檢測肝臟組織氧化應(yīng)激指標SOD和MDA含量。

1.3.6 Western blot 檢測肝組織Nrf2、P62、LC3-Ⅱ蛋白表達水平 稱取肝臟右葉組織，加入RIPA 蛋白裂解液進行充分碾磨，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，提取上清液制作蛋白樣品，采用BCA法測定蛋白濃度。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，各組取等質(zhì)量蛋白上樣，進行電泳分離，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗稀釋液（1︰5 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次；加入二抗（1︰5 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。顯影劑顯影，采用凝膠成像儀分析系統(tǒng)半定量分析各蛋白表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量數(shù)據(jù)以表示。組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLF 對NAFLD 大鼠血脂水平的影響 與對照組相比，模型組大鼠血清TC、TG 和LDL-C 水平升高，HDL-C水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，PLF組和水林佳組TC、TG、LDL-C 水平均降低（P＜0.05）；與PLF組相比，PLF+3-MA組對TC、TG、LDLC 水平的降低作用均減弱（P＜0.05）；但PLF 組、PLF+3-MA 組和水林佳組均未能升高HDL-C 水平，見表1。

Tab.1 Comparison of serum lipid indexes between five groups表1 各組大鼠血脂水平比較 （n=6，mmol/L，）

Tab.1 Comparison of serum lipid indexes between five groups表1 各組大鼠血脂水平比較 （n=6，mmol/L，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與水林佳組比較，d與PLF組比較，P＜0.05；表2—4同。

組別對照組模型組水林佳組PLF組PLF+3-MA組F TC 1.23±0.09 2.15±0.41a 1.34±0.27b 1.04±0.21b 1.71±0.22d 17.120＊＊TG 0.34±0.08 0.52±0.11a 0.30±0.04b 0.22±0.06b 0.34±0.08d 11.963＊＊HDL-C 0.54±0.06 0.38±0.04a 0.31±0.02b 0.31±0.03b 0.32±0.03 41.480＊＊LDL-C 0.22±0.06 0.68±0.09a 0.26±0.06b 0.19±0.04bc 0.29±0.04d 67.921＊＊

2.2 PLF對肝組織病理學(xué)的影響 肝臟形態(tài)觀察顯示，對照組肝臟顏色暗紅，表面光滑完整，彈性好，邊緣銳利；模型組肝臟呈現(xiàn)黃白色，表面粗糙，可見顆粒，彈性減弱，邊緣鈍；與模型組相比，水林佳組和PLF組肝臟顏色呈現(xiàn)暗紅，表面粗糙感減弱，顆粒減少，形態(tài)明顯得到改善；與PLF 組相比，PLF+3-MA組肝臟呈暗紅色，但顏色稍淺，表面顆粒較多，見圖2。HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠肝細胞大小均勻，肝細胞內(nèi)無脂滴，形態(tài)未見明顯異常；模型組肝臟細胞體積增大，胞質(zhì)含脂滴，并形成空泡，局部匯管區(qū)或肝小葉見炎性細胞浸潤；相比于模型組，PLF 組、水林佳組的肝臟細胞明顯減小，胞漿內(nèi)脂肪空泡和脂滴數(shù)量減少，炎性細胞浸潤情況改善明顯；相比于PLF 組，PLF+3-MA 組細胞偏大，胞漿內(nèi)脂肪空泡和脂滴數(shù)量較多，見圖3。

Fig.2 Anatomical morphology of liver in the five groups圖2 各組大鼠肝臟解剖形態(tài)

Fig.3 Pathological staining results of liver tissue in the five groups(HE staining,×100)圖3 各組大鼠肝臟組織病理染色結(jié)果（HE染色，×100）

2.3 PLF 對肝功能的影響 與對照組相比，模型組大鼠肝指數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組相比，PLF 組和水林佳組肝指數(shù)降低（P＜0.05）；但PLF+3-MA組與PLF 組肝指數(shù)的測定結(jié)果相近。與對照組相比，模型組ALT、AST 也明顯增高（P＜0.05）；與模型組相比，PLF 組、水林佳組的ALT、AST 水平下降（P＜0.05）；且PLF+3-MA 組對AST 的降低作用要弱于PLF組（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of ALT and AST contents in serum and liver index between five groups表2 各組大鼠血清ALT、AST含量及肝指數(shù)比較（n=6，）

Tab.2 Comparison of ALT and AST contents in serum and liver index between five groups表2 各組大鼠血清ALT、AST含量及肝指數(shù)比較（n=6，）

組別對照組模型組水林佳組PLF組PLF+3-MA組F 54.48±3.50 74.75±5.09a 54.58±5.00b 48.92±3.57bc 51.72±3.45 35.934＊＊119.78±10.46 176.87±12.94a 131.42±10.60b 102.17±10.60bc 140.45±10.20d 38.405＊＊2.64±0.31 4.48±0.83a 2.72±0.29b 2.69±0.36b 2.73±0.19 18.487＊＊ALT/（U/L）AST/（U/L）肝指數(shù)/%

2.4 PLF 對氧化應(yīng)激水平的影響 與對照組相比，模型組大鼠肝臟組織中的SOD水平降低，MDA水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，PLF 組和水林佳組均能明顯升高SOD水平，降低MDA水平（P＜0.05）；與PLF 組相比，PLF+3-MA 組對SOD 和MDA 指標的改善作用均減弱（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of SOD and MDA contents in liver tissue between five groups表3 各組大鼠肝臟組織中SOD和MDA含量比較（n=6，）

Tab.3 Comparison of SOD and MDA contents in liver tissue between five groups表3 各組大鼠肝臟組織中SOD和MDA含量比較（n=6，）

組別對照組模型組水林佳組PLF組PLF+3-MA組F SOD/（U/g）106.91±9.50 39.13±7.07a 75.85±8.62b 101.17±10.22bc 53.33±7.81d 68.246＊＊MDA/（nmol/g）23.99±2.99 98.33±9.76a 36.34±5.76b 31.68±5.45b 44.10±6.43d 126.744＊＊

2.5 PLF 對肝組織中Nrf2、P62、LC3-Ⅱ蛋白表達的影響 與對照組相比，模型組P62 蛋白表達增加，Nrf2 和LC3-Ⅱ蛋白表達降低（P＜0.05）；與模型組相比，PLF 組和水林佳組P62 蛋白表達降低，Nrf2、LC3-Ⅱ蛋白表達升高（P＜0.05）；而PLF+3-MA 組LC3-Ⅱ、Nrf2的蛋白表達低于PLF組，P62蛋白表達高于PLF組（P＜0.05），見圖4、表4。

Tab.4 Comparison of expression levels of Nrf2,P62 and LC3-Ⅱbetween five groups表4 各組大鼠Nrf2、P62和LC3-Ⅱ蛋白表達水平比較（n=6，）

Tab.4 Comparison of expression levels of Nrf2,P62 and LC3-Ⅱbetween five groups表4 各組大鼠Nrf2、P62和LC3-Ⅱ蛋白表達水平比較（n=6，）

組別對照組模型組水林佳組PLF組PLF+3-MA組F 2.17±0.13 0.76±0.02a 1.40±0.07b 3.89±0.29bc 1.47±0.05d 407.064＊＊0.87±0.06 2.85±0.18a 1.24±0.08b 1.03±0.08bc 1.55±0.07d 337.128＊＊1.95±0.15 1.03±0.09a 1.65±0.06b 1.66±0.08b 1.23±0.12d 77.051＊＊Nrf2P62LC3-Ⅱ

Fig.4 The expression of autophagy and oxidative stress markers detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測自噬、氧化應(yīng)激標志蛋白的表達

3 討論

3.1 以高脂飲食建立大鼠NAFLD模型 NAFLD是全球流行的慢性肝病，發(fā)病率逐年上升。文獻報道許多針對保肝護肝作用的研究多采用化學(xué)藥物誘導(dǎo)的方法造模，雖具有造模速度快、成本低的特點［8，11］，但與NAFLD 的發(fā)病機制并不吻合。本研究以高脂飲食喂養(yǎng)大鼠建立NAFLD模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)肥胖、脂質(zhì)代謝紊亂、肝臟功能損傷等現(xiàn)象，顯示造模成功。該模型更接近于因飲食攝入過多而引起的NAFLD表現(xiàn)，與人類的發(fā)病機制更為相似。

3.2 NAFLD的治療現(xiàn)狀 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對NAFLD的治療以改善生活方式為主，包括調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)，運動療法，給予胰島素增敏劑、降脂藥物及對癥治療等。目前尚無獲批的特異性藥物，臨床上用到的治療藥物普遍以改善代謝為主，包括二甲雙胍、噻唑烷二酮類、維生素E、人胰高血糖素樣肽-1 類似物，這些藥物存在不良反應(yīng)大、依從性差等缺點，效果不甚理想。而許多包括天然產(chǎn)物在內(nèi)的營養(yǎng)制劑也表現(xiàn)出抑制NAFLD發(fā)生和相關(guān)并發(fā)癥的作用［15-16］，且具有易于吸收、安全性高的優(yōu)點［17］，因此很多學(xué)者致力于從天然產(chǎn)物去探尋NAFLD的有效治療方法，故針對PLF 治療NAFLD 的藥效和機制研究十分必要。水林佳是水飛薊賓與磷脂酞膽堿的復(fù)合制劑，可顯著提高肝臟解毒功能，改善肝臟細胞水變性和脂肪變性，減少脂肪在肝臟內(nèi)的沉積和浸潤，從而減輕NAFLD的病理變化，因此選擇該藥作為本研究的陽性對照藥品［18］。

3.3 NAFLD 發(fā)病與氧化應(yīng)激和自噬有關(guān) NAFLD發(fā)病機制復(fù)雜，存在“二次打擊”、“三次打擊”和“多重打擊”多個學(xué)說，其病因涉及因素繁多，包括胰島素抵抗、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、細胞凋亡與自噬、腸道微生物等，在遺傳易感個體中，多個并行因素會產(chǎn)生協(xié)同作用，參與NAFLD的發(fā)生、發(fā)展。

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，傾向于氧化，導(dǎo)致中性粒細胞浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，是目前公認的NAFLD 發(fā)病機制之一。有研究表明，Nrf2 是細胞抗氧化應(yīng)激的中樞調(diào)節(jié)者，正常情況下，1分子Nrf2和2 分子Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）以非共價鍵的形式結(jié)合成二聚體存在于細胞漿中，當受到外界氧化應(yīng)激因子刺激后，二者解離，Nrf2發(fā)生核異位，然后通過與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)元件相互作用，誘導(dǎo)編碼抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達，如γ 谷氨酸合成酶、血紅素氧合酶1等，產(chǎn)生相應(yīng)的自身防御反應(yīng)［19］。

自噬是一種高度保守的細胞內(nèi)降解過程，它通過選擇性降解來調(diào)節(jié)肝細胞脂質(zhì)的積累，在NAFLD過程中起保護作用［20］。抑制自噬會影響脂滴、受損的線粒體和有毒的蛋白質(zhì)聚集體的降解，加重NAFLD 的發(fā)展。自噬和Keap1/Nrf2 氧化應(yīng)激信號通路關(guān)系密切，兩者通過通路中的自噬受體蛋白P62 相關(guān)聯(lián)。P62 是一個多功能蛋白質(zhì)，自噬形成時，LC3-Ⅰ會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ，P62作為自噬反應(yīng)的底物參與自噬反應(yīng)；而P62還可與Keap1 結(jié)合，釋放Nrf2，激活下游基因表達，提高肝細胞抗氧化應(yīng)激能力。自噬和氧化應(yīng)激作為人體2 個主要細胞防御機制，是NAFLD 發(fā)病過程中非常重要的因素，也是改善NAFLD的潛在治療靶點。

3.4 PLF通過激活自噬與抗氧化應(yīng)激的協(xié)同作用改善NAFLD PLF 對高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD 大鼠的肝臟損傷具有明顯的保護作用，能夠有效降低血脂水平，作用效果與水林佳相近。在探討PLF 改善NAFLD的作用機制時發(fā)現(xiàn)，PLF可升高NAFLD大鼠肝臟組織中的SOD 水平、降低MDA 水平，有效降低大鼠體內(nèi)氧自由基濃度，改善大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)。為進一步探討PLF 的具體作用機制，本實驗中引入了自噬抑制劑3-MA，結(jié)果表明加入3-MA 后，PLF降低血脂和改善氧化應(yīng)激的作用均被削弱，提示PLF 可能是通過激活自噬調(diào)節(jié)作用來改善NAFLD癥狀。

Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組P62蛋白表達增加，LC3-Ⅱ蛋白表達降低，表明自噬反應(yīng)受到抑制，同時Nrf2蛋白表達降低，則表明與之關(guān)聯(lián)的Nrf2氧化應(yīng)激通路受到抑制。給予PLF干預(yù)后，Nrf2 和LC3-Ⅱ蛋白水平均升高，P62 水平下降，表明PLF可促進大鼠自噬反應(yīng)和抗氧化應(yīng)激。一方面，P62與Keap1結(jié)合增加，釋放的游離Nrf2增多，提高了抗氧化應(yīng)激能力；另一方面，LC3-Ⅱ升高，自噬作用增強，P62作為自噬底物與其他降解蛋白結(jié)合，在自噬溶酶體中降解，P62 水平下調(diào)。自噬抑制劑的加入不僅使自噬作用受到抑制，自噬標志性蛋白水平下降，而且使氧化應(yīng)激標志物Nrf2 蛋白水平也下調(diào)，抗氧化應(yīng)激作用降低，這又進一步驗證了PLF可通過自噬與抗氧化應(yīng)激的協(xié)同作用促進大鼠抗氧化能力，從而對肝臟起到保護作用。

綜上所述，本研究證實了PLF 對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝臟損傷具有保護作用，且可有效改善其脂質(zhì)代謝過程，其機制可能與激活自噬和抗氧化應(yīng)激的協(xié)同作用有關(guān)。這不僅為PLF 作為NAFLD的治療藥物進行開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，也為NAFLD 的臨床治療提供了新的實驗思路和研究途徑。