金絲桃苷對糖尿病足潰瘍大鼠炎癥反應(yīng)、創(chuàng)面愈合及AMPK/SIRT1信號(hào)通路的影響

雷慧，鮑亞玲△，鮑喜靜，馬君

糖尿病足潰瘍（DFU）與周圍神經(jīng)病變、血管疾病和足部感染有關(guān)［1］。糖尿病性潰瘍?nèi)庋拷M織中血管生成異常會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)供應(yīng)減少，延緩創(chuàng)面愈合［2］。炎癥是組織損傷和感染的保護(hù)性反應(yīng)，機(jī)體識(shí)別病原體后，巨噬細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)早期炎癥反應(yīng)，從而募集免疫細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，以產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）等。炎癥反應(yīng)可加重2型糖尿病患者傷口愈合期間的組織損傷，這種損傷的主要病理機(jī)制涉及炎性因子的相互作用和活性氧的產(chǎn)生［3］。因此，長時(shí)間的炎癥會(huì)導(dǎo)致傷口愈合延遲。金絲桃苷是一種類黃酮，具有抗炎、抗氧化、改善糖尿病腎病（DN）以及保護(hù)血管的作用［4］。研究表明，金絲桃苷能下調(diào)膿毒癥模型大鼠心肌細(xì)胞中的炎性因子水平，改善大鼠心肌損傷［5］。同時(shí)，金絲桃苷也可抑制DN大鼠腎組織炎癥反應(yīng)，改善糖脂代謝，從而減輕腎組織病理損傷［6］。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）信號(hào)通路參與能量代謝和炎癥反應(yīng)過程，在糖尿病中也有調(diào)控作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)，激活A(yù)MPK/SIRT1 信號(hào)通路可抑制糖尿病心肌病小鼠的炎癥和心肌細(xì)胞凋亡，從而減輕糖尿病心肌病癥狀［8］。由于金絲桃苷的抗炎活性，其對DFU也具有治療作用。本研究擬探討金絲桃苷對DFU模型大鼠創(chuàng)面愈合及AMPK/SIRT1 信號(hào)通路的影響，為DFU的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 大鼠（雌雄不限）60 只，7~8 周齡，體質(zhì)量235~256 g，購自江蘇瀚江生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2021-0004，大鼠均飼養(yǎng)于室溫22~26 ℃，相對濕度60%~70%，12 h光暗交替的飼養(yǎng)房中。本研究經(jīng)張家口學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：倫理審核2022-078）。

1.2 主要藥物、試劑及儀器 金絲桃苷（原料藥，純度≥99.5%）購自商丘美蘭生物工程有限公司；二甲雙胍片（0.25 g/片）購自深圳中聯(lián)制藥有限公司；高糖高脂飼料購自北京惠特比科技發(fā)展有限公司；鏈脲佐菌素（STZ）、IL-6、TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒、HE 染色試劑盒、PCR 試劑盒、蛋白裂解液均購自昆山遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA試劑盒、ECL發(fā)光液均購自西安淳風(fēng)生物科技有限公司；兔源AMPK、SIRT1、GAPDH一抗，羊抗兔二抗（批號(hào)分別為BK19402、BK01295、BK01856、BK11042）均購自南京標(biāo)科生物科技有限公司。小動(dòng)物血糖儀（型號(hào)Biosen C）、酶標(biāo)儀（型號(hào)K6600-A）、顯微鏡（型號(hào)SS-NEX）、熒光定量PCR 儀（型號(hào)CG-05）均購自上海奧陸生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)FluorChem E）購自杭州九洋生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DFU 建模及分組給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后構(gòu)建DFU大鼠模型［9］，方法如下：大鼠給予高糖高脂飼料（60%普通飼料、20%蔗糖、10%蛋黃粉、10%豬油）喂養(yǎng)4周后禁食不禁水12 h，一次性腹腔注射65 mg/kg STZ，繼續(xù)以高糖高脂飼料喂養(yǎng)1周，檢測大鼠空腹血糖（FBG），兩次FBG＞16.7 mmol/L視為糖尿病大鼠造模成功。隨后腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，消毒足背部，然后用印章在大鼠足背部標(biāo)記一個(gè)7 mm×3 mm 的矩形，剪除矩形范圍內(nèi)皮膚并深至筋膜，以制備DFU大鼠模型。48只大鼠造模成功，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組，金絲桃苷低、高劑量組，二甲雙胍組，每組12只。另取12 只大鼠作為對照組，以普通飼料（80%玉米、20%麥麩）喂養(yǎng)4周，然后一次性腹腔注射65 mg/kg生理鹽水，接著以相同方法制備一個(gè)7 mm×3 mm的矩形創(chuàng)面。

建模完成后，金絲桃苷低、高劑量組分別給予100、200 mg/kg 金絲桃苷灌胃給藥［10］（將金絲桃苷和生理鹽水混溶成質(zhì)量濃度分別為10 g/L、20 g/L的混懸液，以10 mL/kg 灌胃）；二甲雙胍組給予200 mg/kg 二甲雙胍灌胃給藥［11］（將二甲雙胍片和生理鹽水混溶成濃度為20 g/L 的混懸液，以10 mL/kg灌胃）；對照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水。各組給藥每日1次，連續(xù)4周。

1.3.2 FBG 水平測定 分別于大鼠給藥前后采集大鼠尾靜脈血1 mL，采用血糖儀檢測FBG水平。

1.3.3 血清TNF-α、IL-6水平測定 給藥結(jié)束后，麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血3 mL，4 ℃、5 600 r/min離心12 min，取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書操作方法檢測大鼠血清TNF-α、IL-6水平。

1.3.4 創(chuàng)面愈合率的測定 分別于給藥前和給藥后對大鼠傷口拍照，使用Image J 軟件測量傷口面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率，創(chuàng)面愈合率（%）=［1-（給藥后傷口面積/給藥前傷口面積）］×100%。

1.3.5 創(chuàng)面肉芽組織病理學(xué)觀察 收集大鼠創(chuàng)面肉芽組織，分為兩部分，一部分置于-80 ℃冰箱中保存；另一部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片（厚度4μm），HE染色，每張切片隨機(jī)讀取6個(gè)視野，顯微鏡下觀察大鼠創(chuàng)面肉芽組織病理學(xué)變化。

1.3.6 創(chuàng)面肉芽組織中AMPK、SIRT1 mRNA 表達(dá)檢測 取1.3.5中-80 ℃保存的大鼠創(chuàng)面肉芽組織，解凍，勻漿，Trizol試劑提取肉芽組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。熒光定量PCR（qPCR）法檢測大鼠肉芽組織中AMPK、SIRT1 mRNA 表達(dá)水平，內(nèi)參為GAPDH。引物由蘇州拓維生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。參照PCR 試劑盒說明書配置反應(yīng)體系及環(huán)境，AMPK、SIRT1 mRNA表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法分析計(jì)算。樣本重復(fù)3次。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.3.7 創(chuàng)面肉芽組織中AMPK、SIRT1 蛋白表達(dá)水平的測定 取1.3.5中大鼠創(chuàng)面肉芽組織，解凍，勻漿，裂解緩沖液中裂解，BCA試劑盒定量總蛋白。電泳分離每個(gè)樣品中等量的蛋白質(zhì)（30 μg）后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入兔源AMPK（1︰750）、SIRT1（1︰900）、GAPDH（1︰1 150）一抗，4 ℃下過夜；次日加入羊抗兔二抗（1︰2 100），室溫下孵育1 h，ECL 試劑顯影，Image J 軟件分析條帶灰度值。以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)水平。樣本重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG水平比較 給藥前，與對照組相比，模型組大鼠FBG水平升高（P＜0.05），模型組，金絲桃苷低、高劑量組，二甲雙胍組大鼠FBG水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥后，與對照組相比，模型組大鼠FBG 水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，金絲桃苷低、高劑量組大鼠FBG 水平依次降低（P＜0.05）；二甲雙胍組和金絲桃苷高劑量組FBG水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

Tab.2 Comparison of FBG levels of rats between five groups表2 各組大鼠給藥前后FBG水平比較（n=12，mmol/L，）

Tab.2 Comparison of FBG levels of rats between five groups表2 各組大鼠給藥前后FBG水平比較（n=12，mmol/L，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與金絲桃苷低劑量組比較，P＜0.05；表3—5同。

組別對照組模型組金絲桃苷低劑量組金絲桃苷高劑量組二甲雙胍組F給藥前5.03±0.71 22.35±4.19a 21.97±4.02a 22.58±3.98a 21.86±3.67a 55.700＊＊給藥后5.11±0.63 21.86±4.05a 15.97±3.11b 9.69±1.93bc 9.85±2.06bc 73.685＊＊

2.2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平比較 與對照組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6 水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，金絲桃苷低、高劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-6 水平依次降低（P＜0.05）；二甲雙胍組和金絲桃苷高劑量組TNF-α、IL-6 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

Tab.3 Comparison of serum levels of TNF-α and IL-6 between five groups表3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平比較（n=12，ng/L，）

Tab.3 Comparison of serum levels of TNF-α and IL-6 between five groups表3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平比較（n=12，ng/L，）

組別對照組模型組金絲桃苷低劑量組金絲桃苷高劑量組二甲雙胍組F TNF-α 12.24±1.55 25.46±2.68a 20.49±2.12b 15.27±2.04bc 15.42±1.97bc 73.833＊＊IL-6 15.59±1.24 35.64±3.36a 27.24±2.93b 19.88±2.05bc 20.03±2.31bc 120.640＊＊

2.3 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較 對照組、模型組、金絲桃苷低劑量組、金絲桃苷高劑量組、二甲雙胍組大鼠創(chuàng)面愈合率分別為37.49%±3.57%、12.65%±2.01%、21.58%±2.47%、29.25%±2.90%、29.35%±3.04%，5組大鼠創(chuàng)面愈合率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=130.081，P＜0.01）。與對照組相比，模型組大鼠創(chuàng)面愈合率降低（P＜0.05）；與模型組相比，金絲桃苷低、高劑量組創(chuàng)面愈合率依次升高（P＜0.05）；二甲雙胍組和金絲桃苷高劑量組創(chuàng)面愈合率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

Fig.1 Wound healing of rats in each group after administration圖1 各組大鼠給藥后傷口愈合情況

2.4 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織病理學(xué)變化 對照組大鼠創(chuàng)面肉芽組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，炎性細(xì)胞浸潤少；模型組大鼠創(chuàng)面肉芽組織成纖維細(xì)胞及毛細(xì)血管壞死嚴(yán)重，伴隨大量炎性細(xì)胞浸潤；金絲桃苷低、高劑量組創(chuàng)面肉芽組織上述病理學(xué)變化程度依次減輕；二甲雙胍組和金絲桃苷高劑量組創(chuàng)面肉芽組織病理學(xué)變化無明顯差異。見圖2。

Fig.2 Histopathological changes of wound granulation tissue of rats in each group(HE staining,×400)圖2 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織病理學(xué)變化情況（HE染色，×400）

2.5 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織中AMPK、SIRT1 mRNA表達(dá)水平比較 與對照組相比，模型組大鼠創(chuàng)面肉芽組織中AMPK、SIRT1 mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，金絲桃苷低、高劑量組大鼠創(chuàng)面肉芽組織中AMPK、SIRT1 mRNA表達(dá)水平依次升高（P＜0.05）；二甲雙胍組和金絲桃苷高劑量組兩因子表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

Tab.4 Comparison of mRNA expression levels of AMPK and SIRT1 in wound granulation tissue of rats between five groups表4 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織中AMPK、SIRT1 mRNA表達(dá)水平比較（n=12，）

Tab.4 Comparison of mRNA expression levels of AMPK and SIRT1 in wound granulation tissue of rats between five groups表4 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織中AMPK、SIRT1 mRNA表達(dá)水平比較（n=12，）

組別對照組模型組金絲桃苷低劑量組金絲桃苷高劑量組二甲雙胍組F AMPK mRNA 1.00±0.00 0.31±0.02a 0.52±0.04b 0.71±0.06bc 0.72±0.08bc 329.350＊＊SIRT1 mRNA 1.00±0.00 0.34±0.03a 0.55±0.06b 0.85±0.08bc 0.87±0.10bc 208.909＊＊

2.6 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織中AMPK、SIRT1 蛋白表達(dá)水平比較 與對照組相比，模型組大鼠創(chuàng)面肉芽組織中AMPK、SIRT1 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，金絲桃苷低、高劑量組創(chuàng)面肉芽組織中AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)水平依次升高（P＜0.05）；二甲雙胍組和金絲桃苷高劑量組創(chuàng)面肉芽組織中AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3、表5。

Fig.3 Western blot assay of AMPK and SIRT1 in wound granulation tissue of rats in each group圖3 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織中AMPK、SIRT1蛋白免疫印跡圖

Tab.5 Comparison of protein expression levels of AMPK and SIRT1 in wound granulation tissue of rats between five groups表5 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織中AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)水平比較（n=12，）

Tab.5 Comparison of protein expression levels of AMPK and SIRT1 in wound granulation tissue of rats between five groups表5 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織中AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)水平比較（n=12，）

組別對照組模型組金絲桃苷低劑量組金絲桃苷高劑量組二甲雙胍組F AMPK 0.95±0.15 0.18±0.03a 0.39±0.05b 0.72±0.09bc 0.75±0.09bc 135.349＊＊SIRT1 1.34±0.17 0.31±0.04a 0.57±0.07b 0.98±0.11bc 1.03±0.10bc 171.997＊＊

3 討論

3.1 DFU 模型大鼠創(chuàng)面肉芽組織病變情況 DFU是糖尿病具有破壞性的并發(fā)癥，也是中晚期糖尿病患者感染、潰瘍或深部組織破壞的常見病因［12］。部分DFU 患者需要進(jìn)行截肢手術(shù)，這極大地影響了患者的生活質(zhì)量［13］。因此尋求DFU 的治療藥物意義重大。在DFU 創(chuàng)面愈合的早期階段，炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞積聚，從而加速細(xì)菌和壞死組織的清除。在糖尿病患者中，傷口愈合的正常連續(xù)區(qū)域被破壞，傷口進(jìn)入以持續(xù)發(fā)炎為特征的慢性非愈合狀態(tài)。炎性細(xì)胞的大量繁殖會(huì)導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的持續(xù)產(chǎn)生，從而使組織基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)失控，并明顯限制肉芽組織的形成和成熟［14］。因此，如炎癥得到有效抑制，將促進(jìn)肉芽組織形成，有助于DFU 創(chuàng)面愈合。本研究發(fā)現(xiàn)DFU 模型大鼠創(chuàng)面肉芽組織成纖維細(xì)胞及毛細(xì)血管壞死嚴(yán)重，伴隨大量炎性細(xì)胞浸潤，F(xiàn)BG、血清中TNF-α、IL-6水平升高，創(chuàng)面愈合率降低。提示DFU 模型大鼠創(chuàng)面肉芽組織發(fā)生病變，愈合困難，同時(shí)伴隨高血糖和炎癥反應(yīng)。

3.2 金絲桃苷可加快DFU 模型大鼠創(chuàng)面愈合 金絲桃苷具有抗炎、抗氧化及神經(jīng)保護(hù)等藥用價(jià)值［15］。朱妍妍等［16］研究表明，金絲桃苷能通過激活Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）/核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）/血紅素加氧酶-1（HO-1）信號(hào)通路，減輕過氧化氫誘導(dǎo)的小鼠精母細(xì)胞氧化損傷。申玲君等［17］研究發(fā)現(xiàn)，金絲桃苷能通過下調(diào)miRNA-199a來抑制脂多糖誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金絲桃苷干預(yù)后的DFU 模型大鼠創(chuàng)面肉芽組織病變減輕，F(xiàn)BG、血清中TNF-α、IL-6 水平降低，創(chuàng)面愈合率升高。因此提示金絲桃苷能減輕DFU 模型大鼠血糖和炎癥反應(yīng)，加快創(chuàng)面愈合。

3.3 金絲桃苷可調(diào)控AMPK/SIRT1信號(hào)通路 AMPK/SIRT1 信號(hào)通路是與能量代謝密切相關(guān)的通路［18］。張?zhí)N等［19］研究表明，N-乙酰半胱氨酸能激活A(yù)MPK/SIRT1 信號(hào)通路，緩解氧化應(yīng)激和線粒體凋亡介導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。同時(shí)，AMPK/SIRT1 信號(hào)通路在糖尿病中也起著調(diào)控作用。Li 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯能通過激活A(yù)MPK/SIRT1信號(hào)通路，抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜增厚，阻止視網(wǎng)膜屏障的形成。Xue 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果皂苷ⅢE 通過激活A(yù)MPK/SIRT1 信號(hào)通路緩解高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激。本研究發(fā)現(xiàn)，DFU 大鼠創(chuàng)面肉芽組織中AMPK、SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平較正常大鼠降低，經(jīng)金絲桃苷處理后，AMPK、SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高；且金絲桃苷劑量越高，效果越明顯。結(jié)合上述研究結(jié)果，本研究認(rèn)為金絲桃苷對DFU 大鼠創(chuàng)面愈合的改善情況可能與激活A(yù)MPK/SIRT1信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，金絲桃苷能減輕DFU 大鼠炎癥反應(yīng)，加快創(chuàng)面愈合，這一作用可能是通過激活A(yù)MPK/SIRT1信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。然而金絲桃苷能否通過其他通路加速DFU大鼠創(chuàng)面愈合還有待深入研究。