依達(dá)拉奉右莰醇通過(guò)鐵死亡-脂質(zhì)過(guò)氧化通路對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制

毛權(quán)西，李作孝

腦出血是指非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血，具有致殘率和致死率高的特點(diǎn)，目前治療主要以減輕血腫以及抑制血腫周?chē)X組織水腫為主［1］，但治療效果較差。腦出血后血腫周?chē)X組織繼發(fā)病理生理?yè)p害是腦出血致殘、致死的重要因素。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡在腦出血后血腫周?chē)X組織繼發(fā)病理生理?yè)p害中具有重要作用［2］。其特征為鐵沉積、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）活性下降、活性氧（ROS）大量產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化［3］。依達(dá)拉奉具有清除氧自由基作用而用于腦梗死、腦出血治療，依達(dá)拉奉右莰醇具有清除氧自由基和抗炎雙重作用，用于治療缺血性腦卒中療效顯著［4］，但其用于腦出血的治療研究尚鮮見(jiàn)。本研究應(yīng)用依達(dá)拉奉右莰醇干預(yù)腦出血?jiǎng)游锬Ｐ?，檢測(cè)腦出血大鼠氧化應(yīng)激、炎性免疫、鐵死亡、脂質(zhì)過(guò)氧化等指標(biāo)變化，探討其對(duì)腦出血的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 128 只SPF 級(jí)成年健康雄性SD 大鼠，6~9周齡，體質(zhì)量250~300 g，購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2018-17。大鼠以常規(guī)條狀顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，定時(shí)清理鼠籠，更換墊料，保持動(dòng)物房清潔衛(wèi)生。實(shí)驗(yàn)及操作符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求（倫理編號(hào)：2021-0601-1）。

1.1.2 主要試劑與儀器 依達(dá)拉奉注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字H20031342）、依達(dá)拉奉右莰醇注射用濃溶液（國(guó)藥準(zhǔn)字H20200007）購(gòu)自南京先聲藥業(yè)有限公司；膠原酶Ⅶ購(gòu)自Sigma 公司。GPX4 抗體、長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A 合成酶4（ACSL4）抗體、磷脂膽堿?；D(zhuǎn)移酶3（LPCAT3）抗體、抗GAPDH抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；ROS 試劑盒、總谷胱甘肽（T-GSH）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。大腦立體定位儀（型號(hào)：464601，RWD 公司），微板法酶標(biāo)儀（型號(hào)：DR-200Bs，Diatek公司），倒置顯微鏡（型號(hào)：CX33，OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法將128只大鼠分為假手術(shù)組、腦出血組、依達(dá)拉奉組和依達(dá)拉奉右莰醇組，每組32只。各組分別設(shè)術(shù)后1、3、7和14 d各4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分配8只大鼠。除假手術(shù)組外，其余組大鼠構(gòu)建急性腦出血模型。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周，術(shù)前大鼠禁食禁水8 h，天平稱(chēng)質(zhì)量后，使用10%水合氯醛（腹腔注射，300 mg/kg）進(jìn)行麻醉。麻醉大鼠常規(guī)消毒、備皮后將其置于立體定位儀，并于大鼠頂部行正中切口，充分暴露頭骨，定位右側(cè)尾狀核，以前囟為原點(diǎn)，右側(cè)旁開(kāi)3.0 mm，向前0.5 mm將顱骨鉆直徑為1 mm的孔。接下來(lái)對(duì)立體定向儀做調(diào)整，將0.1 U膠原酶Ⅶ沿鉆孔進(jìn)針至顱骨下5.5 mm 處的尾殼核緩慢注射，于5 min 內(nèi)緩慢注入，注射完畢后針頭保持原位10 min 防止回流；緩慢退出針頭后用醫(yī)用骨蠟封閉骨孔，無(wú)出血后消毒并縫合皮膚持續(xù)飼養(yǎng)，并對(duì)大鼠進(jìn)行標(biāo)記［5］。假手術(shù)組進(jìn)行相同手術(shù)操作，經(jīng)顱骨鉆孔后注入等體積生理鹽水。術(shù)后死亡大鼠被剔除，并及時(shí)補(bǔ)足相應(yīng)數(shù)量的大鼠。造模2 h后，依達(dá)拉奉組腹腔注射依達(dá)拉奉6 mg/kg，每12 h注射1次。依達(dá)拉奉右莰醇組腹腔注射依達(dá)拉奉右莰醇7.5 mg/kg，每12 h注射1 次，假手術(shù)組和腦出血組腹腔注射等量生理鹽水。造模后各組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽取8 只大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，3 只麻醉后用4%組織固定液灌注固定，斷頭后取出完整腦組織置于組織固定液中，其余5只于各組預(yù)定時(shí)間點(diǎn)麻醉后將大鼠進(jìn)行常規(guī)灌注，斷頭后取出完整腦組織，迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。造模成功判斷?biāo)準(zhǔn)：造模后可見(jiàn)大鼠立即出現(xiàn)神經(jīng)功能異常表現(xiàn)，主要為左側(cè)肢體出現(xiàn)癱瘓，提起其尾巴時(shí)，可見(jiàn)左側(cè)前肢屈曲，右側(cè)前肢伸展正常；當(dāng)推大鼠時(shí)，其向左側(cè)旋轉(zhuǎn)爬行。

1.2.2 神經(jīng)功能評(píng)分 根據(jù)改良Garcia評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［6］對(duì)各實(shí)驗(yàn)組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。評(píng)估內(nèi)容：自主運(yùn)動(dòng)、體態(tài)對(duì)稱(chēng)性、前肢伸展運(yùn)動(dòng)、爬網(wǎng)能力、身體觸覺(jué)反射及胡須碰觸反應(yīng)6個(gè)項(xiàng)目，每項(xiàng)0~3分，總分18分，神經(jīng)功能評(píng)分越低，神經(jīng)損傷程度越重。

1.2.3 HE染色觀察血腫周?chē)X組織病理變化 將大鼠血腫周?chē)X組織標(biāo)本用4%多聚甲醛固定24 h 以上，然后用梯度乙醇脫水后石蠟包埋，將蠟塊切片（片厚4μm）后脫蠟，進(jìn)行HE 染色，脫水后封片，應(yīng)用400倍光學(xué)顯微鏡觀察腦組織病理變化。

1.2.4 化學(xué)熒光法檢測(cè)血腫周?chē)X組織ROS 含量 將各組大鼠腦組織從冰箱取出放在培養(yǎng)皿上，沿進(jìn)針點(diǎn)冠狀面切開(kāi)腦組織，用眼科剪沿血腫周?chē)鷧^(qū)域取腦組織，稱(chēng)取腦組織質(zhì)量，冰水浴條件下將腦組織機(jī)械勻漿，離心10 min 后取上清液，加入熒光探針，避光孵育后進(jìn)行熒光檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)具體步驟操作。

1.2.5 微量酶標(biāo)法檢測(cè)血腫周?chē)X組織GSH 含量 各組大鼠腦組織從冰箱取出后用眼科剪沿血腫周?chē)鷧^(qū)域取腦組織，采用微量酶標(biāo)法檢測(cè)GSH含量，按照測(cè)試盒說(shuō)明操作。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)血腫周?chē)X組織相關(guān)蛋白ACSL4、LPCAT3、GPX4 的表達(dá) 各組大鼠腦組織從冰箱中取出后，用眼科剪取大鼠血腫周?chē)X組織約10 mg，用預(yù)冷的PBS 緩沖液漂洗后，加入組織蛋白提取劑200μL（每1 mL蛋白提取劑：960 μL RIPA 總蛋白裂解液+10 μL PMSF+10 μL 蛋白酶抑制劑+10μL 磷酸酶抑制劑A+10μL 磷酸酶抑制劑B），冰浴徹底勻漿，4 ℃條件下以12 000 r/min 離心5 min 后取上清液，應(yīng)用BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜。將封閉液加入轉(zhuǎn)好的膜，1 h 后漂洗并加入一抗［兔源抗ASCL4 抗體（1∶3 000）、LPCAT3 抗體（1∶1 000）、GPX4 抗體（1∶1 000）、GAPDH抗體（1∶10 000）］，于4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育30 min，用ECL 化學(xué)發(fā)光顯影，AlphaEaseFC 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能變化 組內(nèi)比較：假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。腦出血組、依達(dá)拉奉組和依達(dá)拉奉右莰醇組神經(jīng)功能評(píng)分均在術(shù)后3 d 時(shí)最低，術(shù)后7 d、14 d 逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組間比較：術(shù)后各時(shí)點(diǎn)腦出血組神經(jīng)功能評(píng)分低于假手術(shù)組，依達(dá)拉奉組、依達(dá)拉奉右莰醇組神經(jīng)功能評(píng)分高于腦出血組，依達(dá)拉奉右莰醇組神經(jīng)功能評(píng)分高于依達(dá)拉奉組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1 Comparison of neurological function scores between the four groups of rats表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（分，）

＊P＜0.05；組間比較：a與假手術(shù)組比較，b與腦出血組比較，c與依達(dá)拉奉組比較，P＜0.05；組內(nèi)比較：A與1 d比較，B與3 d比較，C與7 d比較，P＜0.05；表2—4同。

組別假手術(shù)組腦出血組依達(dá)拉奉組依達(dá)拉奉右莰醇組F n8 8 8 8神經(jīng)功能評(píng)分1 d 17.75±0.46 11.88±1.13a 13.25±1.28b 14.25±0.89bc 55.514＊3 d 17.75±0.46 9.50±0.93aA 11.63±1.06bA 13.38±0.74bcA 142.848＊7 d 17.88±0.35 13.38±0.92aAB 14.75±1.04bAB 15.88±0.64bcAB 47.331＊14 d 18.00±0.00 14.75±0.89aABC 16.00±0.76bABC 17.50±0.53bcABC 42.507＊F 0.828 43.110＊25.950＊52.234＊

2.2 血腫周?chē)X組織病理變化 假手術(shù)組大鼠各時(shí)點(diǎn)腦組織未見(jiàn)明顯病理改變。腦出血組大鼠在術(shù)后1 d時(shí)血腫周?chē)X組織出現(xiàn)紅細(xì)胞浸潤(rùn)，少量炎性細(xì)胞聚集；術(shù)后3 d時(shí)血腫周?chē)X組織大量紅細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞排列不規(guī)則、疏松，細(xì)胞間隙變大，神經(jīng)細(xì)胞變性，大量炎性細(xì)胞聚集；術(shù)后7 d 時(shí)血腫周?chē)X組織紅細(xì)胞浸潤(rùn)減少，水腫減輕；術(shù)后14 d時(shí)腦組織病理改變較7 d 時(shí)進(jìn)一步減輕。依達(dá)拉奉組和依達(dá)拉奉右莰醇組各時(shí)點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞腫脹、變性壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較腦出血組減輕。依達(dá)拉奉右莰醇組病理?yè)p傷程度明顯輕于依達(dá)拉奉組。見(jiàn)圖1。

Fig.1 Histopathological changes of rat brain in each group(HE staining,×400)圖1 各組大鼠腦組織病理學(xué)變化（HE染色，×400）

2.3 各組大鼠血腫周?chē)X組織ROS 含量變化 組內(nèi)比較：假手術(shù)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血腫周?chē)X組織ROS 含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腦出血組、依達(dá)拉奉組和依達(dá)拉奉右莰醇組大鼠血腫周?chē)X組織ROS含量均在術(shù)后3 d 時(shí)最高，術(shù)后7 d、14 d 逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組間比較：術(shù)后各時(shí)點(diǎn)腦出血組大鼠血腫周?chē)X組織ROS含量高于假手術(shù)組，1 d 時(shí)依達(dá)拉奉組與腦出血組血腫周?chē)X組織ROS 含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各時(shí)間點(diǎn)依達(dá)拉奉組、依達(dá)拉奉右莰醇組血腫周?chē)X組織ROS 含量均低于腦出血組，依達(dá)拉奉右莰醇組血腫周?chē)X組織ROS含量低于依達(dá)拉奉組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

Tab.2 Changes of ROS content in brain tissue around hematoma of rats in each group表2 各組大鼠血腫周?chē)X組織ROS含量變化（n=5，RFU/mgprot，）

Tab.2 Changes of ROS content in brain tissue around hematoma of rats in each group表2 各組大鼠血腫周?chē)X組織ROS含量變化（n=5，RFU/mgprot，）

組別假手術(shù)組腦出血組依達(dá)拉奉組依達(dá)拉奉右莰醇組F ROS含量1 d 401.13±34.85 2 627.93±191.86a 2 575.42±232.30 2 378.65±193.52b 176.405＊3 d 419.31±12.77 4 843.82±248.58aA 4 208.64±151.22bA 2 850.56±271.71bcA 438.943＊7 d 469.35±50.88 4 259.69±252.67aAB 2 780.60±307.92bB 1 560.46±181.28bcAB 273.577＊14 d 423.93±40.35 2 301.21±162.10aABC 1 353.92±130.66bBC 648.05±29.06bcABC 311.623＊F 3.006 161.608＊145.064＊129.150＊

2.4 各組大鼠血腫周?chē)X組織GSH 含量變化 組內(nèi)比較：假手術(shù)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血腫周?chē)X組織GSH含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。腦出血組、依達(dá)拉奉組和依達(dá)拉奉右莰醇組大鼠血腫周?chē)X組織GSH含量均在術(shù)后3 d時(shí)最低，術(shù)后7 d、14 d逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組間比較：術(shù)后各時(shí)點(diǎn)腦出血組大鼠血腫周?chē)X組織GSH 含量低于假手術(shù)組，1 d 時(shí)依達(dá)拉奉組血腫周?chē)X組織GSH 含量與腦出血組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各時(shí)間點(diǎn)依達(dá)拉奉組、依達(dá)拉奉右莰醇組大鼠血腫周?chē)X組織GSH含量均高于腦出血組，依達(dá)拉奉右莰醇組大鼠血腫周?chē)X組織GSH 含量高于依達(dá)拉奉組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

Tab.3 Changes of GSH content in brain tissue around hematoma of rats in each group表3 各組大鼠血腫周?chē)X組織GSH含量變化（n=5，μmol/g，）

Tab.3 Changes of GSH content in brain tissue around hematoma of rats in each group表3 各組大鼠血腫周?chē)X組織GSH含量變化（n=5，μmol/g，）

組別假手術(shù)組腦出血組依達(dá)拉奉組依達(dá)拉奉右莰醇組F GSH含量1 d 15.44±1.19 5.54±0.60a 6.54±1.10 6.92±0.71b 121.032＊3 d 15.19±1.27 0.90±0.76aA 1.27±0.98A 2.95±1.04bcA 219.383＊7 d 15.16±1.18 2.14±0.86aAB 6.11±0.95bB 7.55±0.94bcB 152.153＊14 d 16.04±0.40 7.28±1.18aABC 9.8±0.79bABC 14.89±1.34bcABC 86.897＊F 0.725 56.782＊67.218＊116.679＊

2.5 各組大鼠血腫周?chē)X組織鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá) 組內(nèi)比較：假手術(shù)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血腫周?chē)X組織GPX4、LPCAT3、ACSL4表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。腦出血組、依達(dá)拉奉組和依達(dá)拉奉右莰醇組大鼠血腫周?chē)X組織GPX4 表達(dá)均在術(shù)后3 d時(shí)最低，術(shù)后7 d、14 d 逐漸升高；LPCAT3、ACSL4 表達(dá)均在術(shù)后3 d 時(shí)最高，術(shù)后7 d、14 d 逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組間比較：術(shù)后各時(shí)點(diǎn)腦出血組大鼠血腫周?chē)X組織GPX4表達(dá)低于假手術(shù)組，LPCAT3、ACSL4 表達(dá)高于假手術(shù)組（P＜0.05）；1 d時(shí)依達(dá)拉奉組血腫周?chē)X組織LPCAT3表達(dá)與腦出血組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各時(shí)間點(diǎn)依達(dá)拉奉組、依達(dá)拉奉右莰醇組血腫周?chē)X組織GPX4表達(dá)高于腦出血組，ACSL4、LPCAT3 表達(dá)低于腦出血組（P＜0.05）；依達(dá)拉奉右莰醇組血腫周?chē)X組織GPX4表達(dá)高于依達(dá)拉奉組，LPCAT3、ACSL4表達(dá)低于依達(dá)拉奉組（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表4。

Fig.2 Changes in expression of ferroptosis-related proteins in brain tissue around hematoma of rats in each group圖2 各組大鼠血腫周?chē)X組織鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化

Tab.4 Changes of ACSL4,LPCAT3 and GPX4 expression in brain tissue around hematoma of rats in each group表4 各組大鼠血腫周?chē)X組織ACSL4、LPCAT3和GPX4表達(dá)變化（n=5，）

Tab.4 Changes of ACSL4,LPCAT3 and GPX4 expression in brain tissue around hematoma of rats in each group表4 各組大鼠血腫周?chē)X組織ACSL4、LPCAT3和GPX4表達(dá)變化（n=5，）

組別假手術(shù)組腦出血組依達(dá)拉奉組依達(dá)拉奉右莰醇組F ACSL4 1 d 0.06±0.01 0.43±0.03a 0.38±0.04b 0.30±0.03bc 162.535＊3 d 0.06±0.01 0.72±0.03aA 0.65±0.04bA 0.49±0.05bcA 383.899＊7 d 0.06±0.01 0.59±0.02aAB 0.48±0.03bAB 0.19±0.04bcAB 451.068＊14 d 0.06±0.01 0.28±0.04aABC 0.18±0.03bABC 0.09±0.01bcABC 76.947＊F 0.000 209.196＊164.729＊125.193＊組別假手術(shù)組腦出血組依達(dá)拉奉組依達(dá)拉奉右莰醇組F LPCAT3 1 d 0.08±0.01 0.59±0.03a 0.55±0.06 0.41±0.03bc 191.531＊3 d 0.08±0.01 0.84±0.03aA 0.74±0.07bA 0.54±0.04bcA 338.113＊7 d 0.08±0.01 0.71±0.04aAB 0.57±0.03bB 0.24±0.04bcAB 366.208＊14 d 0.08±0.01 0.39±0.02aABC 0.27±0.03bABC 0.12±0.04bcABC 128.922＊F 0.000 194.560＊76.592＊120.285＊組別假手術(shù)組腦出血組依達(dá)拉奉組依達(dá)拉奉右莰醇組F GPX4 1 d 0.70±0.03 0.41±0.04a 0.49±0.04b 0.56±0.04bc 491.616＊3 d 0.70±0.03 0.15±0.04aA 0.27±0.03bA 0.35±0.03bcA 865.259＊7 d 0.70±0.03 0.25±0.03aAB 0.32±0.03bAB 0.49±0.06bcAB 749.863＊14 d 0.70±0.03 0.49±0.03aABC 0.58±0.02bABC 0.66±0.03bcABC 134.870＊F 0.000 84.135＊111.808＊50.498＊

3 討論

腦出血是腦卒中的一種亞型，腦出血后血腫周?chē)X組織可產(chǎn)生一系列繼發(fā)性損傷，包括自由基釋放，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、壞死、自噬及炎癥等［7］。Zille等［8］研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)鐵死亡相關(guān)特征，抑制細(xì)胞鐵死亡可改善腦出血后神經(jīng)元損傷。提示鐵死亡與腦出血后繼發(fā)性損傷密切相關(guān)。

鐵死亡是一種受調(diào)節(jié)的非凋亡細(xì)胞死亡方式。研究表明鐵死亡與腦梗死、阿爾茨海默病、帕金森病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)［9］。Bao 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡相關(guān)信號(hào)通路在腦出血后鐵沉積和神經(jīng)元死亡中起關(guān)鍵作用。腦出血后過(guò)量鐵離子可以通過(guò)芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，促進(jìn)不飽和脂肪酸在細(xì)胞膜上的氧化［11］。有研究發(fā)現(xiàn)，ACSL4和LPCAT3參與不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)化，在脂質(zhì)代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用［12-13］。下調(diào)ACSL4 和LPCAT3 表達(dá)可減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化作用底物的積累，抑制細(xì)胞鐵死亡［14］。GSH是合成GPX4的底物，是GPX4發(fā)揮抗氧化功能的輔助因子，也是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［15］。GPX4 可將磷脂氫過(guò)氧化物還原為無(wú)毒的脂醇，GPX4表達(dá)上調(diào)能減少脂質(zhì)氫過(guò)氧化物的積累，抑制ROS 的形成［16］。ROS 可導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡［17］。本研究結(jié)果顯示，腦出血大鼠血腫周?chē)X組織神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)不同程度受損，在1 d 時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)損傷，3 d 時(shí)最為嚴(yán)重；腦出血組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血腫周?chē)X組織ACSL4、LPCAT3蛋白表達(dá)水平升高，GSH 含量降低，GPX4 蛋白表達(dá)水平降低，ROS含量增高，提示腦出血大鼠血腫周?chē)X組織出現(xiàn)明顯脂質(zhì)代謝紊亂，脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)鐵死亡，表明鐵死亡參與腦出血后血腫周?chē)X組織繼發(fā)病理生理?yè)p害。

依達(dá)拉奉作為一種抗氧化劑和自由基清除劑，能透過(guò)血腦屏障抑制腦細(xì)胞膜的氧化［18］，上調(diào)GPX表達(dá)，抑制炎癥和氧化反應(yīng)，治療創(chuàng)傷性腦損傷的效果顯著［19］。研究顯示，依達(dá)拉奉在腦出血急性期可減少炎性因子釋放、清除自由基、減輕腦水腫［20］。Zhang 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉可減輕腦室內(nèi)出血引起的腦水腫和神經(jīng)功能損傷，其機(jī)制可能是依達(dá)拉奉減輕了鐵誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Homma等［22］研究發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉能有效清除自由基、減少脂質(zhì)過(guò)氧化物的沉積和ROS 的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞鐵死亡。右莰醇是一種具有抗炎作用的雙環(huán)單萜類(lèi)化合物，可輕松穿透血腦屏障，抑制細(xì)胞內(nèi)ROS 生成，并幫助其他藥物順利通過(guò)血腦屏障［23］。Wu等［24］研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦損傷中，依達(dá)拉奉和右莰醇兩種組分相互協(xié)同，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用優(yōu)于兩者單獨(dú)使用。在腦出血模型中，依達(dá)拉奉聯(lián)合右莰醇能減輕血腫周?chē)X水腫、維持血腦屏障完整性，其神經(jīng)功能保護(hù)作用優(yōu)于依達(dá)拉奉［25］。本研究結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉右莰醇可改善腦出血模型大鼠神經(jīng)功能障礙，減輕血腫周?chē)X組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及神經(jīng)細(xì)胞變形，在腦出血后3 d、7 d和14 d血腫周?chē)X組織LPCAT3、ACSL4 蛋白表達(dá)水平降低，GSH 含量和GPX4 蛋白表達(dá)水平升高，ROS 沉積減少，且依達(dá)拉奉右莰醇的干預(yù)效果優(yōu)于依達(dá)拉奉。其機(jī)制可能是依達(dá)拉奉聯(lián)合右莰醇抑制了ACSL4、LPCAT3蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)了GPX4的活性，同時(shí)增加了GSH的生成，抑制了ROS 的產(chǎn)生，降低了脂質(zhì)過(guò)氧化水平，抑制神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡，減輕了神經(jīng)細(xì)胞損傷。提示依達(dá)拉奉和依達(dá)拉奉右莰醇可通過(guò)調(diào)控脂質(zhì)代謝途徑抑制腦出血神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，且依達(dá)拉奉右莰醇作用優(yōu)于依達(dá)拉奉。

綜上所述，依達(dá)拉奉右莰醇對(duì)腦出血大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，其原因可能是通過(guò)調(diào)節(jié)腦出血大鼠神經(jīng)細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)，減少ROS 的產(chǎn)生，減少腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用。脂質(zhì)過(guò)氧化通路并非神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡的唯一因素，依達(dá)拉奉右莰醇還可能通過(guò)其他途徑抑制神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡而發(fā)揮腦保護(hù)作用，這還有待進(jìn)一步研究。