MiR-139-5p靶向RIPK1/RIPK3/MLKL信號(hào)通路對(duì)慢性腦低灌注大鼠認(rèn)知障礙的影響

史文倩，趙美英，黃捷，賀桂，汪桂青

慢性腦低灌注（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）是阿爾茨海默病、血管性癡呆等認(rèn)知障礙性疾病的病理基礎(chǔ)［1］。CCH 主要是由血容量不足、管腔狹窄等原因引起大腦長(zhǎng)期供血不足，造成腦缺血缺氧狀態(tài)，繼而出現(xiàn)持久或進(jìn)展性的認(rèn)知障礙［2-3］。微小RNA（miRNA）可通過(guò)調(diào)控靶基因來(lái)調(diào)節(jié)CCH 相關(guān)的病理過(guò)程［4-6］。miR-139-5p是一種在大腦中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的miRNA，在腦缺血/再灌注小鼠大腦和氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元損傷模型中下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可減輕神經(jīng)元損傷［7］。但miR-139-5p 在CCH 中的作用鮮有報(bào)道。受體相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIPK）1/RIPK3/混合系列蛋白激酶結(jié)構(gòu)域蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）信號(hào)通路與神經(jīng)細(xì)胞的程序性壞死相關(guān)［8］。RIPK1是一種由N 末端激酶結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域和C 末端死亡結(jié)構(gòu)域組成的蛋白質(zhì)，當(dāng)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）結(jié)合TNF 受體-1 形成信號(hào)復(fù)合物時(shí)，RIPK1 被募集并發(fā)生磷酸化，激活RIPK3和MLKL激酶，使神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死［9-10］。抑制RIPK1/RIPK3/MLKL 可減輕腦卒中大鼠神經(jīng)元的壞死樣凋亡，改善認(rèn)知功能［9］。本研究旨在探討miR-139-5p 靶向RIPK1/RIPK3/MLKL 信號(hào)通路對(duì)CCH 大鼠認(rèn)知障礙的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 60只SPF級(jí)雄性SD大鼠，6周齡，體質(zhì)量260~280 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0011。所有大鼠均飼養(yǎng)在SPF 級(jí)恒溫（22±1）℃、相對(duì)濕度50%~60%的通風(fēng)實(shí)驗(yàn)室中，維持12 h/12 h光照黑暗節(jié)律，分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)20220017），實(shí)驗(yàn)操作符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)要求。人胚胎腎細(xì)胞株HEK293購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器 miR-NC、miR-139-5p mimic 購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司；RIPK1抑制劑Nec-1、胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；戊巴比妥鈉購(gòu)自中國(guó)上海信裕生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、TNF-α、白細(xì)胞介素6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen 公司；兔源RIPK1、RIPK3、MLKL、突觸前膜和突觸后膜關(guān)鍵蛋白突觸素（synapsin，SYP）、突觸后密度蛋白95（postsynapticdensity protein 95，PSD95）、α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-SYN）一抗和山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。Morris水迷宮購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。

1.3 方法

1.3.1 大鼠CCH模型建立 采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取12只大鼠為假手術(shù)組（Sham 組），余48只大鼠建立CCH 模型。參照文獻(xiàn)［10］，永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈（two vessel occlusion，2VO）構(gòu)建大鼠CCH 模型。術(shù)前所有大鼠禁食12 h，禁水4 h。采用3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠。將麻醉后大鼠仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，頸前皮膚去毛，消毒后于頸部正中行1 cm切口，分離雙側(cè)頸動(dòng)脈，結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈，30 min后結(jié)扎對(duì)側(cè)頸總動(dòng)脈，注意保持大鼠體溫恒定?？p合皮膚，消毒，等待大鼠蘇醒。

1.3.2 動(dòng)物分組與給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法將造模大鼠分為模型組（Model 組）、miR-NC 組、miR-139-5p mimic 組、miR-139-5p mimic+RIPK1 抑制劑Nec-1 組（miR-139-5p mimic+Nec-1 組），每組12 只。造模成功第2 天，miR-NC 組大鼠于側(cè)腦室注射miR-NC（0.8 nmol miR-NC 溶于4μL PBS中［7］），miR-139-5p mimic 組大鼠于側(cè)腦室注射同劑量的miR-139-5p mimic，miR-139-5p mimic+Nec-1組大鼠于側(cè)腦室注射同劑量的miR-139-5p mimic 和Nec-1（10 μmol/L Nec-1 10μL［11］）。側(cè)腦室注射方法：麻醉大鼠后固定，沿中線進(jìn)行頭皮切口，并在顱骨右側(cè)鉆一個(gè)毛刺孔，使用微量注射器分別將上述試劑注射到右側(cè)腦室中。注射5 min后再取出針頭，用骨蠟密封毛刺孔，待大鼠蘇醒。Sham組只行開關(guān)頸部的操作，不結(jié)扎頸總動(dòng)脈，與Model組側(cè)腦室注射等量的生理鹽水。

1.3.3 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn) 造模4周后，準(zhǔn)備一個(gè)無(wú)蓋的白色塑料盒，以及顏色、大小、形狀均不相同的兩套物體。首先對(duì)各組大鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。在盒子一側(cè)2個(gè)角落放置完全相同的2個(gè)物體，把大鼠面向?qū)?cè)盒壁放入盒子中，使其在盒子中自由活動(dòng)15 min，每放入1只大鼠前對(duì)盒內(nèi)進(jìn)行乙醇消毒，消除盒子氣味。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持參照物不移動(dòng)，且環(huán)境安靜。次日進(jìn)行物體再認(rèn)實(shí)驗(yàn)。將第1天放入的其中一個(gè)物體更換為顏色、大小、形狀均不同的新物體，按相同的方法放入大鼠，分別記錄5 min內(nèi)大鼠對(duì)新物體和舊物體的探索時(shí)間。計(jì)算分辨系數(shù)，分辨系數(shù)=（探索新物體時(shí)間-探索舊物體時(shí)間）/探索總時(shí)間。

1.3.4 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)后，進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)：每日于東、南、西、北4個(gè)定點(diǎn)放入大鼠，使大鼠頭朝向水池壁放入水中。記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間，并使其在平臺(tái)上停留15 s，如果60 s內(nèi)未成功找到平臺(tái)，則引導(dǎo)大鼠找到平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)期間保持環(huán)境安靜且參照物不變。重復(fù)5 d，記錄大鼠找到平臺(tái)所用的時(shí)間，即逃逸潛伏期?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：在第6天撤去平臺(tái)，于原平臺(tái)位置的對(duì)側(cè)象限面向水池壁放入大鼠，記錄60 s內(nèi)大鼠在平臺(tái)所在象限活動(dòng)的時(shí)間。

1.3.5 ELISA 檢測(cè)大鼠海馬組織GSH-Px、SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平 水迷宮實(shí)驗(yàn)后，脫頸處死所有大鼠，斷頭取腦，分離海馬組織，放入液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。根據(jù)GSH-Px、SOD、MDA、TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)海馬組織GSH-Px、SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法檢測(cè)大鼠海馬組織miR-139-5p 及RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA 表達(dá)水平 取凍存的海馬組織，根據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明書，提取大鼠海馬組織總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以U6、β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系（20 μL）：10 μL SYBR?Premix Ex Taq（2×）、0.8μL PCR正向引物（10μmol/L）、0.8μL PCR 反向引物（10μmol/L）、2μL cDNA（200μg/L）和6.4μL無(wú)菌水。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，循環(huán)40次。引物序列見表1，引物由中國(guó)上海GenePharma構(gòu)建合成。應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-139-5p 及RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

Tab.1 Primer design sequence表1 引物設(shè)計(jì)序列

1.3.7 Western blot 檢測(cè)大鼠海馬組織RIPK1、RIPK3、MLKL、SYP、PSD95、α-SYN 的表達(dá) 取凍存的大鼠海馬組織，加入RIPA 蛋白裂解液提取組織總蛋白。經(jīng)BCA 蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)PVDF 膜，清洗并用脫脂奶粉封閉。用兔源RIPK1（1∶500）、RIPK3（1∶1 000）、MLKL（1∶1 000）、SYP（1∶1 000）、PSD95（1∶1 000）、α-SYN（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗于4 ℃下孵育過(guò)夜。次日復(fù)溫洗膜后，加入山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，加入ECL 試劑進(jìn)行顯影，利用Image Lab 軟件對(duì)目標(biāo)蛋白的灰度值進(jìn)行計(jì)算分析。

1.3.8 雙螢光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶向關(guān)系 使用TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行miR-139-5p 和RIPK1 之間的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)。由上海GenePharma 公司構(gòu)建RIPK1 野生型質(zhì)粒（RIPK1-WT）和突變型質(zhì)粒（RIPK1-MUT），將HEK293 細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種在24 孔板中。用Lipofectamine2000 將RIPK1-WT 和RIPK1-MUT 分別與miR-NC 或miR-139-5p mimic共轉(zhuǎn)染于HEK293細(xì)胞中。48 h后，應(yīng)用熒光測(cè)定儀檢測(cè)螢光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism7.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠新物體識(shí)別能力比較 Sham 組、Model 組、miR-NC 組、miR-139-5p mimic 組和miR-139-5p mimic+Nec-1 組分辨系數(shù)分別為0.42±0.06、0.16±0.02、0.15±0.01、0.24±0.04和0.38±0.06，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=12，F(xiàn)=100.000，P＜0.01）。與Sham 組相比，Model 組大鼠分辨系數(shù)降低（P＜0.05）；與Model 組、miR-NC 組相比，miR-139-5p mimic組大鼠分辨系數(shù)升高（P＜0.05）；與miR-139-5p mimic 組相比，miR-139-5p mimic+Nec-1 組大鼠分辨系數(shù)升高（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較 與Sham 組相比，Model 組大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)（P＜0.05）；與Model 組、miR-NC 組相比，miR-139-5p mimic 組大鼠逃避潛伏期縮短（P＜0.05）；與miR-139-5p mimic 組相比，miR-139-5p mimic+Nec-1 組大鼠逃避潛伏期縮短（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of escape latency in Morris water maze positioning navigation experiment between the five groups of rats表2 各組大鼠Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較（n=12，s，）

Tab.2 Comparison of escape latency in Morris water maze positioning navigation experiment between the five groups of rats表2 各組大鼠Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較（n=12，s，）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與Model組比較，c與miR-NC組比較，d與miR-139-5p mimic組比較，P＜0.05；表3—5同。

組別Sham組Model組miR-NC組miR-139-5p mimic組miR-139-5p mimic+Nec-1組F 1 d 30.28±3.75 53.65±5.02a 53.23±4.86 42.36±3.25bc 33.55±2.38d 88.897＊＊2 d 26.62±3.37 50.40±4.16a 50.06±4.22 37.14±3.54bc 28.10±1.95d 125.718＊＊3 d 24.39±2.72 48.45±4.21a 48.64±4.26 33.71±2.92bc 25.55±1.67d 154.959＊＊4 d 20.38±2.30 45.32±3.85a 45.53±4.08 29.42±2.39bc 22.83±1.23d 199.106＊＊5 d 16.60±1.87 41.06±3.77a 41.65±3.51 25.37±2.14bc 18.62±1.15d 241.944＊＊

2.3 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)象限停留時(shí)間比較 Sham 組、Model 組、miR-NC 組、miR-139-5p mimic組和miR-139-5p mimic+Nec-1組目標(biāo)象限停留時(shí)間（s）分別為27.87±2.37、10.48±1.25、9.89±1.04、18.28±2.20 和25.44±3.42，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=12，F(xiàn)=165.987，P＜0.01）。與Sham 組相比，Model 組大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間縮短（P＜0.05）；與Model 組、miR-NC 組相比，miR-139-5p mimic 組大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.05）；與miR-139-5p mimic 組相比，miR-139-5p mimic+Nec-1 組大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠海馬組織GSH-Px、SOD、MDA、TNF-α、IL-6 水平比較 見表3。與Sham 組相比，Model組大鼠GSH-Px、SOD 水平降低，MDA、TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05）；與Model 組、miR-NC 組相比，miR-139-5p mimic 組大鼠GSH-Px、SOD 水平升高，MDA、TNF-α、IL-6 水平降低（P＜0.05）；與miR-139-5p mimic 組相比，miR-139-5p mimic+Nec-1 組大鼠GSH-Px、SOD 水平升高，MDA、TNF-α、IL-6 水平降低（P＜0.05）。

Tab.3 Comparison of GSH-Px,SOD,MDA,TNF-α and IL-6 levels in hippocampus between the five groups of rats表3 各組大鼠海馬組織GSH-Px、SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平比較（n=6，）

Tab.3 Comparison of GSH-Px,SOD,MDA,TNF-α and IL-6 levels in hippocampus between the five groups of rats表3 各組大鼠海馬組織GSH-Px、SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平比較（n=6，）

組別Sham組Model組miR-NC組miR-139-5p mimic組miR-139-5p mimic+Nec-1組F GSH-Px/（kU/g）28.04±3.36 8.67±0.95a 8.96±0.78 16.83±1.22bc 27.74±2.30d 140.124＊＊SOD/（kU/g）50.47±2.63 12.24±0.88a 11.82±0.95 26.41±2.38bc 43.10±3.59d 343.236＊＊MDA/（mmol/g）0.78±0.08 3.24±0.25a 3.12±0.21 1.18±0.09bc 0.80±0.03d 383.479＊＊TNF-α/（ng/L）95.15±9.24 316.42±26.32a 309.48±27.26 248.37±25.40bc 176.45±16.34d 108.404＊＊IL-6/（ng/L）12.53±1.14 58.63±6.05a 57.03±5.76 30.28±2.51bc 16.49±1.73d 178.559＊＊

2.5 各組大鼠miR-139-5p、RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA 水平比較 與Sham 組相比，Model 組大鼠miR-139-5p 水平降低，RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA水平升高（P＜0.05）；與Model 組、miR-NC 組相比，miR-139-5p mimic 組大鼠miR-139-5p 水平升高，RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA水平降低（P＜0.05）；與miR-139-5p mimic 組相比，miR-139-5p mimic+Nec-1組大鼠miR-139-5p水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA 水平降低（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Comparison of miR-139-5p,RIPK1,RIPK3 and MLKL mRNA levels between the five groups of rats表4 各組大鼠miR-139-5p及RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA水平比較（n=6，）

Tab.4 Comparison of miR-139-5p,RIPK1,RIPK3 and MLKL mRNA levels between the five groups of rats表4 各組大鼠miR-139-5p及RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA水平比較（n=6，）

組別Sham組Model組miR-NC組miR-139-5p mimic組miR-139-5p mimic+Nec-1組F miR-139-5p 1.00±0.00 0.31±0.03a 0.30±0.03 0.66±0.08bc RIPK1 1.00±0.00 2.24±0.20a 2.20±0.21 1.64±0.13bc RIPK3 1.00±0.00 1.97±0.18a 1.95±0.19 1.58±0.09bc MLKL 1.00±0.00 2.16±0.20a 2.12±0.21 1.65±0.10bc 0.89±0.091.15±0.06d 1.23±0.03d 1.28±0.04d 191.724＊＊94.870＊＊71.818＊＊81.511＊＊

2.6 各組大鼠RIPK1/RIPK3/MLKL信號(hào)通路相關(guān)蛋白與SYP、PSD95、α-SYN 蛋白表達(dá)比較 與Sham組相比，Model 組大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL、α-SYN蛋白表達(dá)升高，SYP、PSD95蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與Model 組、miR-NC 組相比，miR-139-5p mimic 組大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL、α-SYN 蛋白表達(dá)水平降低，SYP、PSD95 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與miR-139-5p mimic 組相比，miR-139-5p mimic+Nec-1 組大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL、α-SYN蛋白表達(dá)水平降低，SYP、PSD95 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），見表5、圖1。

Fig.1 The expression of related proteins detected by Western blot assay圖1 Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

Tab.5 Comparison of RIPK1/RIPK3/MLKL signaling path-related proteins and SYP,PSD95 and α-SYN protein expression levels between the five groups of rats表5 各組大鼠RIPK1/RIPK3/MLKL信號(hào)通路相關(guān)蛋白與SYP、PSD95、α-SYN蛋白表達(dá)比較 （n=6，）

Tab.5 Comparison of RIPK1/RIPK3/MLKL signaling path-related proteins and SYP,PSD95 and α-SYN protein expression levels between the five groups of rats表5 各組大鼠RIPK1/RIPK3/MLKL信號(hào)通路相關(guān)蛋白與SYP、PSD95、α-SYN蛋白表達(dá)比較 （n=6，）

組別Sham組Model組miR-NC組miR-139-5p mimic組miR-139-5p mimic+Nec-1組F RIPK1 0.21±0.02 0.86±0.08a 0.83±0.08 0.55±0.03bc 0.38±0.02d 164.338＊＊RIPK3 0.24±0.02 0.90±0.09a 0.92±0.08 0.41±0.04bc 0.29±0.02d 196.456＊＊MLKL 0.17±0.02 0.81±0.08a 0.79±0.08 0.48±0.03bc 0.23±0.01d 191.366＊＊SYP 0.87±0.08 0.23±0.02a 0.21±0.02 0.56±0.05bc 0.75±0.08d 166.360＊＊PSD95 0.82±0.08 0.19±0.02a 0.18±0.02 0.42±0.06bc 0.80±0.08d 188.145＊＊α-SYN 0.15±0.02 0.76±0.07a 0.77±0.07 0.38±0.03bc 0.20±0.02d 232.096＊＊

2.7 雙螢光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn) 預(yù)測(cè)得到的miR-139-5p 和RIPK1 之間的結(jié)合位點(diǎn)見圖2。與RIPK1-WT 共轉(zhuǎn)染后，miR-139-5p mimic 組螢光素酶活性較miR-NC 組降低（0.28±0.03vs. 1.17±0.06，n=3，t=22.980，P＜0.05）；與RIPK1-MUT 共轉(zhuǎn)染后，miR-139-5p mimic 組與miR-NC 組螢光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.14±0.05vs. 1.10±0.09，n=3，t=0.673，P＞0.05）。

Fig.2 Binding sites of miR-139-5p and RIPK1圖2 miR-139-5p和RIPK1的結(jié)合位點(diǎn)

3 討論

CCH 可以導(dǎo)致神經(jīng)元變性和認(rèn)知障礙，CCH 后認(rèn)知障礙與沉默突觸增多、線粒體老化、α-SYN 表達(dá)增加有關(guān)［12-14］。SYP是位于突觸前膜囊泡內(nèi)的鈣結(jié)合膜蛋白，可將神經(jīng)元接受到的外界信號(hào)所產(chǎn)生的電信號(hào)轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號(hào)，突觸小泡移動(dòng)至突觸前膜，與其融合后釋放神經(jīng)遞質(zhì)，參與突觸的連接；而突觸連接是認(rèn)知功能的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)，突觸連接喪失或功能異常將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的認(rèn)知障礙［15］。因此，SYP 表達(dá)水平能有效反映突觸的結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)，與認(rèn)知功能密切相關(guān)［16］。PSD95 是突觸后膜的標(biāo)志性蛋白，能接受突觸信號(hào)并將其整合傳遞至突觸后細(xì)胞，同時(shí)作為一種神經(jīng)細(xì)胞骨架蛋白，在突觸功能活性和突觸信息傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用［17］。研究顯示，SYP 和PSD95 表達(dá)水平在認(rèn)知缺陷模型和CCH 大鼠中降低，上調(diào)SYP 和PSD95 表達(dá)可改善認(rèn)知功能［18-19］。α-SYN 大量存在于神經(jīng)細(xì)胞中，在突觸間信息傳遞、突觸可塑性等神經(jīng)功能中起到重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，α-SYN 的異常聚集會(huì)損害突觸，可以通過(guò)減少突觸蛋白表達(dá)、激活鈣調(diào)磷酸酶等機(jī)制影響突觸功能，并通過(guò)炎癥、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等機(jī)制介導(dǎo)神經(jīng)元死亡，導(dǎo)致神經(jīng)傳遞功能障礙，與認(rèn)知功能密切相關(guān)［20-21］。研究顯示，在大鼠的黑質(zhì)內(nèi)輸注α-SYN低聚物會(huì)誘發(fā)神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致認(rèn)知障礙［22］。本研究通過(guò)2VO法建立大鼠CCH模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Sham 組相比，Model 組大鼠分辨系數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間、GSH-Px、SOD水平、SYP、PSD95蛋白表達(dá)水平顯著下降，逃避潛伏期、MDA水平、α-SYN蛋白表達(dá)水平顯著上升，說(shuō)明大鼠CCH 模型建立成功。

miRNA 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，且作為多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［23］。Wang 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-139-5p 可以負(fù)調(diào)節(jié)c-Jun/NLRP3 炎癥小體信號(hào)傳導(dǎo)，對(duì)氧-葡萄糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Yao 等［7］研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rd 通過(guò)上調(diào)miR-139-5p 抑制FOXO1，隨后激活Nrf2 抗氧化途徑，減輕缺血性卒中。本研究中，與Model 組、miR-NC 組相比，miR-139-5p mimic 組大鼠miR-139-5p 水平、分辨系數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間、GSH-Px、SOD水平、SYP、PSD95蛋白表達(dá)上升，逃避潛伏期、海馬組織MDA水平、α-SYN蛋白表達(dá)下降，說(shuō)明上調(diào)miR-139-5p可能減輕CCH大鼠的認(rèn)知障礙。

RIPK1 的激活能夠啟動(dòng)細(xì)胞RIPK3/MLKL 依賴性壞死和細(xì)胞FADD/caspase-8依賴性凋亡［8］。研究發(fā)現(xiàn)，短暫性腦缺血可以顯著激活RIPK1激酶，進(jìn)而激活RIPK3 和MLKL 激酶，使神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死；而Nec-1 能夠通過(guò)抑制缺血性卒中后大鼠腦中RIPK1介導(dǎo)的RIPK3/MLKL 依賴性壞死性凋亡來(lái)防止缺血性神經(jīng)元死亡［8］，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，與Sham組相比，Model組大鼠海馬組織RIPK1、RIPK3、MLKL 的mRNA 和蛋白表達(dá)上升，說(shuō)明CCH 狀態(tài)下，RIPK1/RIPK3/MLKL 信號(hào)通路被激活。與Model 組、miR-NC 組相比，miR-139-5p mimic 組大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL 的mRNA 和蛋白表達(dá)下降，且雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-139-5p可靶向調(diào)節(jié)RIPK1表達(dá)，說(shuō)明上調(diào)miR-139-5p可能通過(guò)靶向抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信號(hào)通路減輕CCH大鼠的認(rèn)知障礙。為了驗(yàn)證此猜想，筆者用RIPK1 抑制劑Nec-1 來(lái)干預(yù)miR-139-5p mimic 組大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Nec-1促進(jìn)了上調(diào)miR-139-5p對(duì)CCH大鼠認(rèn)知功能的恢復(fù)。

綜上所述，上調(diào)miR-139-5p可能通過(guò)靶向抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信號(hào)通路減輕CCH大鼠的認(rèn)知障礙。然而，本研究還僅在體內(nèi)水平上進(jìn)行了探究，后續(xù)需在體外水平進(jìn)一步驗(yàn)證該靶點(diǎn)作用。