多組學分析射頻熱風聯(lián)合干燥對浙貝母代謝物的影響

朱 麟 凌建剛 趙 偉

（1寧波市農(nóng)業(yè)科學研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/國家蔬菜加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，浙江 寧波 315100；2江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

浙貝母（Fritillaria thunbergiiMiq.）系百合科、貝母屬中一種多年生草本植物，其鱗莖中富含貝母素甲、貝母素乙等數(shù)十種生物堿類功能成分，具有清熱潤肺、化痰止咳、抗炎抑菌、抗癌抗腫瘤等功效［1］，被列為“浙八味”之一，是潤肺止咳含片、止咳糖漿等眾多藥品、保健品的加工基料［2］。

干燥為浙貝母初加工的關(guān)鍵步驟，是其品質(zhì)形成的重要環(huán)節(jié)［3］。浙貝母的干燥方法主要有自然晾曬、熱風（hot air，HA）干燥等，存在效率不高、品質(zhì)下降快、品控難等問題［4］。為提升浙貝母干燥品質(zhì)，學界開展了諸多技術(shù)嘗試，如紫外烘曬［5］、真空冷凍干燥［6］、微波干燥［3］等，這些方法在提高干燥效率或提高干燥品質(zhì)等方面具有較好的效果，但仍難以滿足產(chǎn)業(yè)對既高效又高質(zhì)干燥方法的需求。射頻熱風聯(lián)合（radio frequency combined hot air，RF-HA）干燥是近年來新興的一種干燥方式，結(jié)合了射頻電磁波（3 kHz～300 MHz）加熱的快速和高穿透性，與熱風干燥聯(lián)合使用均勻性好、干燥效率高、干燥品質(zhì)好，且兼具殺菌、滅蟲等優(yōu)點，在糧食［7-8］、堅果［9-10］等農(nóng)產(chǎn)品干燥領(lǐng)域已有應用，但在浙貝母等中草藥干燥上的研究鮮見報道。

前期對于浙貝母干燥過程中的品質(zhì)變化研究，多集中在已知的營養(yǎng)素和功能物質(zhì)成分分析［11-12］，而對于其整體代謝物的研究較少。代謝組學分析主要依托高通量篩選技術(shù)，結(jié)合化學計量學的方法，可定量和定性分析生物體系內(nèi)大量小分子（相對分子質(zhì)量≤1 000）代謝物，是分析生物組分及生物間生理差異的重要手段［13-14］。但單一代謝組學存在局限性，如非靶向代謝組學雖可同時分析所有小分子代謝物，但只能獲得代謝物相對定量的結(jié)果；而靶向代謝靈敏度高，可以絕對定量，得到樣本中代謝物的濃度。因此，結(jié)合兩種或兩種以上組學的多組學研究在揭示生物體內(nèi)復雜生化方面的作用突出，受到學界廣泛關(guān)注［15］。

鑒于此，本研究以新鮮浙貝母和HA干燥浙貝母為對照，分別采用超高液相色譜-質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography mass spectrometry，UPLC-MS）和超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技術(shù)，結(jié)合非靶向和生物堿靶向兩種代謝組學，分析RFHA干燥對浙貝母品質(zhì)的影響，以期為浙貝母干燥工藝提升及RF-HA技術(shù)應用提供實踐參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮浙貝母（浙貝3號）于2022年5月采購于浙江省寧波市海曙區(qū)章水鎮(zhèn)；甲醇、乙腈（均為色譜純），美國Merck 公司；甲酸（色譜純）、2-氯-L-苯丙氨酸（98%），阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HGJL-5RFS 食品射頻加工裝備，合肥哈工金浪裝備科技有限公司；101-2S 恒溫鼓風干燥箱，上海力辰儀器科技有限公司；ExionLC? AD 超高效液相色譜儀、Applied Biosystems 4500 QTRAP 型串聯(lián)質(zhì)譜，美國SCIEX 公司；Vanquish U3000 液相色譜儀（使用Thermo Vanquish超高效液相系統(tǒng)）、Q-Exactive 120質(zhì)譜儀（配備Thermo Orbitrap Exploris 120 質(zhì)譜檢測器）、電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），美國賽默飛世爾科技公司；Scientz-100F 凍干機，寧波新芝生物科技股份有限公司；5305 真空濃縮儀，德國艾本德股份公司；MTV-100 多管漩渦混勻儀，杭州奧盛儀器有限公司；MB-96S 高通量組織研磨器，浙江美壁儀器有限公司；0.22 μm 聚四氟乙烯防水透氣濾膜，天津津騰實驗設(shè)備有限公司；SB-C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），美國Agilent 公司；ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），美國Waters公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗處理 將新鮮采收的浙貝母清洗后，陰干表面水分（約12 h），用切片機切成3 mm 厚的薄片，將其平鋪于淺邊鏤空塑料筐中（單層，每筐約1.0 kg），留少量新鮮對照樣品（Fresh）；之后將分裝好的浙貝母帶筐放入烘干設(shè)備中，分別采用HA 和RF-HA 干燥將樣品水分含量降至12.5%～13.0%，其中HA 干燥溫度為55 ℃，干燥時間7.5 h；射頻參數(shù)為：板極間距8 cm、功率6 kW、熱風溫度55 ℃，干燥時間4.8 h。將3 組樣品立即用液氮凍樣，貯藏于-80 ℃冰箱速凍，待測。

1.3.2 檢測樣品前處理 從-80 ℃冰箱取出試驗樣品，采用凍干機真空冷凍干燥（冷阱溫度-50 ℃，64 h）；再利用研磨儀研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀；稱取50 mg 樣本粉末，加入1 200 μL 在-20 ℃條件下預冷的70%甲醇水內(nèi)標提取液，每30 min 渦旋1 次，每次持續(xù)30 s，共渦旋6 次；離心（12 000 r·min-1，3 min）后，吸取上清液，經(jīng)微孔濾膜過濾后，保存于進樣瓶中，備用。

1.3.3 色譜、質(zhì)譜采集條件

1.3.3.1 非靶代謝分析條件 液相條件：使用T3 色譜柱，進樣量2 μL，0.25 mL·min-1流速，40 ℃柱溫；乙腈（添加0.1%甲酸）為A 相，超純水（添加0.1%甲酸）為B相；洗脫梯度：B相比例，0 min為2%，9 min內(nèi)線性增加到50%，12 min 內(nèi)線性增加到98%，并維持1.5 min；在13.5～14 min，降低至2%，并平衡至20 min。

質(zhì)譜條件：ESI 正、負離子噴霧電壓分別為3.50、-2.50 kV，鞘氣壓力30 arb，輔助壓力10 arb，毛細管溫度325 ℃；一級全掃描分辨率60 000，一級離子掃描范圍質(zhì)荷比（m/z）100～1 000，二級分辨率15 000。

1.3.3.2 生物堿靶向代謝分析采集條件 液相條件：使用SB-C18 色譜柱，流速0.35 mL·min-1，柱溫40 ℃，進樣量4 μL；超純水（加入0.1%的甲酸）為A 相，乙腈（加入0.1%的甲酸）為B相；洗脫梯度：B相比例，0 min為5%，9.00 min 內(nèi)線性增加到95%，并維持1 min，10.00～11.10 min線性降至5%，并平衡至14 min。

質(zhì)譜條件：參照羅利利等［13］的方法，其中ESI溫度550 ℃；離子噴霧正負電壓分別為5 500、-4 500 V；離子源氣體Ⅰ，氣體Ⅱ和氣簾氣分別設(shè)置為50、60和25 psi。

1.4 數(shù)據(jù)分析及處理

質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Analyst 1.6.3 軟件處理；數(shù)據(jù)歸一化（unit variance scaling，UV）處理、主成分分析（principal component analysis，PCA）以及正交-偏最小二乘判別分析（orthogonal projections to latent structures discriminant analysis，OPLS-DA）采用R 3.6.3 軟件的內(nèi)置prcomp 函數(shù)統(tǒng)計；聚類分析等熱圖通過R 軟件Complex Heatmap 包繪制；生物堿含量變化柱形圖采用Origin 2018軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCA及OPLS-DA分析結(jié)果

采用PCA 對3 種處理（Fresh、HA、RF-HA）浙貝母進行差異分析，結(jié)果見圖1。3組樣品在PCA 圖上的相對坐標點分離明顯、無交叉重疊，說明3 個處理組的代謝物間差異顯著（P＜0.05），且RF-HA 組相較于HA 組離Fresh 組更近，說明RF-HA 對浙貝母干燥代謝物成分的影響更小。

圖1 不同處理浙貝母樣本PCA模型得分Fig.1 PCA score plot of Fritillaria thunbergii Miq.with different treatments

OPLS-DA 是一種有監(jiān)督模型識別功能的分析方法［13］，通過對主成分（principal component，PC）適當旋轉(zhuǎn)，并去除不變量的影響，實現(xiàn)不同組間差異代謝物的篩選。圖2 為不同處理浙貝母的OPLS-DA 得分，進一步看出各處理樣品間分離程度大，差異顯著（P＜0.05）。對該模型進行樣本置換檢驗，R2Y=0.998，對模型預測能力Q2=0.95，且在置換檢驗圖（圖3）中，隨著置換保留度值的上升，R2和Q2值增加，回歸線呈上升趨勢，所有Q2點均低于R2點，Q2點的回歸線與縱坐標交叉點小于0，均說明置換檢驗過關(guān)，模型具有很好的穩(wěn)定性和預測性。

圖2 不同處理浙貝母樣本OPLS-DA模型得分Fig.2 OPLS-DA score plot of Fritillaria thunbergii Miq.with different treatments

2.2 差異代謝物分析結(jié)果

通過UPLC-MS 平臺對樣品的初生和次生代謝物進行鑒定。一共鑒定出483 種差異代謝物，主要包括氨基酸及其衍生物（61 種）、羧酸及其衍生物（83 種）、脂肪?；惢衔铮?1種）、有機氧及氮化合物（45種）、類固醇及其衍生物（20種）、核苷酸及其衍生物（19種）、黃酮及異黃酮類（15 種）以及生物堿、吡啶、吡咯啉、喹啉等類物質(zhì)。為更清楚地了解不同處理對浙貝母中代謝物變化規(guī)律的影響，依據(jù)各差異代謝物相對含量作差異代謝物層次聚類熱圖，結(jié)果見圖4。代謝物可以聚類為兩大簇，第一簇物質(zhì)在新鮮狀態(tài)時含量較高，在經(jīng)過兩種干燥處理時，其含量下降；第二簇物質(zhì)隨著干燥的進行含量上升；RF-HA 組和HA 組總體變化趨勢類似，但RF-HA 在第一簇物質(zhì)含量下降及第二簇物質(zhì)含量上升等方面的變化程度明顯弱于HA組。

圖4 不同處理浙貝母差異代謝物層次聚類熱圖Fig.4 Hierarchical clustering heat map of Fritillaria thunbergii Miq.with different treatments

根據(jù)統(tǒng)計檢驗計算P值，采用OPLS-DA 降維法計算變量投影重要度（variable importance in projection，VIP），計算組間差異倍數(shù)，衡量各代謝物組分含量對樣本分類判別的影響強度和解釋能力，輔助標志代謝物的篩選［16］。當P＜0.05和VIP＞1時，認為代謝物分子具有統(tǒng)計學意義。經(jīng)鑒定，各組處理浙貝母差異代謝物統(tǒng)計情況見圖5，其中RF-HA與Fresh總共差異代謝物為221種（105種上調(diào)，116種下調(diào)），F(xiàn)resh 與HA 總共差異代謝物為246 種（141 種上調(diào)，105 種下調(diào)），RF-HA 與HA總共差異代謝物為168種（122種上調(diào)，46種下調(diào)）。可見，RF-HA 與HA 處理間存在顯著代謝物差異，RFHA相對于HA，代謝物上調(diào)更多，相對更接近新鮮樣品。

圖5 不同處理浙貝母樣本差異代謝物統(tǒng)計Fig.5 Statistical chart of differential metabolites of Fritillaria thunbergii Miq.with different treatments

取RF-HA與HA組、Fresh與RF-HA組、Fresh與HA組以及Fresh、RF-HA、HA三組間的代謝差異物，繪制韋恩圖。由圖6 可知，不同處理間差異代謝物組成的相似性和重疊情況，其中有70個差異代謝物為三組處理共有，說明處理間代謝差異較大，與PCA分析結(jié)果一致。

圖6 不同處理浙貝母樣本差異代謝物韋恩圖Fig.6 Venn diagram of differential metabolites of Fritillaria thunbergii Miq.with different treatments

2.3 不同處理對浙貝母生物堿類成分的影響

浙貝母的主要活性成分是生物堿［1］。通過UPLCMS/MS平臺靶向代謝組技術(shù)對樣品生物堿類初生和次生代謝物進行鑒定，一共鑒定出64 種顯著差異代謝物（P＜0.05），其成分及不同處理對其MS 強度影響見表1?？梢钥闯?，RF-HA 和HA 兩種干燥方式對浙貝母生物堿成分均具有較大影響，其中貝母素甲、貝母素乙、貝母素辛等40類物質(zhì)含量下降，蕨內(nèi)酰胺、藜蘆堿等15 種物質(zhì)含量升高；RF-HA 和HA 處理之間也存在較大差異，RH-HA組總體上更接近Fresh組，表現(xiàn)為貝母素甲、貝母素乙、鄂貝啶堿、西貝母堿苷等多數(shù)物質(zhì)含量變化更小。

表1 不同處理對浙貝母生物堿類成分的影響Table 1 Effects of alkaloids changes of Fritillaria thunbergii Miq.with different treatments

圖7 為不同處理下浙貝母中貝母素甲、貝母素乙、貝母素甲氮氧化合物、貝母素乙氮氧化合物4種主要功能物質(zhì)［17］MS強度變化趨勢。4種生物堿含量在RF-HA和HA 干燥后均呈現(xiàn)降低趨勢，其值分別從1.10×106、3.57×106、1.71×106、8.83×106下降至8.41×105、1.80×106、1.23×106、4.52×106和6.01×105、1.48×106、9.65×105、2.65×106，相對于HA干燥，RF-HA處理可以顯著減少4種活性成分MS強度的下降（P＜0.05），使其相比于Fresh MS強度，降幅分別減少21.77、15.58、8.91、21.12個百分點，對于浙貝母品質(zhì)保持具有積極效果。

圖7 不同處理對浙貝母中代表性生物堿類物質(zhì)含量的影響Fig.7 Effects of different treatments on representative alkaloid content of Fritillaria thunbergii Miq.

3 討論

浙貝母等植物源類中草藥產(chǎn)品，采后貯藏易發(fā)生霉爛、蟲蛀及品質(zhì)劣變等，干燥是保持其商品性及藥效的重要環(huán)節(jié)，但傳統(tǒng)曬干、熱風干燥等方法普遍存在品質(zhì)下降、藥效損失嚴重等［18］問題。本研究采用射頻熱風聯(lián)合干燥處理浙貝母，并結(jié)合非靶和生物堿靶向代謝組學技術(shù)分析其代謝物的變化規(guī)律，結(jié)果表明，相對于HA，RF-HA干燥可以更好地減少代謝物變化，貝母素甲、貝母素乙、貝母素甲氮氧化合物、貝母素乙氮氧化合物等生物堿類活性物質(zhì)降低更少，對于其品質(zhì)保持具有積極效果，這與該聯(lián)合干燥技術(shù)在糧食［7-8］、堅果［9-10］、水產(chǎn)品［19］等農(nóng)產(chǎn)品干燥方面的積極效果相一致。其作用機制，可能是射頻主要依靠電磁波驅(qū)動物料中的帶電離子持續(xù)振蕩產(chǎn)生熱量［20］，熱量由內(nèi)到外擴散，縮短了熱傳導的過程，升溫迅速［21］，也加速水分向外擴散［22］，同時，射頻輔助熱風干燥可以克服射頻加熱不均勻等局限［23］，減少了干燥對物料品質(zhì)及代謝物的影響。

浙貝母中含有豐富的黃酮、皂苷、多糖等物質(zhì)成分［24］，但現(xiàn)有研究表明，其鎮(zhèn)咳祛痰、鎮(zhèn)痛抗菌、抗腫瘤等功效主要由生物堿類物質(zhì)決定［25］，《中華人民共和國藥典（一部）》［17］也規(guī)定，浙貝母品質(zhì)控制項目為貝母素甲和貝母素乙等生物堿類物質(zhì)成分含量。因此，本研究重點關(guān)注不同干燥處理下生物堿類物質(zhì)含量的變化趨勢。通過試驗共鑒定出64 種生物堿類差異代謝物，在不同干燥過程中，其含量變化趨勢不一，其中貝母素甲、貝母素乙等多數(shù)代謝物MS 強度呈現(xiàn)下降趨勢，與前期報道結(jié)論一致［26］；但也存在蕨內(nèi)酰胺、藜蘆堿等15 種物質(zhì)含量升高的情況，這可能是由不同生物堿間發(fā)生水解、氧化等反應導致的成分轉(zhuǎn)化所致［27］。

相對于HA，RF-HA 組生物堿類代謝物總體上更接近Fresh，但藜蘆定堿、貝母辛堿、黃金素A、葫蘆巴堿等成分卻呈現(xiàn)相反的變化趨勢，這可能是其自身結(jié)構(gòu)或?qū)τ谏漕l電磁波的反應機制不同造成的，因為射頻干燥存在非熱作用機制［28-29］，但該觀點存在爭議［30］，需要后續(xù)研究深入探索。

綜合來看，RF-HA干燥會使新鮮浙貝母52.49%的差異代謝物下調(diào)表達，低于HA 處理57.32%的下調(diào)比例，該比例與當歸［31］等藥材下調(diào)比例較接近。而李澤娜等［32］在與分析杜仲干燥代謝物變化時，發(fā)現(xiàn)相對于新鮮杜仲，超過80%的代謝物表達上調(diào)，說明不同中藥材成分不同，干燥過程中代謝物變化存在較大差異，這是由于干燥過程中各類生理物質(zhì)發(fā)生了酶水解、氧化、裂解［33］、次生代謝［34］等一系列復雜變化。因此，對于不同物料的干燥研究，要根據(jù)其自身特點制訂工藝。

4 結(jié)論

本研究通過非靶向代謝組學和生物堿靶向代謝組學聯(lián)合分析的方法，比較了RF-HA、HA 干燥對浙貝母代謝物及生物堿類物質(zhì)變化的影響。結(jié)果表明，相對于HA，RF-HA干燥可以顯著減少浙貝母干燥過程中的代謝物變化（P＜0.05），顯著減少貝母素甲、貝母素乙、貝母素甲氮氧化合物、貝母素乙氮氧化合物等活性成分含量下降（P＜0.05），可以更好地維持其特有品質(zhì)。