基于淫羊藿治療下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷藥物有效化學(xué)成分及其作用靶點的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)分析

王春玲, 吳思諾, 于曉艷, 張偉東

（吉林大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)系，吉林 長春 130021）

下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷是臨床常見癥候，與糖皮質(zhì)激素戒斷綜合征相似，主要表現(xiàn)為肢體功能減退、畏寒怕冷和精神不振等癥狀，嚴重者甚至可能引起生精功能障礙，導(dǎo)致不育和先天缺陷，影響數(shù)萬個家庭［1-3］。研究［4-8］顯示：下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷主要與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)（neuroendocrine immune system，NEIS）有關(guān)，特別是在慢性疾病（類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病和高血壓等）后期其發(fā)生率較高。中醫(yī)學(xué)理論中，下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷的基本病機以“腎陽虛衰”為主，其治療主要以補腎壯陽和祛風(fēng)除濕為關(guān)鍵。中醫(yī)藥在治療下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷方面具有較好的效果及經(jīng)驗，廣泛應(yīng)用于臨床治療。淫羊藿又名仙靈脾，是小檗科淫羊藿屬的多年生草本植物，主要有效成分為黃酮類物質(zhì)和多糖類化合物等［9-14］。研究［15-17］顯示：淫羊藿能有效減輕下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷大鼠的病情和改善多種原因引起的睪丸損傷及慢性腎功能衰竭大鼠腎間質(zhì)纖維化程度。研究［18-20］顯示：淫羊藿的補腎作用主要是通過調(diào)節(jié)激素受體活性或利用下丘腦促性腺激素釋放激素信號及促性腺激素釋放分泌等途徑實現(xiàn)的。目前淫羊藿藥材用于治療下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷的作用機制尚未明確，為了探討其作用機制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分子對接技術(shù)分析淫羊藿治療下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷的藥物有效化學(xué)成分及可能發(fā)生治療作用的靶點，為進一步研究淫羊藿治療下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 淫羊藿有效化學(xué)成分的檢索淫羊藿藥材的化學(xué)成分來自中藥系統(tǒng)藥理學(xué)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP） 數(shù)據(jù)庫和分析平臺（https：//tcmspw.com/tcmsp.php/） 中 保 留 類 藥 性（drug-likeness，DL）>0.18 的化學(xué)成分，在此基礎(chǔ)上篩選出口服利用度（oral bioadoption，OB） >30% 的化學(xué)成分，滿足此條件的大多數(shù)化合物可以到達細胞中的特定蛋白質(zhì)靶點；結(jié)合相關(guān)文獻，整理淫羊藿的有效化學(xué)成分和靶點蛋白的信息，并在Uniprot 蛋白數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中將淫羊藿有效成分的靶點名稱正式化，采用官方基因符號進行后續(xù)分析。

1.2 淫羊藿有效化學(xué)成分與下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷基因靶點相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)繪制將“1.1”中已收集藥材的成分和靶點信息與疾病進行聯(lián)系。 采用DisGenet 基因數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/），以下丘腦-垂體-性腺軸功能障礙 （dysfunction of hypothalamicpituitary-gonadal axis）、下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能障礙（dysfunction of hypothalamic-pituitary-thyroid axis） 和 下 丘 腦- 垂 體- 腎 上 腺 軸 功 能 障 礙（dysfunction of hypothalamic-pituitary-adrenal axis）作為關(guān)鍵詞檢索下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷相關(guān)的靶點基因，結(jié)合GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）中的信息進行補充。由于不同數(shù)據(jù)庫可能會檢索到相同的靶點基因，所以刪除重復(fù)的靶點基因，得到下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷相關(guān)靶點基因。收集淫羊藿中的有效化學(xué)成分與下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷相關(guān)的靶點基因的交集靶基因。采用Cytoscape 3.7.1 軟件，將藥材與疾病的交集靶基因和有效化學(xué)成分構(gòu)建藥物-有效化學(xué)成分-疾病-靶點相互作用的網(wǎng)絡(luò)并進行可視化。

1.3 蛋 白-蛋白相互作用（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的繪制在STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）中導(dǎo)入淫羊藿與下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷疾病的重疊靶基因，分析重疊靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape 3.7.1 軟件處理PPI 信息，得到主要靶點蛋白信息，優(yōu)化PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 淫羊藿治療下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷潛在靶點的基因本體（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析將“1.2”中得到的交集靶基因的Entrez ID 導(dǎo)入基迪奧生物信 息 云 平 臺 （OmicShare） （https：//www.omicshare.com/）進行GO 功能富集分析，研究淫羊藿治療下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷的生物學(xué)機制；進行KEGG 信號通路富集分析，得出淫羊藿治療下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷可能發(fā)揮作用的通路。

1.5 淫羊藿有效化學(xué)成分和治療靶點的分子對接采用分子對接技術(shù)預(yù)測淫羊藿中關(guān)鍵有效化學(xué)成分和可能發(fā)揮治療下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷作用的核心靶點的結(jié)合位點以及親和力。首先進行小分子配體文件的制備：將下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷的核心靶點蛋白的結(jié)構(gòu)在蛋白數(shù)據(jù)庫中提取出來，然后進行去水去配體等優(yōu)化后保存為PDBQT 格式。制備大分子化合物文件：在PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 中獲取用于分子對接研究的淫羊藿有效化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)，將其導(dǎo)入Chem Bio3D 軟件進行轉(zhuǎn)換，展示淫羊藿有效成分的3D 格式，保存為PDBQT 格式。通過Autodouk Tools 軟件進行對接，選擇對接結(jié)果穩(wěn)定的構(gòu)象進行可視化。

2 結(jié) 果

2.1 淫羊藿的有效化學(xué)成分以O(shè)B>30% 和DL>0.18 為條件，在TCMSP 中進行初步篩選，得到淫羊藿的有效化學(xué)成分23 個，為槲皮素（MOL000098）、山奈酚（MOL000422）、木樨草素（MOL000006）、大黃酚（MOL003044）、乙酸亞油脂（MOL001645）、谷甾醇（MOL000359）和木蘭花內(nèi)酯（MOL00062）等。將淫羊藿中含量豐富但未滿足篩選條件的脫水淫羊藿素（MOL004373）、寶藿苷（MOL004397）、淫羊藿次 苷Ⅰ （MOL004430） 和 淫 羊 藿 次 苷Ⅱ（MOL004431）添加至淫羊藿的有效化學(xué)成分中；采用Uniprot 數(shù)據(jù)庫將篩選出的靶點，轉(zhuǎn)換為正式基因名稱，最終確定淫羊藿有效化學(xué)成分27 個，靶點基因214 個。

2.2 淫羊藿有效化學(xué)成分與下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷基因靶點相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)將關(guān)鍵詞下丘腦- 垂體- 性腺軸功能障礙（dysfunction of hypothalamic-pituitary-gonadal axis）、下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能障礙（dysfunction of hypothalamic-pituitary-thyroid axis）、下丘腦-垂體-腎 上 腺 軸 功 能 障 礙 （dysfunction of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis）導(dǎo)入GeneCards數(shù)據(jù)庫和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫，共篩選出下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷的靶點基因465 個。將淫羊藿作用靶點與下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷作用靶點輸入至Venny2.1.0 數(shù) 據(jù) 平 臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）進行交集靶點的獲取，最終得到交集靶點基因62 個。見圖1。對62 個交集靶點進行分析，結(jié)果顯示：其中有10 個淫羊藿的有效化學(xué)成分與靶基因有關(guān)。采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建淫羊藿-淫羊藿有效化學(xué)成分-疾病-作用靶點的PPI 作網(wǎng)絡(luò)并進行可視化見圖2。圖2 中黃色三角形節(jié)點表示淫羊藿藥材；藍色圓形節(jié)點表示淫羊藿的有效化學(xué)成分，共10 個；紅色四邊形節(jié)點表示疾病，紅色圓形節(jié)點表示引起疾病的靶腺軸；綠色方形表示靶點蛋白，共62 個；黑色線條表示PPI 關(guān)系；根據(jù)Cytoscape 3.7.1 軟件計算度值，度值排名靠前的有效化學(xué)成分分別為槲皮素、木樨草素和大黃酚等。

圖1 淫羊藿與下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of epimedium and hypothalamuspituitary-adrenal gland/gonad/thyroid gland axis function damage targets

圖2 藥物-有效化學(xué)成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of drug-effective chemical components-disease -target

2.3 STRING 數(shù)據(jù)庫獲取交集靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)共得到669 個互作關(guān)系，平均節(jié)點度為61，將蛋白互作信息導(dǎo)入Cystosacpe 3.7.1 軟件進行可視化得出靶點蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。其中節(jié)點與度值間存在一定的關(guān)聯(lián)性，節(jié)點越大，度值越高，關(guān)聯(lián)越密切，說明本靶點與其他靶點之間的相關(guān)性越強，因此該靶點在PPI 網(wǎng)絡(luò)中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。排名前10 的靶點蛋白作為核心靶點，分別是含天胱氨酸的半胱氨酸蛋白酶3 （Cysteine protease 3 containing cysteine，Caspase-3）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、原癌蛋白（protein c-Fos， FOS）、 腫 瘤 壞 死 因 子（tumor necrosis factor， TNF）、 低 氧 誘 導(dǎo) 因 子 1α （hypoxiainducible factor-1 alpha，HIF1A）、血管內(nèi)皮生長因子 A （vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、 白 細 胞 介 素1β （interleukin-1 beta，IL-1β）、 雌 激 素 受 體1 （estrogen receptor 1，ESR1）、 前 列 腺 素 內(nèi) 過 氧 化 物 合 酶 2（prostaglandin endoperoxidase synthase 2，PTGS2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9 （matrix metalloproteinase-9，MMP-9），靶點蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖見圖4。

圖3 靶點蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram of target proteins

圖4 核心靶點的相關(guān)參數(shù)Fig.4 Related parameters of core targets

2.4 淫羊藿治療下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷的潛在靶點的GO 功能富集分析和KEGG 信號通路富集分析將62 個潛在靶點基因輸入至OmicShare 數(shù)據(jù)庫中，以P<0.05 為標準進行GO 功能富集分析和KEGG 信號通路富集分析，共獲得53 個符合條件的信息，其中包括26 個生物過程（biological process，BP）的信息，15 個細胞組分（molecular function，MF） 的信息，12 個分子 功 能 （cellular componant， CC） 的 信 息。見圖5。

圖5 GO 功能富集分析Fig.5 GO functional enrichment analysis

交集靶基因在BP 中主要富集于生物調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)過程和生殖過程等；在MF 中主要富集于細胞器、突觸和膜等；在CC 中主要富集于抗氧化活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性和分子功能調(diào)節(jié)器等。

KEGG 信號通路富集分析得到203 個通路。對前20 個通路進行分析結(jié)果顯示：其共同靶點主要富集于激素調(diào)節(jié)、免疫炎癥和能量代謝相關(guān)的通路，如白細胞介素17（interlukin-17，IL-17）信號通路和癌癥通路，在糖尿病并發(fā)癥中發(fā)揮作用的AGE-RAGE 信號通路、炎癥性腸病（inflammatiory bowel disease，IBD）、內(nèi)分泌的阻力和TNF 信號通路等。見圖6。

圖6 潛在靶點的KEGG 信號通路富集分析Fig.6 KEGG signaling pathway enrichment analysis on potential targets

2.5 淫羊藿的有效化學(xué)成分和下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷核心靶點蛋白的分子對接KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示：主要涉及到激素調(diào)節(jié)、免疫炎癥和能量代謝等環(huán)節(jié)，結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)篩選的淫羊藿治療下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷的核心靶點蛋白，將與激素調(diào)節(jié)相關(guān)的靶點蛋白AR、抗炎免疫相關(guān)的靶點蛋白IL-6、促分裂原活化蛋白激酶1 （mitogen-actived protein kinase 1，MAPK1）和能量代謝相關(guān)的靶點蛋白MAPK1 及PTGS2 作為模板蛋白。淫羊藿苷在篩選過程中度值較低未能被準確篩選出來，但其在淫羊藿中含量豐富，在治療下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷中已有應(yīng)用，因此將木犀草素、槲皮素、山柰酚和淫羊藿苷等有效化學(xué)成分與模板蛋白進行分子對接，分子對接結(jié)果見表1。分子對接結(jié)果顯示：淫羊藿藥材的關(guān)鍵有效化學(xué)成分與選擇的核心靶點蛋白存在很好的結(jié)合作用，其中槲皮素與MAPK1、木樨草素與IL-6、木樨草素與AR，山柰酚與PTGS2 的對接結(jié)果較好，對其進行可視化結(jié)果見圖7。

表1 分子對接結(jié)果Tab.1 Molecular docking results

圖7 分子對接模型Fig.7 Models of docking models

3 討 論

本研究在PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中以度值對核心靶點蛋白進行篩選后分析發(fā)現(xiàn)：核心靶點蛋白大多與免疫炎癥細胞因子、 能量代謝和激素調(diào)節(jié)蛋白（CASP3、IL-6、FOS、TNF、HIF1A、VEGFA、IL-1β、ESR1、PTGS2、MMP9、AR 和MAPK1等）有關(guān)聯(lián)，表明淫羊藿可能干預(yù)患者的下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸，通過促進生殖器官的發(fā)育調(diào)節(jié)睪酮等性激素水平；誘導(dǎo)Th1 細胞、T 淋巴細胞和B 淋巴細胞等免疫細胞和細胞因子的增殖，抑制炎癥因子的表達，減少炎癥介質(zhì)的釋放，調(diào)節(jié)甲狀腺激素的分泌，改善機體糖脂代謝水平等進而發(fā)揮抗炎、免疫、激素調(diào)節(jié)和能量代謝的作用［21-25］。

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示：抗炎免疫和控制能量代謝相關(guān)的通路在KEGG 富集結(jié)果中占比較高。IL-17 通路是富集結(jié)果排名靠前的通路，表明 淫 羊 藿 可 能 通 過 調(diào) 控CCL2、IL-6、IL-1β 和TNF 等靶點蛋白來提高下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷患者免疫抗炎的功能［26-28］；在控制能量代謝的通路中，調(diào)控糖類代謝的過程和細胞凋亡過程可以控制細胞增殖和生長，從而發(fā)揮重要生物學(xué)作用［25］。

研究［28］顯示：大蛋白受體與相對分子質(zhì)量小的化合物結(jié)合越穩(wěn)定，結(jié)合能越低。分子模擬對接結(jié)果顯示：淫羊藿苷、槲皮素、木樨草素和山柰酚與IL-6、PTGS2、AR 和MAPK1 結(jié)合具有較高的穩(wěn)定性。對得到的有效化學(xué)成分、核心靶點和通路進行逐一分析，發(fā)現(xiàn)淫羊藿有效化學(xué)成分可能通過與IL-6、PTGS2、AR 和MAPK1 結(jié)合，促進雄激素受體表達，改變鈣離子（Ca2+） -三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶的活性，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而激活睪丸線粒體中P38 和MAPK表達影響男性生殖功能［29-30］，在抗炎免疫和抑制炎癥因子的形成過程中也發(fā)揮一定作用。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步闡明了淫羊藿用于治療下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷潛在有效化學(xué)成分及作用機制，其中起到治療作用的關(guān)鍵有效化學(xué)成分為淫羊藿苷、槲皮素、山奈酚和木樨草素；大部分核心治療靶點和通路與抗炎免疫、能量代謝及激素調(diào)節(jié)有關(guān)聯(lián)。在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法基礎(chǔ)上進行分子對接驗證預(yù)測結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果一致，關(guān)鍵有效化學(xué)成分和起治療作用的靶點蛋白可以穩(wěn)定結(jié)合。本研究結(jié)果為下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸功能損傷的治療提供了參考，為尋找藥物治療疾病的潛在機制提供了依據(jù)。