基于雜合肽H5LL 活性的生物信息學(xué)分析和重組乳酸菌表達(dá)載體的構(gòu)建

趙瀟穎, 宿建勝, 馬嘉輝, 王岳峰, 王 丹, 孫麗媛

（北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院臨床生化及分子生物學(xué)檢驗(yàn)教研室，吉林 吉林 132013）

抗 菌 肽（antimicrobialpeptides，AMPs） 又 稱抗微生物肽，廣泛分布于動(dòng)物、植物和昆蟲(chóng)界［1］，是具有抑菌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)活性的小型陽(yáng)離子雙親肽［2］，因種類多、廣譜抗菌和不易誘導(dǎo)耐藥菌株產(chǎn)生等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被稱為最具前景的抗生素替代品［3］。人源性AMPs 具有低排異反應(yīng)和低毒性［4］，在臨床用藥和食品生產(chǎn)等方面有相對(duì)優(yōu)勢(shì)。其中人源性AMPs重組蛋白5（histatin 5，Hst5） 是唾液腺和腮腺等分泌的富組蛋白家族成員之一，能有效殺滅口腔中致病的白假絲酵母菌［5-6］，DU 等［7］發(fā)現(xiàn) Hst5 或其衍生物對(duì)六大超級(jí)細(xì)菌（ESKAPE），即屎腸球菌（Enterococcus faecium，E）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia，K）、鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii，A）、銅綠假單胞 菌（Pseudomonas aeruginosa， P） 和 腸 桿 菌（Enterobacteria，E），感染的病原體也有抑菌效果。AMPs 產(chǎn)物L(fēng)L-37［8］廣泛存在于皮膚、眼表和腸道等上皮細(xì)胞中，抗菌譜廣，具有抗感染和參與免疫調(diào)節(jié)等功能活性［9］。天然資源中提取AMPs 成本高且純度低，且提取的AMPs 具有細(xì)胞毒性和低穩(wěn)定性等缺點(diǎn)［10-11］，限制其應(yīng)用。故實(shí)現(xiàn)AMPs 高效、高產(chǎn)和安全性規(guī)?；a(chǎn)，成為研究熱點(diǎn)。

為提高AMPs 的穩(wěn)定性和抗菌活性，本研究以人源性AMPs Hst5 和LL-37 為親本，采用生物信息學(xué)工具設(shè)計(jì)并合成雜合肽H5LL 進(jìn)行預(yù)測(cè)、分析其穩(wěn)定性、抑菌機(jī)制和抑菌活性等相關(guān)內(nèi)容。為解決AMPs 來(lái)源受限、生產(chǎn)成本高、不穩(wěn)定和純化復(fù)雜等問(wèn)題，目前基因工程是獲取AMPs 的最佳途徑。原核表達(dá)系統(tǒng)的乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是人類和大多數(shù)動(dòng)物腸道內(nèi)益生菌，是公認(rèn)安全的微生物［12-13］，廣泛應(yīng)用于食品加工、農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥等領(lǐng)域。因此，在人源性雜合肽H5LL 基礎(chǔ)上，采用基因工程技術(shù)，以LAB 為宿主，組成型質(zhì)粒pMG36e 為載體，構(gòu)建重組分泌型表達(dá)載體，為后續(xù)雜合肽H5LL 的異源性表達(dá)研究提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 雜合肽、主要試劑和儀器

含雜合肽H5LL 目的序列的質(zhì)粒pUC57-H5LL由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，大腸埃希菌（ATCC 43889）（中國(guó)科學(xué)院微生物研究所提供），pMG36e 質(zhì)粒（武漢淼靈生物科技公司），大腸埃希菌感受態(tài)DH5α（上海生工生物工程公司提供）。HindⅢ內(nèi)切酶、KpnⅠ內(nèi)切酶和T4 DNA 連接酶（日本TaKaRa 公司），質(zhì)粒小提試劑盒和凝膠回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司），紅霉素（上海源葉生物科技有限公司），LB 培養(yǎng)基（英國(guó)OXOID 生物公司）。NanoDrop One 微量核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)Quawell 公司），金屬?。绹?guó)科路森有限公司），電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公司）。

1.2 雜合肽H5LL 的設(shè)計(jì)

在NCBI 中 下 載Hst5 （NG_012279.1） 和LL-37（NG_012279.1）基因序列，采用抗菌肽集合數(shù)據(jù)庫(kù)CAMPR4 中的序列分析工具，預(yù)測(cè)親本肽的抗菌區(qū)域，將高抑菌活性肽段進(jìn)行雜合，命名為H5LL。 參照乳酸菌密碼子偏愛(ài)性網(wǎng)站（http：//www.jcat.de）， 將H5LL 逆 向 轉(zhuǎn) 碼 為DNA 序列，同時(shí)雜合肽序列中添加HindⅢ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)及組氨酸標(biāo)簽。

1.3 雜合肽H5LL 生物信息學(xué)活性預(yù)測(cè)

1.3.1 H5LL 成肽可能性預(yù)測(cè) 采用抗菌肽集合數(shù)據(jù)庫(kù)CAMPR3［14］預(yù)測(cè)多肽H5LL 成為抗菌肽的可能性和抑菌區(qū)域。

1.3.2 H5LL 理化性質(zhì)預(yù)測(cè) 采用抗菌肽生物信息學(xué)分析網(wǎng)站Expasy （https：// web.expasy.org/）中的Prot Param 進(jìn)行雜合肽H5LL 理化性質(zhì)預(yù)測(cè)［15］。預(yù)測(cè)參數(shù)包括相對(duì)分子質(zhì)量、原子組成、凈電荷、半衰期、不穩(wěn)定指數(shù)、親水性指數(shù)和脂肪指數(shù)等。

1.3.3 H5LL 疏水性預(yù)測(cè) 采用生物信息學(xué)在線網(wǎng)站Expasy 中的Protscale（https：//web.expasy.org/protscale/） 和DNAStar 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 的Protean 軟件預(yù)測(cè)雜合肽的疏水性。

1.3.4 H5LL 酶切位點(diǎn)預(yù)測(cè) 采用在線網(wǎng)站ExPASy （https：//web.expasy.org/peptide_cutter/）中PeptideCutter 軟件預(yù)測(cè)各胰蛋白酶及其他酶類作用于H5LL 的潛在剪切位點(diǎn)。

1.3.5 H5LL 磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)磷酸化和糖基化是真核生物重要且研究廣泛的翻譯后修飾，參與調(diào)控生物體的生命活動(dòng)，前者主要發(fā)生在蘇氨酸、酪氨酸及絲氨酸殘基上［16］。分別采用在線軟件NetPhos 3.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/） 和NetNGlyc 1.0 Server （https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetNGlyc-1.0）預(yù)測(cè)雜合肽磷酸化及糖基化位點(diǎn)。

1.3.6 H5LL 跨膜區(qū)域預(yù)測(cè) 跨膜區(qū)域在細(xì)胞中提供識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)等方面的作用，通常為α-螺旋結(jié)構(gòu)［17］，可在細(xì)胞中行使轉(zhuǎn)運(yùn)通道和信號(hào)傳導(dǎo)的功能。存在跨膜區(qū)域的抗菌肽，在胞內(nèi)存在作用靶點(diǎn)，通過(guò)膜作用機(jī)制發(fā)揮活性。預(yù)測(cè)雜合肽的跨膜區(qū)域能夠?qū)罄m(xù)異源性表達(dá)研究提供依據(jù)，同時(shí)也可以更好地分析雜合肽H5LL 的抑菌機(jī)制。

1.3.7 H5LL 信號(hào)肽預(yù)測(cè) 在信號(hào)肽的作用下，多肽鏈進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔合成蛋白質(zhì)，最終由細(xì)胞膜分泌到胞外，而信號(hào)肽在通過(guò)膜時(shí)由存在膜上的肽酶切除。采用生物學(xué)在線網(wǎng)站SignalP 5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？ SignalP-5.0）預(yù)測(cè)雜合肽H5LL 的信號(hào)肽。

1.3.8 H5LL 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 基因表達(dá)產(chǎn)物或蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的存在位置即亞細(xì)胞定位，可存在于如細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等部位。 通過(guò)在線網(wǎng)站 TargetP-1.1 Server（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TargetP-1.1）對(duì)H5LL 的亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)分析，有助于初步判斷和了解AMPs 的功能活性。

1.3.9 H5LL 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 采用生物網(wǎng)站Expasy 中的SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和DNA star 數(shù)據(jù)庫(kù)中的Protean 軟件分別進(jìn)行H5LL 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.3.10 H5LL 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 采用在線網(wǎng)站SWISS-MODEL （https：//swissmodel.expasy.org/interactive） 和Phyre（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi？id=index）在線預(yù)測(cè)H5LL 的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4 重組乳酸菌表達(dá)載體的構(gòu)建

1.4.1 目的基因和空載質(zhì)粒的雙酶切及回收 根據(jù)質(zhì)粒的HindⅢ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，建立pUC57-H5LL 和pMG36e 質(zhì)粒的雙酶切體系。見(jiàn)表1。

表1 pUC57-H5LL 和pMG36e 質(zhì)粒的酶切體系Tab.1 Digestion systems of pUC57-H5LL and pMG36e plasmids

酶切條件：37 ℃金屬浴2 h 后加入10×loading buffer 4 μL 終止反應(yīng)。酶切產(chǎn)物電泳：1%瓊脂糖凝膠電泳，130 V、35～40 min。目的片段凝膠回收：分別回收pUC57-H5LL 質(zhì)粒目的小片段H5LL和pMG36e 酶切后的空載大片段DNA。

1.4.2 重組載體構(gòu)建 根據(jù)T4 DNA 連接酶建立反應(yīng)體系：H5LL 2.0 μL，pMG36e DNA 1.8 μL，T4 DNA Ligase 1.0 μL， 10×T4 DNA Ligation buffer 1.0 μL，滅菌ddH2O 補(bǔ)足至10.0 μL；充分混勻后0.5 mL Ep 管密封后低速瞬時(shí)離心，16 ℃金屬浴過(guò)夜連接。重組質(zhì)粒命名為pMG36e-H5LL。

1.4.3 乳酸菌重組載體的驗(yàn)證 將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α 中，涂布于LB 平板。挑選平板上數(shù)個(gè)單個(gè)菌落，TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。設(shè)計(jì)目的基因H5LL 的引物，正向H5LL-F：5'-AAGCTTCATCATCATC-3'，反向H5LL-R：5'-GGTACCAAGGTTACGAAGG-3'，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 篩選陽(yáng)性菌落：采用普通PCR 20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，最適反應(yīng)體系組成：DNA 模板1.0 μL，PCR Mastermix 12.5 μ L，上 游 引 物1.0 μL，下 游 引 物1.0 μ L， 無(wú) 菌ddH2O 補(bǔ) 至25.0 μL。最適反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃充分延伸10 min。取5 μL PCR 產(chǎn)物，置于1.0%瓊脂糖凝膠中，調(diào)節(jié)電泳儀電壓至130 V，電泳35 min 后采用凝膠成像分析儀觀察。

根據(jù)PCR 法檢測(cè)結(jié)果，選取疑似陽(yáng)性菌落質(zhì)粒雙酶切，反應(yīng)體系：陽(yáng)性質(zhì)粒20.6 μL，10×M buffer 4.0 μL，HindⅢ 2.0 μL，KpnⅠ 2.0 μL，滅菌ddH2O 補(bǔ)足至40.0 μL；后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié) 果

2.1 雜合肽H5LL 的構(gòu)建AMPs Hst5 和LL-37肽段的抑菌區(qū)域最高預(yù)測(cè)值分別為0.95 和0.97。見(jiàn)表2。

表2 AMPs 抑菌區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.2 Prediction results of antibacterial region of AMPs

根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果并結(jié)合親本肽序列分析，選取Hst5 成熟肽段4～24 位氨基酸及LL-37 主要起抗菌作用的17～31 位氨基酸序列作為母本進(jìn)行雜合，雜合肽H5LL 氨基酸序列為AKRHHGYKRKFHEKHHSHRGYFKRIVQRIKDFLRNL， 修 飾后基因序列為5'-AAGCTTCATCATCATCATCATCACGCTAAGCGTCACCACGGTTACAAGCGTAAGTTCCACGAAAAGCACCACTCACACCGTGGTTACTTCAAGCGTATTGTTCAACGTATTAAGGACTTCCTTCGTAACCTTGGTACC-3'，斜體部分堿基分別為HindⅢ和KpnⅠ酶 切 位 點(diǎn)， 下 劃 線 為6x His-Tag 組 氨 酸 標(biāo) 簽序列。

2.2 H5LL 的成肽可能性預(yù)測(cè)結(jié)果通過(guò)CAMPR4 數(shù)據(jù)庫(kù)的判別分析器（discriminant analyzer， DA） 及 支 持 向 量 機(jī)（support vector machine，SVM）2 種算法預(yù)測(cè)雜合肽的抑菌活性，平均得分越高（最高分為1），預(yù)測(cè)其成為AMPs可能性越高。由DA 算法可知，H5LL 成為AMPs的DA 值為0.993，SVM 為0.819，平均得分為0.76，其成為AMPs 的可能性較高。

2.3 H5LL 的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果H5LL 由36 個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為4 625 380，分子式為C210H3285N74O46。疏水性氨基酸9 個(gè)，雖然疏水性與AMPs 抑菌活性成正比例，但疏水性氨基酸并不決定整個(gè)多肽的疏水性，只能起到一定的參考作用［20］?？傠姾蓴?shù)為+10，說(shuō)明H5LL 為陽(yáng)離子雜合肽。不穩(wěn)定指數(shù)與肽的穩(wěn)定性有關(guān)，不穩(wěn)定指數(shù)低于40 推斷肽序列穩(wěn)定，不穩(wěn)定指數(shù)為30.08 證明H5LL 穩(wěn)定性較好。脂肪指數(shù)定義為多肽中脂肪族氨基酸（纈氨酸、丙亮氨酸和異亮氨酸）所占的相對(duì)比例，預(yù)測(cè)多肽熱穩(wěn)定性，從結(jié)果可看出，H5LL 熱穩(wěn)定性較好。 總平均親水性（total average hydrophilicity ，GRAVY）［21］是計(jì)算肽的疏水性/溶解度，取值在-2～2，負(fù)值表明為親水性，H5LL 是具有較強(qiáng)親水性的多肽。雜合肽H5LL 序列的氨基酸組成見(jiàn)圖1，理化性質(zhì)預(yù)測(cè)部分結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 H5LL 的氨基酸組成Fig.1 Amino acid compositions of H5LL

表3 H5LL 理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.3 Prediction results of physical and chemical properties of H5LL

2.4 H5LL 疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果ProtScale 在線網(wǎng)站分析結(jié)果顯示：H5LL 的最大疏水指數(shù)為 4.500，位于第10 位氨基酸，最小疏水指數(shù)為-4.500，位于第2 位氨基酸，總體親水性大于疏水性（圖2）。DNAStar 數(shù)據(jù)庫(kù)中的Protean 分析結(jié)果顯示：多肽鏈親水性主要集中在N 端。2 種結(jié)果預(yù)測(cè)均顯示雜合肽H5LL為親水性蛋白，與理化性質(zhì)一致（圖3）。

圖2 ProtScale 預(yù)測(cè)H5LL 疏水性Fig.2 Hydrophobicity of H5LL predicted by ProtScale

圖3 DNAStar 預(yù)測(cè)H5LL 疏水性Fig.3 Hydrophobicity of H5LL predicted by DNAStar

2.5 H5LL 酶切位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果PeptideCutter 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：H5LL 中出現(xiàn)較多的剪切位點(diǎn)多集中在肽鏈兩端。H5LL 兩端為親水性，穩(wěn)定性較弱，所以易被剪切。其中，剪切位點(diǎn)較多的酶主要有胰蛋白酶、蛋白酶K 和低特異性糜蛋白酶。見(jiàn)表4。

表4 H5LL 酶切位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.4 Predicted results of H5LL digestion sites

2.6 H5LL 磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

H5LL 存在3 個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，第7 和21 位為酪氨酸修飾位點(diǎn)，第17 位為絲氨酸位點(diǎn)。不存在糖基化位點(diǎn)。見(jiàn)圖4 和5。

圖4 H5LL 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 Prediction results of phosphation sites of H5LL

圖5 H5LL 糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.5 Prediction results of glycosylation sites of H5LL

2.7 H5LL 跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果TMHMM Server v.2.0 預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6，天藍(lán)色線表示各氨基酸處于膜內(nèi)的概率，表明H5LL 不含跨膜區(qū)域，屬于膜內(nèi)蛋白。

圖6 H5LL 跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.6 Prediction results of H5LL transmembrane region

2.8 H5LL 信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果H5LL 信號(hào)肽的Sec/SPI 為0.004 4， 該 雜 合 肽 無(wú) 信 肽 存 在。SignalP-5.0 預(yù)測(cè)H5LL 信號(hào)肽結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 SignalP-5.0 預(yù)測(cè)H5LL 信號(hào)肽Fig.7 H5LL signal peptides predicted by SignalP-5.0

2.9 H5LL 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果TargetP-1.1 Server 預(yù)測(cè)H5LL 亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示：線粒體靶向肽的可能性為0.333，分泌通路信號(hào)肽可能性為0.033，其他蛋白的可能性為0.731。

2.10 H5LL 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果在線網(wǎng)站SOPMA 預(yù)測(cè)H5LL 的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示：有19 個(gè) 氨 基 酸 參 與α-螺旋（藍(lán)色） 的形成，占52.78%；8 個(gè)氨基酸參與β-轉(zhuǎn)角（綠色）的形成，占22.22%；6 個(gè)氨基酸參與無(wú)規(guī)卷曲（紫色）的形成，占16.67%；延伸鏈3 個(gè)，占8.33%。結(jié)果顯示雜合肽H5LL 結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋為主，β-轉(zhuǎn)角次之，可預(yù)測(cè)其具有較強(qiáng)抑菌活性及穩(wěn)定性。采用 DNAStar 軟件中的Protean 預(yù)測(cè)H5LL 二級(jí)結(jié)構(gòu)的具體區(qū)域見(jiàn)圖8。

圖8 SOPMA 網(wǎng)站(A) 和DNAStar 數(shù)據(jù)庫(kù)(B)預(yù)測(cè)H5LL二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.8 Secondary structure of H5LL predicted by SOPMA Website (A) DNAStar Database(B)

2.11 H5LL 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果H5LL 的三級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋數(shù)量較多，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符。見(jiàn)圖9。

圖9 SWISS-MODEL(A)和Phyre(B)網(wǎng)站預(yù)測(cè)H5LL 的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.9 Tertiary structure of H5LL predicted by SWISSMODEL(A) and Phyre(B) Websites

2.12 目的片段和表達(dá)載體的獲取pUC57-H5LL和pMG36e 質(zhì)粒在HindⅢ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示目的基因小片段和空載質(zhì)粒片段分別為136 和3 500 bp，條帶大小與理論值相符。回收得到帶有黏性末端的H5LL 目的基因和空載pMG36e DNA 質(zhì)粒。見(jiàn)圖10。

圖10 pUC57-H5LL 和pMG36e 質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.10 Electrophoregram of double digestion of pUC57-H5LL and pMG36e plasmids

2.13 重組質(zhì)粒pMG36e-H5LL 的驗(yàn)證結(jié)果在138 bp 處有清晰明亮條帶，目的基因與目的條帶大小相符。陽(yáng)性菌落質(zhì)粒雙酶切后行電泳，在136 和3 500 bp 處有清晰條帶，因?yàn)閜MG36e 是低拷貝數(shù)質(zhì)粒，重組質(zhì)粒濃度低，所以在雙酶切電泳后136 bp 處條帶較淺。證明已經(jīng)成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pMG36e-H5LL。重組質(zhì)粒的PCR 和酶切電泳結(jié)果見(jiàn)圖11 和12。

圖11 重組質(zhì)粒PCR 電泳圖Fig.11 PCR electrophoregram of recombinant plasmids

圖12 重組質(zhì)粒酶切電泳圖Fig.12 Digestion electrophoregram of recombinant plasmid

3 討 論

信號(hào)肽可將蛋白質(zhì)引入到細(xì)胞中含不同膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞器中，引導(dǎo)真核和原核生物蛋白質(zhì)的分泌［18］。AMPs 的 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 一 般 包 含α-螺 旋、延 伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲，是多肽鏈中主鏈原子的局部空間構(gòu)象。二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)AMPs 發(fā)揮抑菌作用意義重大，具有兩親性α-螺旋的AMPs 通過(guò)靜電吸引與細(xì)菌膜結(jié)合，疏水端插入到胞膜中，破壞細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而產(chǎn)生抑制細(xì)菌作用［19］。因此，AMPs 結(jié)構(gòu)中α-螺旋的比例與抑菌活性有關(guān)。同時(shí)β-轉(zhuǎn)角也影響AMPs 的穩(wěn)定性。近年來(lái)，抗生素廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、食品安全和畜牧業(yè)等領(lǐng)域［20-22］，但隨著抗生素的過(guò)度使用，抗生素耐藥已成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域亟待解決問(wèn)題之一［23］，尋找替代抗生素的新藥已成為治療耐藥菌感染的首要任務(wù)。AMPs Hst5 是人類和高級(jí)靈長(zhǎng)類動(dòng)物唾液分泌物組成成分 之 一， Hst3 的 水 解 產(chǎn) 物［6］可 中 和 脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS），降低齲齒發(fā)生率，抑制或殺滅白假絲酵母菌和變異鏈球菌等，是宿主非防御系統(tǒng)的重要組成部分。有研究［24］顯示：患齲齒兒童唾液中Hst5 濃度明顯低于無(wú)齲兒童，且Hst5 濃度隨著齲齒嚴(yán)重程度增加而逐漸降低。AMPs LL37 普遍存在于人體各組織和細(xì)胞中，具有抗菌、抗腫瘤、抗感染和參與免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性。在抗菌方面，帶正電荷的陽(yáng)離子AMPs LL37 極易與胞壁帶負(fù)電荷的磷壁酸或LPS 的革蘭陽(yáng)性或革蘭陰性細(xì)菌相結(jié)合，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，從而使細(xì)胞壁解體、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌等均有較好的抑菌或殺菌效果［25］。為提高Hst5 和LL37 的抗菌活性及穩(wěn)定性，同時(shí)降低細(xì)胞毒性，在兩者基礎(chǔ)上對(duì)親本肽進(jìn)行改造，根據(jù)乳酸菌密碼子偏愛(ài)性，優(yōu)化設(shè)計(jì)并合成雜合肽H5LL。

對(duì)雜合肽進(jìn)行生物信息學(xué)活性分析結(jié)果顯示：CAMP 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)H5LL 成為AMPs 的概率較高；理化性質(zhì)和疏水性預(yù)測(cè)：H5LL 是具有良好穩(wěn)定性、半衰期較長(zhǎng)的陽(yáng)離子親水性雜合肽；PeptideCutter軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：H5LL 被16 種活性物質(zhì)剪切，胰蛋白酶和蛋白酶K 有較多剪切位點(diǎn)；TMHMM Server v.2.0 預(yù)測(cè)H5LL 不含跨膜區(qū)域，且屬于膜內(nèi)蛋白；無(wú)信號(hào)肽；在第7、17 和21 位存在3 個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，無(wú)糖基化位點(diǎn)；二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：α-螺旋均占比最高、β-轉(zhuǎn)角次之，在一定程度上影響雜合AMPs 活性和穩(wěn)定性。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示：雜合肽H5LL 有極大的應(yīng)用潛力和價(jià)值。但目前AMPs 獲取主要有天然分離、化學(xué)合成和基因工程3 種方式。前2 種獲取方式存在成本高、得率低、工序繁瑣和難以大規(guī)模生產(chǎn)的問(wèn)題。采用基因工程技術(shù)，通過(guò)工程菌構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)，同時(shí)對(duì)表達(dá)載體或外源基因進(jìn)行改造或修飾，獲得的AMPs 具有高效率、低成本和大量表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒，表達(dá)AMPs 有現(xiàn)實(shí)意義?，F(xiàn)已有的成熟表達(dá)系統(tǒng)主要分為兩大類，一是原核表達(dá)系統(tǒng)，如大腸埃希菌，重組AMPs His6-Intein-KR12AGPWR6 經(jīng)大腸埃希菌異源性表達(dá)，與化學(xué)法合成的KR12AGPWR6 有相似的抗菌活性，基因工程表達(dá)法簡(jiǎn)單、價(jià)格低，易于擴(kuò)大商業(yè)生產(chǎn)規(guī)模［26］；另一類是真核表達(dá)系統(tǒng)，如酵母菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，富含半胱氨酸的小型植物AMPs Snakin-1在畢赤酵母中得到高效表達(dá)，表達(dá)水平為40 mg·L－1［27］，其中最為經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)單的方法是原核表達(dá)系統(tǒng)［28］。但AMPs 在大腸埃希菌系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)有諸多局限性，如AMPs 對(duì)宿主細(xì)胞的毒性作用限制其表達(dá)，且容易被大腸埃希菌細(xì)胞質(zhì)中的蛋白酶降解，降低其表達(dá)量。

原核表達(dá)系統(tǒng)中的乳酸菌多數(shù)是公認(rèn)安全食品級(jí)微生物，具有改善腸道微生物菌群和腸道功能、降低血清膽固醇、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、改善食物代謝及延緩機(jī)體衰老等生理功能。作為基因工程菌表達(dá)和傳遞外源基因時(shí)，具有益生性，同時(shí)乳酸菌可以在人或動(dòng)物胃腸道內(nèi)定植存活，尤其不刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，表達(dá)的外源蛋白無(wú)須經(jīng)過(guò)純化和復(fù)性等過(guò)程，近年來(lái)在食品加工及臨床治療等相關(guān)途徑受到越來(lái)越多的關(guān)注。ZENG 等［29］成功實(shí)現(xiàn)了AMPs HD-5 在乳酸菌中的表達(dá)，小鼠口服重組菌株NZ9000SHD-5 后，腸黏膜損傷緩解，這為潰瘍性結(jié)腸炎提供了新的治療手段。

本課題組在合成并預(yù)測(cè)分析雜合肽H5LL 基礎(chǔ)上，將其與表達(dá)質(zhì)粒pMG36e 構(gòu)建重組表達(dá)載體pMG36e-H5LL，為雜合肽H5LL 在乳酸菌中的表達(dá)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；本研究結(jié)果為解決抗生素耐藥性問(wèn)題和獲取具備臨床應(yīng)用價(jià)值的新型AMPs 提供實(shí)驗(yàn)方向，為AMPs 基因工程規(guī)?；a(chǎn)和安全性使用提供實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。后續(xù)仍需進(jìn)一步對(duì)表達(dá)雜合肽抑菌活性、穩(wěn)定性和細(xì)胞毒性等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為獲得可用于醫(yī)療衛(wèi)生、食品工業(yè)及保健業(yè)等領(lǐng)域的新型AMPs 的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。