睪酮在體外對(duì)人卵巢顆粒細(xì)胞SVOG 凋亡的影響及其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制

仝曉麗, 范明慧, 孟 嬌, 朱繼紅，盛敏佳

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，吉林 長(zhǎng)春 130033；2.山西省臨汾市中心醫(yī)院生殖健康與不孕不育科，山西 臨汾 041000；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)?產(chǎn)前診斷中心,吉林 長(zhǎng)春 130021）

我國(guó)育齡期婦女中多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS） 患病率約為5.6%［1］，高雄激素血癥是其重要臨床表現(xiàn)。既往研究［2-4］顯示：PCOS 患者卵巢顆粒細(xì)胞出現(xiàn)異常凋亡，而顆粒細(xì)胞凋亡是引起卵泡閉鎖的基礎(chǔ)機(jī)制。研究［5-7］顯示：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS） 發(fā)生在卵巢細(xì)胞中，影響卵母細(xì)胞的成熟、卵泡的形成和排卵過(guò)程。經(jīng)典凋亡途徑包括外源性（死亡受體）途徑和內(nèi)源性（線粒體）途徑，而ERS 所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是不同于前兩者新的信號(hào)傳導(dǎo)通路［4］。ERS 導(dǎo)致多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)的激活，統(tǒng)稱為未折疊蛋白反應(yīng)（upfolded protein response，UPR），在應(yīng)激過(guò)程中起主要作用，并影響多種細(xì)胞功能。轉(zhuǎn)錄因子C/EBP 同 源 蛋 白 （C/EBP homologous protein，CHOP） 與其他UPR 相關(guān)基因可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）協(xié)同作用下參與細(xì)胞死 亡。死 亡 受 體5 （death receptor 5， DR5） 是CHOP 的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，在ERS 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用［4，8］。研究［9-11］顯示：ERS 在卵泡顆粒細(xì)胞后期被激活，且PCOS 組患者中ERS 激活程度高于非PCOS 組。ERS 參與雄激素誘導(dǎo)的其他類型細(xì)胞凋亡，包括前列腺癌細(xì)胞［12］、胰島β 細(xì)胞［13］和胚胎干細(xì)胞［14］，推測(cè)ERS 是由睪酮在竇卵泡顆粒細(xì)胞中激活，并通過(guò)誘導(dǎo)CHOP 蛋白及其轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)DR5 的激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究探討睪酮對(duì)體外培養(yǎng)的SVOG 細(xì)胞中ERS 活化的影響和睪酮誘導(dǎo)SVOG 細(xì)胞凋亡過(guò)程中CHOP-DR5 通路的作用，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time quantitative PCR，RT-qPCR） 法觀察ESR 激活的標(biāo)志物剪切型X-盒結(jié)合蛋白1 （sliced X-boxbinding protein 1， XBP1s）、 激 活 轉(zhuǎn) 錄 因 子4（activating transcription factor 4，ATF4）、CHOP和DR5 在經(jīng)睪酮誘導(dǎo)的SVOG 細(xì)胞中的表達(dá)，研究睪酮聯(lián)合ERS 抑制劑?；切苋パ跄懰幔╰auroursodeoxycholic acid，TUDCA）和雄激素受體（androgen receptor， AR） 抑 制 劑 氟 他 胺 對(duì)SVOG 細(xì)胞凋亡的作用及其對(duì)CHOP 和DR5 基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和主要儀器人卵巢顆粒細(xì)胞SVOG（美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)）。RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國(guó)Gibco 公司），睪酮（貨號(hào)A050109，上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司），氟他胺（貨號(hào)HY-B0022） 和TUDCA （貨 號(hào)HY-19696， 美 國(guó)MCE 公 司），Annexin Ⅴ-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）， RNase free H2O、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green Mix（瑞士Roche 公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）引物［生工生物工程（上海）有限公司］。CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司），倒置相差顯微鏡（美國(guó)Olympus 公司），低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Berkman 公司），Epoch 微孔板酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰公司），RT-qPCR 儀（德國(guó)Roche Light Cycler 公司），迷你離心機(jī)（海門(mén)市其林貝爾儀器），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將復(fù)蘇的SVOG 細(xì)胞采用RPMI-1640 復(fù)合培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗）置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h 換液1 次，細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)采用0.25%含EDTA 的胰酶消化貼壁的SOVG 細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SVOG 細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)12 h 后，加入藥物后分別培養(yǎng)24 和48 h，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.4 最佳藥物作用濃度篩選和MTT 法檢測(cè)SVOG 細(xì)胞增殖抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SVOG 細(xì)胞，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)12 h 后，加入睪酮，分別培養(yǎng)24 和48 h，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況；每孔加入20 μL 0.5% 噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）溶液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h，去除培養(yǎng)基后加 入150 μL 二 甲 基 亞 砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），37 ℃恒溫振蕩箱震蕩10 min，于酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各細(xì)胞孔的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率， 細(xì)胞增殖抑制率=［1－（實(shí)驗(yàn)組平均A 值/對(duì)照組平均A 值）］×100%，篩選出睪酮最佳作用濃度。將SVOG 細(xì)胞加入不同濃度（0.1×10－5、0.5×10－5、1.0×10－5、5.0×10－5和10.0×10－5mol·L－1）氟他胺和不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0 和2.5 g·L－1）TUDCA 后培養(yǎng)24 h后，再加入睪酮（1.0×10－5mol·L－1），分別培養(yǎng)24 和48 h，顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，MTT 法計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，篩選氟他胺和TUDCA 的最佳作用濃度。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SVOG 細(xì)胞凋亡率96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中按5×105mL－1濃度鋪板，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)12 h 后，更換含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基 200 μL（實(shí)驗(yàn)組分別采用1.5 g·L－1TUDCA 及1.0×10－5mol·L－1氟他胺培養(yǎng)24 h，再采用1.0×10－5mol·L－1睪酮培養(yǎng)24 h）。48 h 后，采用1～2 mL 胰酶消化細(xì)胞收集。 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌細(xì)胞2 次，收集5×104個(gè)細(xì)胞，195 μL Annexin Ⅴ-FITC 結(jié)合液重懸細(xì)胞，先加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 混 勻 后，加 入10 μL 碘 化 丙 啶（propidum iodide，PI）染色液混勻，避光、室溫反應(yīng)20 min， Annexin Ⅴ-/PI 染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 RT-qPCR 法 檢 測(cè)SVOG 細(xì) 胞 中XBP1s、ATF4、CHOP 和DR5 mRNA 表 達(dá) 水 平將SVOG細(xì)胞分為對(duì)照組、睪酮組（1.0×10－5mol·L－1睪酮）、睪酮+氟他胺組（1.0×10－5mol·L－1睪酮+1.0×10－5mol·L－1氟 他 胺） 和 睪 酮+TUDCA 組（1.0×10－5mol·L－1睪 酮+1.5 g·L－1TUDCA），培養(yǎng)0、3、24 和48 h 后采用RT-qPCR 法檢測(cè)各組細(xì) 胞 中XBP1s、ATF4、CHOP 和DR5 mRNA 表達(dá)水平，TRIzol 法提取各組細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA 濃度和A（260）/A（280）比值。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)總體積為 20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共40 個(gè)循環(huán)。 引物序列： XBP1s 上游引物5'-TGCTGAGTCCGCAGCAGGTG-3'，XBP1s 下 游 引 物5'-TGCTGAGTCCGCAGCAGGTG-3'；ATF4 上游引物5' -GGCTGGCTGTGGATGGGTTG-3'，ATF4 下游引物5'-CTCCTGGACTAGGGGGGCAA-3'；CHOP 上 游 引 物5'-GGAGAACCAGGAAACGGAAAC-3'， CHOP 下 游 引 物5' -TCTCCTTCATGCGCTGCTTT-3'；DR5 上 游 引 物5'-CCAGCAAATGAAGGTGATCC-3'，DR5 下 游引 物5' -GCACCAAGTCTGCAAAGTCA-3'； 采用 2－△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA 表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組SVOG 細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞凋亡率，各組細(xì)胞中XBP1s、ATF4、CHOP 和DR5 mRNA 表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組SVOG 細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)倒置相差顯微鏡下觀察SVOG 細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)：對(duì)照組SVOG 細(xì)胞呈橢圓形，以貼壁方式生長(zhǎng)，細(xì)胞之間連接緊密，邊界清晰，透光性好；睪酮組SVOG 細(xì)胞中，存活細(xì)胞數(shù)減少，異型細(xì)胞增多，細(xì)胞邊緣模糊，細(xì)胞體內(nèi)有明顯顆粒感，培養(yǎng)基中細(xì)胞碎片增多，透光性差，上述現(xiàn)象隨著睪酮濃度的增加更加明顯；與對(duì)照組比較，睪酮+氟他胺組和睪酮+TUDCA 組SVOG 細(xì)胞上述改變?nèi)源嬖?；與睪酮組比較，睪酮+氟他胺組和睪酮+TUDCA 組SVOG 細(xì)胞上述改變明顯減輕。

2.2 最佳藥物作用濃度篩選結(jié)果不同濃度睪酮對(duì)SVOG 細(xì)胞生長(zhǎng)均有抑制作用，呈劑量依賴性，當(dāng)睪酮濃度為5.0×10－5mol·L－1時(shí)，48 h 后細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到70.77%，本研究選取選睪酮濃度為1.0×10－5mol·L－1。各組細(xì)胞分別加入不同濃度氟他胺和TUDCA 后培養(yǎng)12 和24 h，再加入睪酮（1.0×10－5mol·L－1） 培 養(yǎng)24 和48 h，與 睪 酮 組（1.0×10－5mol·L－1）比較，睪酮+氟他胺組和睪酮+TUDCA 組細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，當(dāng)氟他胺濃度為1.0×10－5mol·L－1且TUDCA 濃度為1.5 g·L－1時(shí)拮抗效果最佳。

2.3 不同濃度睪酮作用不同時(shí)間后SVOG 細(xì)胞增殖抑制率MTT 比色法檢測(cè)結(jié)果顯示：相同濃度睪酮作用下，與24 h 比較，48 h 時(shí)SVOG 細(xì)胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；作用相同時(shí)間，不同濃度睪酮作用SVOG 細(xì)胞后，細(xì)胞增殖抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度睪酮作用不同時(shí)間后SVOG 細(xì)胞增殖抑制率Tab.1 Inhibitory rates of proliferation of SVOG cells after treated with different concentration of testosterone for different time（±s，η/%）

表1 不同濃度睪酮作用不同時(shí)間后SVOG 細(xì)胞增殖抑制率Tab.1 Inhibitory rates of proliferation of SVOG cells after treated with different concentration of testosterone for different time（±s，η/%）

*P<0.05 vs 24 h;△P<0.05 vs 0 mol·L－1 testosterone;#P<0.05 vs 0.5×10－5 mol·L－1 testosterone;○P<0.05 vs 1.0×10－5 mol·L－1 testosterone;▲P<0.05 vs 5.0×10－5 mol·L－1 testosterone.

Inhibitory rate of proliferation Group 24 h 48 h 0 mol·L－1 testosterone 1.08±1.15 10.75±1.87*0.1×10－5 mol·L－1 testosterone 2.04±1.48 19.15±0.37*0.5×10－5 mol·L－1 testosterone 10.98±2.24△32.19±1.63*△1.0×10－5 mol·L－1 testosterone 30.07±0.80△#45.91±2.17*△#5.0×10－5 mol·L－1 testosterone 43.64±5.55△#○70.77±2.42*△#○10.0×10－5 mol·L－1 testosterone 50.10±6.68△#○▲75.85±2.38*△#▲

2.4 睪酮聯(lián)合不同濃度氟他胺作用后SVOG 細(xì)胞增殖抑制率MTT 比色法檢測(cè)結(jié)果顯示：與作用24 h 比較，相同濃度（1.0×10－5mol·L－1）睪酮+氟他胺作用48 h 時(shí)SVOG 細(xì)胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；作用相同時(shí)間后，睪酮+不同濃度氟他胺作用對(duì)SVOG 細(xì)胞增殖抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 1.0×10－5 mol·L－1睪酮聯(lián)合不同濃度氟他胺作用不同時(shí)間后SVOG 細(xì)胞增殖抑制率Tab.2 Inhibitory rates of proliferation of SVOG cells after treated with 1.0×10－5 mol·L－1 testosterone combined with different concentrations of flutamide for different time （±s，η/%）

表2 1.0×10－5 mol·L－1睪酮聯(lián)合不同濃度氟他胺作用不同時(shí)間后SVOG 細(xì)胞增殖抑制率Tab.2 Inhibitory rates of proliferation of SVOG cells after treated with 1.0×10－5 mol·L－1 testosterone combined with different concentrations of flutamide for different time （±s，η/%）

*P<0.05 vs 24 h;△P<0.05 vs 0 mol·L－1 flutamide;#P<0.05 vs 0.5×10－5 mol·L－1 flutamide;○P<0.05 vs 1.0×10－5 mol·L－1 flutamide;▲P<0.05 vs 5.0×10－5 mol·L－1 flutamide.

Inhibitory rate of proliferation Group 24 h 48 h 0 mol·L－1 flutamide 35.31±0.77 47.15±2.69*0.1×10－5 mol·L－1 flutamide 33.36±8.39 45.91±2.17*0.5×10－5 mol·L－1 flutamide 18.67±1.63△33.68±3.86*△1.0×10－5 mol·L－1 flutamide 13.32±0.87△#21.99±1.51*△#5.0×10－5 mol·L－1 flutamide 21.04±0.37△#○36.15±4.11*△#○10.0×10－5 mol·L－1 flutamide 26.05±2.70△#○▲49.89±4.09*△#○▲

2.5 睪酮聯(lián)合TUDCA 作用后SVOG 細(xì)胞增殖抑制率MTT 比色法檢測(cè)結(jié)果顯示：與作用24 h 比較， 相 同 濃 度 （1.0×10－5mol·L－1） 睪 酮+TUDCA 作用48 h 后SVOG 細(xì)胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；作用相同時(shí)間后，睪酮+不同濃度TUDCA 作用對(duì)SVOG 細(xì)胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 1.0×10－5 mol·L－1睪酮聯(lián)合不同濃度TUDCA 作用不同時(shí)間后SVOG 細(xì)胞增殖抑制率Tab.3 Inhibitory rates of proliferation of SVOG cells after treated with testosterone combined with different concentrations of TUDCA for different time （±s，η/%）

表3 1.0×10－5 mol·L－1睪酮聯(lián)合不同濃度TUDCA 作用不同時(shí)間后SVOG 細(xì)胞增殖抑制率Tab.3 Inhibitory rates of proliferation of SVOG cells after treated with testosterone combined with different concentrations of TUDCA for different time （±s，η/%）

*P<0.05 vs 24 h;△P<0.05 vs 0 g·L－1 TUDCA;#P<0.05 vs 0.5 g·L－1 TUDCA;○P<0.05 vs 1.0 g·L－1 TUDCA;▲P<0.05 vs 1.5 g·L－1 TUDCA;●P<0.05 vs 2.5 g·L－1 TUDCA.

Inhibitory rate of proliferation Group 24 h 48 h 0 g·L－1 TUDCA 38.50±5.43 46.91±1.03*0.5 g·L－1 TUDCA 27.07±5.47△40.08±3.62*△1.0 g·L－1 TUDCA 21.03±4.09△#32.49±5.15*△#1.5 g·L－1 TUDCA 11.22±1.47△#○19.95±1.19*△#○2.5 g·L－1 TUDCA 21.17±4.35△▲39.43±1.05*#▲5.0 g·L－1 TUDCA 35.78±5.37▲●43.98±5.31*▲●

2.6 各組SVOG 細(xì)胞凋亡率Annexin Ⅴ-FITC/PI 法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示：與對(duì)照組（2.73%±0.14%）比較，作用48 h 后，睪 酮 組（1.0×10－5mol·L－1） SVOG 細(xì) 胞 凋 亡 率（53.88%±1.38%） 升高（P<0.05）；與睪酮組比較，睪酮+氟他胺組（14.94%±0.75%）和睪酮+TUDCA 組（40.07%±1.08%） SVOG 細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 作用48 h 后各組SVOG 細(xì)胞凋亡率Fig.1 Apoptotic rates of SVOG cells after treated for 48 h

2.7 各 組SVOG 細(xì) 胞 中XBP1s、ATF4、CHOP 和DR5 mRNA 表達(dá)水平作用48 h 后，與對(duì)照組比較，睪酮組SVOG 細(xì)胞中XBP1s、ATF4、CHOP和DR5 mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（P<0.05）；與睪酮組比較，睪酮+氟他胺組和睪酮+TUDCA組SVOG 細(xì) 胞 中XBP1s、ATF4、CHOP 和DR5 mRNA 表達(dá)水平降低（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 作 用48 h 后 各 組SVOG 細(xì) 胞XBP1s、ATF4、CHOP 和DR5 mRNA 表 達(dá) 水 平Fig.2 Expression levels of XBP1s, ATF4, CHOP,and DR5 mRNA in SVOG cells in various groups after treated for 48 h

3 討 論

PCOS 是一種與代謝和內(nèi)分泌異常相關(guān)的綜合征，高雄激素血癥是其關(guān)鍵特征之一［15］。目前認(rèn)為引起PCOS 患者排卵障礙及內(nèi)分泌改變的病理基礎(chǔ)為原發(fā)性和內(nèi)在性卵泡生長(zhǎng)異常，而顆粒細(xì)胞的凋亡是卵泡發(fā)育異常的主要誘因［2］。除了死亡受體途徑和線粒體途徑外，ERS 啟動(dòng)的凋亡途徑亦參與顆粒細(xì)胞的凋亡［16］。ER 是體內(nèi)合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所，參與體內(nèi)多種代謝［17］，在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起重要作用［18-19］。當(dāng)受到外在或內(nèi)源性刺激時(shí)，其功能紊亂會(huì)使未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白在ER 中聚集，激發(fā)ERS，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［20］。本研究結(jié)果顯示：睪酮處理后，SVOG 細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，異型細(xì)胞增多，胞質(zhì)中出現(xiàn)較多顆粒，培養(yǎng)基中細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率增加，而AR 拮抗劑氟他胺和ESR 拮抗劑TUDCA 均可拮抗睪酮誘導(dǎo)的SVOG 細(xì)胞凋亡；睪酮可上調(diào)SVOG 細(xì)胞中UPR 基因XBP1s、ATF4、CHOP 和DR5 mRNA 表達(dá)水平。上述結(jié)果表明：睪酮在體外通過(guò)與AR 結(jié)合，激活CHOP-DR5 通路，誘導(dǎo)ERS，促進(jìn)SVOG 細(xì)胞凋亡。既往研究［5-7］顯示：ERS 發(fā)生在卵巢細(xì)胞中，影響卵母細(xì)胞成熟、卵泡形成和排卵過(guò)程。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究［21］顯示：ERS 會(huì)損害蛋白質(zhì)分泌、線粒體活性和卵母細(xì)胞發(fā)育能力。PCOS 小鼠模型中，雙氫睪酮可在顆粒細(xì)胞和卵丘復(fù)合物中激活ERS，但在卵母細(xì)胞中并不能激活ERS［22］，高雄激素血癥導(dǎo)致卵丘細(xì)胞功能障礙，間接損害了PCOS 患者的卵母細(xì)胞能力。本研究結(jié)果顯示：睪酮處理后SVOG 細(xì)胞中CHOP 和DR5 mRNA 表達(dá)水平升高，表明睪酮誘導(dǎo)的SVOG 細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)CHOP-DR5 途徑實(shí)現(xiàn)的，但是否存在除CHOP 外的UPR 基因參與誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡，以及是否存在睪酮誘導(dǎo)的CHOP 能夠激活內(nèi)在通路尚未確定，還需進(jìn)一步研究。本研究采用TUDCA 并未完全逆轉(zhuǎn)睪酮誘導(dǎo)的CHOP 和DR5 mRNA 表達(dá)水平升高，其原因可能是研究中檢測(cè)ERS 相關(guān)基因時(shí)TUDCA 使用濃度不足。研究［9］顯示：顆粒細(xì)胞中ERS 激活情況依賴于卵泡發(fā)育時(shí)期，其僅在竇卵泡期的顆粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。故本研究采用的SVOG 細(xì)胞在一定程度上不能完全反映卵泡不同發(fā)育時(shí)期的顆粒細(xì)胞特征，具有局限性。

ERS 在機(jī)體內(nèi)廣泛存在，通過(guò)調(diào)整蛋白質(zhì)折疊功能，參與調(diào)控機(jī)體各項(xiàng)病理生理變化，包括炎癥和葡萄糖毒性損傷［23-24］。PCOS 病理特征除高雄激素血癥外，還包括胰島素抵抗和慢性炎癥，均有可能通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)源性雄激素產(chǎn)生，間接激活ERS［25］。研 究［26］顯 示：PCOS 患 者 卵 巢 組 織 中CHOP 和DR5 表達(dá)上調(diào)不僅出現(xiàn)在顆粒細(xì)胞中，在卵泡膜細(xì)胞中也可檢測(cè)到。由于卵巢組織中雄激素合成主要發(fā)生在卵泡膜細(xì)胞中，需進(jìn)一步研究確定卵泡膜細(xì)胞中的ERS 情況，可能為PCOS 發(fā)病機(jī)制探索提供新的思路。另有研究［10］顯示：ERS抑制劑可有效降低顆粒細(xì)胞凋亡率，減少PCOS 卵巢間質(zhì)纖維化，但并不能改善發(fā)情期和減少卵巢內(nèi)囊泡數(shù)量。但目前尚無(wú)一種PCOS 動(dòng)物模型可以完全模擬其病理變化，未來(lái)可能需要研究一種新型PCOS 動(dòng)物模型，在不誘導(dǎo)類固醇合成的情況下自然發(fā)展為PCOS 表型，以研究下調(diào)ERS 是否有助于改善代謝特征以及卵巢病理，最終改善或治療PCOS。

綜上所述，睪酮可誘導(dǎo)人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，并引起卵泡閉鎖，其作用機(jī)制可能是雄激素與AR 結(jié)合激活CHOP-DR5 通路，誘導(dǎo)ERS 發(fā)生，促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。該研究結(jié)果可能為PCOS 的診療提供新的研究思路和藥物治療靶點(diǎn)。