人參皂苷Rh2 對糖尿病腎病變大鼠腎損傷的保護作用及其機制

曲 萌, 姜雨竹, 黃 睿, 馬振卓, 夏吉辰, 張 媛, 董志恒

（1.北華大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，吉林 吉林 132013；2.北華大學基礎醫(yī)學院病理學教研室，吉林 吉林 132013；3.吉林省吉林市人民醫(yī)院影像中心，吉林 吉林 132012）

作為導致終末期腎功能衰竭的主要致因，糖尿病腎病變（diabetic kidney lesions，DKL） 始終是研究熱點。腎組織進行性纖維化是DKL 的主要病理形態(tài)變化［1］，而該病理過程在晚期很難逆轉，并且對臨床治療也存在著一定耐藥性。目前簡單控制血糖（blood glucose，BG）、血脂或聯(lián)合用藥均無法有效緩解或逆轉DKL，阻止其發(fā)展為終末期腎功能衰竭，且可發(fā)生低BG、組織水腫和酸中毒等不良反應，因此，從天然資源中尋求安全、有效的抗DKL 藥物是當前亟待探索和解決的問題。多種細胞信號傳導通路參與介導腎臟纖維化的進程，其中轉化生長因子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）是促進腎臟纖維化的重要因子。TGF-β1可通過激活下游Smads 依賴或非依賴途徑誘導細胞外基質（extracellular matrix，ECM） 合成，抑制膠原纖維降解。腎病患者的尿液和組織標本中的TGF-β1 水平明顯升高，并與其纖維化程度呈正相關關系。研究［2］顯示：TGF-β1 抑制劑、中和抗體和基因敲除等均可減輕小鼠腎臟纖維化。人參富含多種有效成分（多糖、皂苷、蒽醌、黃酮類和揮發(fā)油等），具有降BG、抗氧化和抗腫瘤等多種活性。研究［3-4］顯示：人參漿果和紅參提取物能夠降低胰島素抵抗，促進胰島素分泌，增強胰島素敏感性，進而改善2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）小鼠的癥狀和預后。紅參油可通過誘導血紅素加氧酶1 表達增強代謝組織抗氧化而發(fā)揮抗DM 作用［5］。研究［6-7］顯示：黑參提取物能夠通過上調肌肉和肝臟組織中葡萄糖轉運蛋白（glucose transporter，GLUT）2 和GLUT4 表達，抑制糖異生，增強外周組織對葡萄糖的攝取，降低BG，改善T2DM。但人參皂苷Rh2 對DKL 大鼠腎損傷的保護作用及其機制尚未明確。本研究以DKL 大鼠為研究對象，觀察人參皂苷Rh2 對DKL 大鼠腎損傷的保護作用，同時基于TGF-β1/Smads 信號通路探討人參皂苷Rh2 改善DKL 大鼠腎損傷的可能機制，以期為DKL 的臨床防治提供新的靶標，并為進一步開發(fā)人參及其有效活性成分的藥效和藥物機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器40 只健康雄性SD 大鼠（6 周齡，清潔級） 購自長春億斯實驗動物技術有限責任公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）2018-0007，體質量180～220 g。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自美國Sigma 公司，人參皂苷Rh2（純度為98%）購自上海弘順生物科技有限 公 司， 美 國 化 學 摘 要 服 務 社 （Chemical Abstracts Service，CAS）號：78214-33-2，血肌酐（serum creatinine， Scr）、 尿 素 氮 （blood urea nitrogen，BUN） 和24 h 尿 蛋 白（urinary protein，UP） 水平檢測試劑盒均購自南京建成生物公司，酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒購自武漢博士德生物工程公司，鼠抗TGF-β1 抗體、Smad3 抗體、Smad7 抗體和羊抗鼠二抗以及DAB 顯色試劑盒均購自美國Santa Cruz 公司，高脂高糖飼料（常規(guī)飼料加入10% 豬油、20% 蔗糖、2.5% 膽固醇和1% 膽酸鈉）購自上海懋康生物科技有限公司。蛋白質電泳分離及轉移裝置購自美國Bio-Rad 公司，凝膠成像系統(tǒng)購自德國Analytikjena 公司。

1.2 大鼠糖尿病模型制備、分組和給藥首先將40 只SD 大鼠適應性喂養(yǎng)1 周，尾靜脈取血，測定BG 水平正常后，隨機選取其中的10 只作為正常對照組，并給予普通飼料喂養(yǎng)，剩余的30 只大鼠用于造模，給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)4 周。造模前大鼠禁食不禁水12 h，一次性腹腔注射STZ（35 mg·kg－1，臨用前溶于0.1 mol·L－1、pH 4.2 無菌檸檬酸鹽緩沖液中），正常對照組大鼠僅腹腔注射等體積檸檬酸鹽緩沖液。72 h 后通過尾靜脈采血，測定BG 水平，空腹BG≥16.7 mmol·L－1，尿糖定性≥?，確定為DM 模型，繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周，收集24 h 尿液，24 h UP≥300 mg·L－1判定為造模成功大鼠。將造模成功的大鼠隨機再分為模型組、低劑量Rh2 組和高劑量Rh2 組，每組各10 只，低劑量Rh2 組 和 高 劑 量 Rh2 組 大 鼠 分 別 給 予10 和20 mg·kg－1Rh2 灌服，每天1 次，正常對照組和模型組大鼠給予等量生理鹽水灌服，連續(xù)8 周，實驗期間所有大鼠均未使用胰島素治療。檢測各組大鼠體質量和腎質量，并計算腎指數(shù)。腎指數(shù)=腎臟質量/體質量。

1.3 全自動分析儀檢測各組大鼠血清Scr、BUN 和24 h UP水平各組大鼠于實驗結束前1 d，稱量體質量后置入代謝籠中，禁食不禁水，收集24 h 尿液，用于檢測UP 水平。于實驗結束時，采用乙醚麻醉后眶后取血，2 000 r·min－1離心10 min，留取血清分裝于Ep 管中，－80 ℃保存，用于檢測Scr和BUN。采用全自動分析儀檢測各組大鼠血清Scr、BUN 和24 h UP 水平，所有檢測步驟嚴格按照試劑說明書進行。

1.4 ELISA 法檢測各組大鼠腎組織中Ⅳ型膠原（collagen type Ⅳ，Col Ⅳ）水平制備腎組織勻漿，離心后收集上清，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書要求操作。檢 測各組大鼠腎組織中Col Ⅳ水平，單位為μg·L－1。

1.5 Western blotting 法檢測各組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad3 和Smad7 蛋白表達水平在低溫條件下提取各組大鼠腎組織中蛋白，采用BCA 法測定蛋白表達水平。各組取50 μg 樣品上樣后，采用10% SDS-PAGE 電泳進行蛋白分離，再將其電轉至PVDF 膜，脫脂奶粉封閉后加入一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入相應二抗，DAB 顯色后應用凝膠成像系統(tǒng)拍照，以β-actin 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平＝目的蛋白條帶灰度值/ β-actin 條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組大鼠體質量、腎臟質量和腎指數(shù)，血清Scr、BUN 和24 h UP 水平，腎組織中ColⅣ水平，腎組織中TGF-β1、Smad3 和Smad7蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠體質量、腎臟質量和腎指數(shù)與正常對照組比較，模型組大鼠體質量明顯降低（P<0.01），腎臟質量和腎指數(shù)均明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，低和高劑量Rh2 組大鼠體質量升高（P<0.05 或P<0.01），腎臟質量和腎指數(shù)降低（P<0.05 或P<0.01）。見表1。

表1 各組大鼠體質量、腎臟質量和腎指數(shù)Tab.1 Body weights, kidney weights, and kidney index of rats in various groups （n=10，±s）

表1 各組大鼠體質量、腎臟質量和腎指數(shù)Tab.1 Body weights, kidney weights, and kidney index of rats in various groups （n=10，±s）

*P<0.01 vs normal control group；△P<0.05，△△P<0.01 vs model group.

Group Normal control Model Rh2 Body weight (m/g)312.58±9.46 181.95±16.61*Kidney weight (m/g)1.04±0.12 1.71±0.29*Kidney index (×10－3)3.36±0.19 8.77±0.56*Low dose High dose 5.45±0.54*△△4.94±0.45*△△208.42±12.49*△224.39±15.27*△△1.32±0.17△1.23±0.11△△

2.2 各 組 大鼠血清中Scr、BUN 和24 h UP 水 平

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中Scr、BUN 和24 h UP 水平明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，低和高劑量Rh2 組大鼠血清中Scr 水平均明顯降低（P<0.01），高劑量Rh2 組大鼠血清中BUN 水平明顯降低（P<0.01），低和高劑量Rh2 組大鼠血清中24 h UP 水平降低（P<0.05 或P<0.01）。見表2。

表2 各組大鼠血清中Scr、BUN 和24 h UP 水平Tab.2 Levels of Scr, BUN ，and 24 h UP in serum of rats in various groups （n=10，±s）

表2 各組大鼠血清中Scr、BUN 和24 h UP 水平Tab.2 Levels of Scr, BUN ，and 24 h UP in serum of rats in various groups （n=10，±s）

*P<0.05，**P<0.01 vs normal control group；△P<0.05，△△P<0.01 vs model group.

Group Normal control Model Rh2 Scr[cB/(μmmol·L－1)]53.81±6.61 119.70±13.28**BUN[cB/(μmmol·L－1)]7.39±0.85 19.19±3.84**24 h UP(m/mg)7.18±1.24 28.83±4.67**Low dose High dose 21.19±2.79**△17.74±3.65**△△91.52±10.83**△△81.99±9.91**△△15.83±2.46**12.37±2.56*△△

2.3 各組大鼠腎組織中ColⅣ水平與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織中Col Ⅳ表達水平明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，低和高劑量Rh2組大鼠腎組織中Col Ⅳ表達水平明顯降低（P<0.01）。見表3。

表3 各組大鼠腎組織中ColⅣ水平Tab.3 Levels of Col Ⅳ in kidney tissue of rats in various groups [n=10，±s, ρB/（μg·L－1)]

表3 各組大鼠腎組織中ColⅣ水平Tab.3 Levels of Col Ⅳ in kidney tissue of rats in various groups [n=10，±s, ρB/（μg·L－1)]

*P<0.01 vs normal control group；△P<0.01 vs model group.

Group Normal control Model Rh2 ColⅣ1.80±0.13 3.49±0.22*Low dose 2.73±0.19*△2.35±0.25*△High dose

2.4 各組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad3 和Smad7蛋白表達水平與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織中TGF-β1 和Smad3 蛋白表達水平明顯升高（P<0.01），而Smad7 蛋白表達水平明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，低和高劑量Rh2 組大鼠腎組織中TGF-β1 和Smad3 蛋白表達水平明顯降低（P<0.01），而Smad7 蛋白表達水平明顯升高（P<0.01）。見圖1 和表4。

圖1 各組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad3 和Smad7 蛋白表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of TGF-β1,Smad3, and Smad7 proteins in kidney tissue of rats in various groups

表4 各組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad3 和Smad7 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of TGF-β1, Smad3, and Smad7 proteins in kidney tissue of rats in various groups（n=10，±s）

表4 各組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad3 和Smad7 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of TGF-β1, Smad3, and Smad7 proteins in kidney tissue of rats in various groups（n=10，±s）

*P<0.01 vs normal control group；△P<0.01 vs model group.

Group Normal control Model Rh2 TGF-β1 0.416±0.021 1.312±0.063*Smad3 0.125±0.011 0.756±0.052*Smad7 0.670±0.044 0.295±0.032*Low dose High dose 0.478±0.043*△0.534±0.036*△0.964±0.055*△0.705±0.029*△0.492±0.060*△0.308±0.031*△

3 討 論

DM 慢性并發(fā)癥是造成DM 患者殘疾和死亡的主要因素，其中約有1/3 DM 患者并發(fā)DKL。DKL是DM 常見微血管并發(fā)癥，長期慢性高BG 可造成腎細胞損傷、功能紊亂，導致進行性腎功能障礙，最終造成終末期腎功能衰竭［8-9］。臨床以持續(xù)性蛋白尿、高血壓和腎小球濾過率降低為主要表現(xiàn)，腎組織纖維化為其主要形態(tài)改變。Col Ⅳ屬于基膜膠原，是ECM 的主要膠原組成成分，Col Ⅳ積聚是導致腎組織纖維化的重要病理機制。本研究結果顯示：干預8 周后，DKL 大鼠腎臟質量和腎指數(shù)明顯升高，腎組織中Col Ⅳ水平明顯升高，提示模型組大鼠出現(xiàn)明顯腎臟損傷和腎臟纖維化。模型組大鼠血清中Scr 和BUN 水平明顯升高，24 h UP 水平明顯升高，提示8 周末模型組大鼠出現(xiàn)了明顯腎功能障礙。

人參作為一種干預 DM 的天然藥物，因其不良反應少，多途徑和多靶點等特點受到廣泛關注。人參皂苷是一類糖基化三萜類化合物，為人參的主要活性成分，在紅參中種類最多。研究［10-16］顯示：人參皂苷Rb2 和Rk3 可降低胰島素抵抗，改善糖耐量；人參皂苷Rh1 通過抑制ROS 減輕HK-2 細胞凋亡，抑制細胞凋亡信號通路改善DKL；人參皂苷Re、Rb1 和T19 可調節(jié)糖脂代謝，改善T2DM。本課題組前期研究［17］顯示：發(fā)酵紅參總皂苷可通過調控SIRT1/TGF-β/Smad 信號通路分子表達，抑制高糖誘導大鼠腎小管上皮細胞轉分化，延緩DM腎纖維化。人參皂苷Rh2 為達瑪烷型四環(huán)三萜皂苷，研究［18］顯示：人參皂苷Rh2 可以改善DM 心肌纖維化。本研究結果顯示：給予人參皂苷Rh2 干預后，DKL 模型大鼠體質量明顯升高，腎臟質量和腎指數(shù)均明顯降低，腎組織中Col Ⅳ水平明顯降低，血清中Scr 和BUN 水平明顯降低，24 h UP 水平明顯降低，提示人參皂苷Rh2 可減輕腎纖維化，改善腎功能，對DKL 大鼠腎損傷具有保護作用。

TGF-β1/Smads 信號通路是導致腎臟纖維化的重要途徑。Smad3 是TGF-β1 下游受體調節(jié)型效應因 子，TGF-β1 通 過 與TGF-β 受 體（transforming growth factor- β receptor， TGF- βR） 結 合 招 募Smad3，磷酸化Smad3 通過與Smad4 復合調控靶基因轉錄，引發(fā)膠原啟動子區(qū)域激活，促進細胞外基質（extracellular matrix，ECM） 合 成。研 究［19-20］顯示：Smad3 缺失可明顯減輕DKL 小鼠腎臟纖維化。Smad7 為抑制型Smad，通過與TGF-βR 結合并誘導其降解在TGF-β1/Smads 信號通路中起負反饋作用。研究［21-22］顯示：敲除 Smad7 可促進DKL小鼠腎小球硬化和腎間質ECM 合成，而激活Smad7 基因表達能夠減輕腎臟纖維化，有效改善腎臟功能。本研究結果顯示：DKL 模型大鼠腎組織中TGF-β1 和Smad3 蛋白表達水平明顯升高，Smad7 蛋白表達水平明顯降低，提示DKL 大鼠腎臟的纖維化與TGF-β1/Smads 信號傳導通路激活有關；給予人參皂苷Rh2 干預后，DKL 大鼠腎組織中TGF-β1 和Smad3 蛋白表達水平明顯降低，而在腎組織中Smad7 蛋白表達水平明顯升高，提示人參皂苷Rh2 可通過調節(jié)TGF-β1/Smads 信號通路關鍵因子表達，減輕DKL 大鼠腎纖維化。

綜上所述，人參皂苷Rh2 能夠減輕DKL 大鼠腎損傷，有效改善腎功能，其作用機制可能與人參皂苷Rh2 下調TGF-β1 和Smad3 蛋白表達水平和升高Smad7 蛋白表達水平有關。