2 型糖尿病患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因及其剪接異構(gòu)體的表達水平和臨床意義

王嘉欣, 王珍琦, 張 萱

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 長春130041；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 國家衛(wèi)健委放射生物學(xué)重點實驗室，吉林 長春130021；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院科研部，吉林 長春130041）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus， T2DM）是一種以胰島素分泌不足導(dǎo)致高血糖為特征的嚴重而常見的慢性代謝紊亂性疾病，可導(dǎo)致各種代謝并發(fā)癥，如心腦血管疾病、糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）、腎病和神經(jīng)病變等。國際糖尿病聯(lián)合會 （International Diabetes Federation，IDF）［1］數(shù)據(jù)顯示：2019 年全球糖尿病患病率約為9.3%（4.63 億人），到2030 年將上升 至10.2% （5.78 億 人），到2045 年 將 上 升 至10.9%（7.00 億人）。

近年來，全基因組關(guān)聯(lián)性研究（genome-wide association studies， GWAS）的最新進展已經(jīng)成功揭示了一些與T2DM 遺傳易感性相關(guān)的基因和突變位點。細胞周期蛋白依賴性激酶5 調(diào)節(jié)亞基相關(guān)蛋 白 1 類 似 物 1 （cyclin-dependent kinase 5 regulatory subunit associated protein 1-like 1，CDKAL1）基因是歐洲和亞洲人群中重復(fù)性最強的位點之一。目前已鑒定出CDKAL1 的5 個不同風(fēng)險單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），均來自內(nèi)含子：rs4712523［2］、rs6931514［3］、rs7756992［4］、rs10946398［5］和rs9465871［6］。攜帶CDKAL1 基因SNP 的個體患T2DM 的風(fēng)險較未攜帶者增加2 倍［7］。

糖尿病微血管并發(fā)癥與CDKAL1 基因有密切關(guān)聯(lián)。 在T2DM 患者中發(fā)現(xiàn)了CDKAL1 基因（rs7756992、rs4712527 和rs10946398 位點） 與糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN） 之間的關(guān)聯(lián)［8］，CDKAL1 基 因（rs10946398 和rs7756992 位點）與DR 有關(guān)［9-10］。LIU 等［9］發(fā)現(xiàn)：與無視網(wǎng)膜病變的糖尿病患者比較， DR 患者CDKAL1（rs10946398） 的遺傳變異有顯著差異。上述研究表明： CDKAL1 可能在糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)病中起關(guān)鍵作用。CDKAL1 基因與T2DM 及其并發(fā)癥的關(guān)系多集中于SNP 位點上，而關(guān)于T2DM 患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因表達水平與糖尿病微血管并發(fā)癥關(guān)系的研究較少。本研究采用實時 熒 光 定 量 PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 法探討T2DM 患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因及其2 種mRNA剪接異構(gòu)體CDKAL1-X1 和CDKAL1-X2 表達水平，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2020 年1 月—2021 年3 月在吉林大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的65 例糖尿病患者作為研究對象，患者平均年齡為（45.45±7.49） 歲， 其 中T2DM 無 并 發(fā) 癥 患 者20 例（T2DM 組），DN 患 者23 例（DN 組），DR 患 者22 例（DR 組），并選擇同期在吉林大學(xué)第二醫(yī)院28 名體檢正常者作為健康對照組，平均年齡為（45.70±9.67） 歲。分組標準：T2DM 無并發(fā)癥組，患者無并發(fā)癥史，如DN、DR 和糖尿病周圍神經(jīng)病變等；DN 組，根據(jù)尿微量白蛋白與尿肌酐的比值（albumin/urine creatinine ratio，ACR） 連續(xù)2 次或者2 次以上≥30 mg·g－1的T2DM 患者被診斷為DN，并且通過相關(guān)臨床檢查排除其他腎臟疾??；DR 組，符合《眼科學(xué)》中關(guān)于2 型糖尿病視網(wǎng)膜病變（type 2 diabetic retinopathy，T2DR） 的診斷標準，且經(jīng)眼底和熒光素眼底血管造影檢查確診為 T2DR；健康對照組：身體健康，無糖尿病家族史，空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）<7.0 mmol·L－1，糖化血紅蛋白<6.5%，無特殊用藥史，來源于本院體檢中心的健康體檢者，均簽署知情同意書。各組研究對象年齡和性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 納入和排除標準納入標準：T2DM 診斷標準參照1999 年WHO 糖尿病診斷標準，存在糖尿病癥狀且隨機血漿葡萄糖≥11.1 mmol·L－1或FBG≥7.0 mmol·L－1，或口服葡萄糖耐量試驗2 h 血糖≥11.1 mmol·L－1。排除標準：糖尿病急性并發(fā)癥，如糖尿病酮癥和高滲性昏迷等；高血壓；重度肥胖；原發(fā)性腎病；泌尿系異常、急（慢）性腎炎或腎盂腎炎或尿路感染等引起的蛋白尿和其他腎損害；嚴重心肺及肝臟病變；發(fā)熱；活動后、應(yīng)激和情緒激動者；曾使用腎毒性或影響尿蛋白排泄的藥物和服用過影響血脂、凝血功能及血尿酸代謝的藥物。

1.3 細胞分離和處理上述糖尿病患者和健康對照者均知情同意后，采集其EDTA 抗凝靜脈血5 mL，抗凝血用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，提取總RNA， 采用焦碳酸二乙酯 （diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理的無菌EP管于－80 ℃條件下保存待檢測。

1.4 RT-qPCR 法檢測各組研究對象外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因表達水平按照紅細胞裂解液說明書裂解紅細胞，按照TRIzol 試劑說明書提取總RNA。RNA 濃度和純度檢測：A（260）/A（280）比值為1.8～2.0，以3 μg RNA 為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。CDKAL1 基因表達及其可變剪切異構(gòu)體及GAPHD引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。采用美國Agilent Technologies 公司的RT-qPCR 試 劑 盒（Brilliant ⅡSYBR Green qPCR Master Mix）進行RT-qPCR 反應(yīng)。

表1 RT-qPCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR

總反應(yīng)體系為25 μL： 2× SYBR Green qPCR Master Mix 12.5 μL，Primer mix（上下游引物均為10 mmol·L－1）1 μL，ROX Reference dye 0.375 μL，ddH2O 10.125 μL， cDNA 1 μL。 采 用 美 國Stratagene MX3000P 熒 光 定 量PCR 儀， 采 用Comparative Quantitation 方法進行PCR 擴增，RTqPCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、30 s，95 ℃、20 s，60 ℃、35 s，共45 個循環(huán)；熔解曲線測定95 ℃、1 min ，55 ℃、30 s，95 ℃、30 s， 1 個循環(huán)。以GAPDH 基 因 為 內(nèi) 參 基 因， 采 用2－ΔΔCt法 計 算CDKAL1 基因表達水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組研究對象外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因及其2 種剪接異構(gòu)體CDKAL1-X1 和CDKAL1-X2 表達水平均不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)和四分位數(shù)［M （P25，P75）］ 表示，多組間樣本比較采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

RT-qPCR 法檢測各組研究對象外周血淋巴細胞中CDKAL1、CDKAL1-X1 和CDKAL1-X2 表達水平，以GAPDH 為內(nèi)參。CDKAL1、CDKAL1-X1、CDKAL1-X2 和GAPDH 在T2DM 患者外周 血中均有表達。與健康對照組比較，T2DM 組患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因表達水平升高（Z=4.705，P<0.01），DN 組 和DR 組 患 者 外 周血淋巴細胞中CDKAL1 基因表達水平均升高（Z=－3.199，P=0.001；Z=－4.950，P<0.01）。與健康對照組比較，T2DM 組患者外周血淋巴細胞中CDKAL1-X1 表達水平升高（Z=2.698，P=0.007），DN 組和DR 組患者外周血淋巴細胞中CDKAL1-X1 表達水平升高（Z=－2.508，P=0.012；Z=－2.814，P=0.005），T2DM 組患者外周血淋巴細胞中CDKAL1-X2 表達水平差異均 無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 各組研究對象外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因及其可變剪切異構(gòu)體表達水平Tab.2 Expression levels of CDKAL1 and its splice isomers of subjects in various groups [M(P25,P75)]

與T2DM 組比較，DN 組和DR 組患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因及其可變剪切異構(gòu)體表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；DR 組患者外周血淋巴細胞中 CDKAL1 基因表達水平略高于DN 組（P<0.05），CDKAL1-X1 和CDKAL1-X2表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示：與健康對照組比較，T2DM組患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因和CDKAL1-X1 表達水平升高，而 CDKAL1-X2 表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；DN 組和DR 組患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因表達和CDKAL1-X1表達水平升高，提示其參與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。

CDKAL1 基因位于染色體6p22.3 上，全長為697 948 bp。CDKAL1 基因異常引起胰島素分泌減少［11-12］，在β 細胞功能障礙和易感性的病理生理學(xué)中起關(guān)鍵作用［13-14］。因此，CDKAL1 基因被多項研究［15-18］證實為T2DM 的易感基因，目前已發(fā)現(xiàn)CDKAL1 基因的SNPs 位點1.6 萬個，與T2DM 相關(guān)的SNPs 位于深層內(nèi)含子區(qū)域，因此在中國人群中CDKAL1 基 因 的SNPs 存 在 不 確 定 性［19］。本 文作者發(fā)現(xiàn)：T2DM 組患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因和CDKAL1-X1 表達水平較健康對照組升高，提示CDKAL-X1 在T2DM 中發(fā)揮主要作用。既往國內(nèi)對于T2DM 患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因表達研究較少，研究［20］顯示：在DN 患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因表達水平升高，而國內(nèi)至今尚無關(guān)于CDKAL1 剪接異構(gòu)體的表達水平的研究。ZHOU 等［21］研究發(fā)現(xiàn)一種獨特的CDKAL1 特殊剪接變異，稱為CDKAL1-V1，其可下調(diào)細胞中CDKAL1 基因表達及蛋白翻譯水平，且這種特殊剪接變異體周圍聚集大量與T2DM發(fā)病相關(guān)的SNPs。HOSSEINIPOOR 等［22］檢測到T2DM 患者外周血單個核細胞中晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，Sirt1）和核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）基因表達水平升高，但未檢測出CDKAL1 基因。

本研究結(jié)果顯示：T2DM 患者并發(fā)DN 和DR時，CDKAL1 基因和CDKAL1-X1 表達水平升高。與DN 組比較，DR 組患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因表達水平升高更明顯。研究［20］顯示：DN 患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因表達水平升高，與本研究結(jié)論一致。SHATAF 等［23］研究7 個T2DM 易感基因表達，結(jié)果顯示：WFS1 和NOTCH2 基因表達改變可能在DN 發(fā)生發(fā)展中起作用。本研究結(jié)果顯示：T2DM 微血管并發(fā)癥患者中，T2DM 易感基因CDKAL1 及其剪接異構(gòu)體表達發(fā)生變化。由于血漿樣本較易得，以其為樣本的基因表達研究更多是采用RT-qPCR 法尋找潛在生物標志物，探討T2DM 發(fā)生發(fā)展的機制，但這些機制目前尚不十分明確。血液指標可以反映患者全身代謝情況的變化，但是難以反映腎臟和眼局部病變的代謝情況，且個體差異較大，導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)性差，仍需更多的研究來驗證這些結(jié)論。本研究局限性：尚未討論基因表達與糖尿病患者臨床檢驗指標的關(guān)系；研究的樣本量較少，有待進一步開展大樣本的研究。

本研究針對T2DM 患者外周血淋巴細胞中易感基因CDKAL1 表達及其剪接異構(gòu)體進行初步研究，結(jié)果顯示：T2DM 患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因及其剪接異構(gòu)體CDKAL1-X1 的表達水平較健康對照者升高，證明T2DM 及其并發(fā)癥患者外周血淋巴細胞中易感基因及其剪接異構(gòu)體表達水平不同，本研究結(jié)論可為深入了解T2DM 的發(fā)病機制提供依據(jù)。