基于LC-MS/MS 多反應監(jiān)測技術(shù)的食管鱗狀細胞癌能量代謝物分析

董宇航, 高海霞, 崔曉賓,3, 李 鋒

（1.石河子大學醫(yī)學院病理系，新疆 石河子 832002；2.新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科，新疆烏魯木齊 830011；3.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院病理科，江蘇 南京 210008）

食管癌在全球惡性腫瘤中發(fā)病率為第7 位，死亡率居第6 位［1］。食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是最常見的食管癌組織亞型，主要特征是進行性發(fā)展且預后較差［2］。雖然手術(shù)切除和放化療等綜合治療可以提高患者的生存率，但ESCC 患者的5 年生存率僅為15%～25%［3］。探討ESCC 的差異能量代謝物有助于早期識別ESCC。惡性腫瘤發(fā)展的顯著特征是代謝過程和代謝重編程的改變，因此代謝組學成為近年來研究的熱點之一，代謝失調(diào)已被證明是上消化道腫瘤發(fā)生的基礎。研究［4］顯示：食管癌患者的血清代謝組學（糖酵解、三羧酸循環(huán)、能量代謝和氨基酸代謝）均有變化。研究［5］顯示：食管癌患者多發(fā)生氨基酸、脂肪酸、糖和三羧酸循環(huán)等代謝紊亂。盡管血清代謝物在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但尚未有研究聚焦于ESCC 能量代謝， ESCC 發(fā)生與血清能量代謝物的關系尚未完全闡明。本研究將非靶向代謝組學與靶向代謝組學結(jié)合， 采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 （liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)檢測ESCC 患者和健康志愿者的血清代謝組分， 并采用多反應監(jiān)測（multi-response monitoring，MRM）模式篩選潛在的差異性能量代謝物，尋找異常能量代謝途徑，為闡明ESCC 患者和健康人群之間的能量代謝差異及其本質(zhì)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2021 年3—5 月石河子大學第一附屬醫(yī)院確診的7 例ESCC 患者作為ESCC 組，對照組研究對象為 2021 年 5 月在石河子大學第一附屬醫(yī)院體檢的7 名健康成年人。診斷標準：符合中國國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的食管癌診療規(guī)范（2018 年版）臨床診斷標準，并經(jīng)病理學確診。納入標準：①符合ESCC 的臨床診斷標準的初治患者；②自愿參與研究，并簽署知情同意書。排除標準：①妊娠或哺乳期婦女；②糖尿??；③患有嚴重的血液系統(tǒng)疾病；④存在重要臟器功能損害；⑤存在其他原發(fā)性腫瘤。本研究經(jīng)石河子大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批，倫理學審批編號：KJ2021-057-01。

1.2 主要試劑和儀器

乙酸銨、甲醇和乙腈為能量代謝標準品。質(zhì)譜儀：AB Triple TOF 6600 和5500 QTRAP，Agilent 1290 Infinity LC 超高效液相色譜儀。

1.3 代謝物提取

采集2 組研究對象肘靜脈血，收集血清存放于－80 ℃。4 ℃溶解，血清、甲醇乙腈分別為100 和400 μL，1 min 渦旋混勻，置于－20 ℃冰箱60 min 使蛋白緩慢沉淀，低溫離心20 min 后取上清，冷凍干燥后于－80 ℃保存。檢測時加入 0.1 mL乙腈混勻，離心15 min（14 000 r·min－1）。代謝物等級鑒定：按照2017 年澳大利亞布里斯班代謝組學學會年會上定義的代謝物鑒定可靠性等級［6］進行代謝物的等級鑒定，采用中科新生命本地自建標準品數(shù)據(jù)庫［7-8］搜庫。

1.4 LC-MS /MS 技術(shù)檢測血清代謝物水平

1.4.1 色譜條件 樣品采用Agilent 1290 Infinity LC 的超高效液相色譜系統(tǒng)分離。柱溫25 ℃，流速500 μL·min－1，進樣量2 μL；流 動 相： A 為 水+25 mmol·min－1氨水+和25 mmol·min－1乙酸 銨，B 為乙腈。液相梯度：0～0.5 min，95% B；0.5～7.0 min，95%～65% B；7～8 min，65%～40% B；8～9 min，40% B；9.0～9.1 min，40%～95% B；9.1～12.0 min，95% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件 AB Triple TOF 6600 質(zhì)譜儀采集一級和二級譜圖。電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI） 條件：離子源氣體（ion soursce gas，Gas） 1-60，Gas2-60，源溫度設置為600 ℃，離子噴霧浮動電壓（ionsapary voltage floating，ISVF） 為5 500 V，氣簾氣（curtain gas，CUR）為30。二級質(zhì)譜采用信息依賴采集（information dependent acquisition，IDA） 和high sensitivity 模式獲得。

1.5 MRM 模式靶向篩選差異能量代謝物

1.5.1 色譜條件 流動相：A 為10 mmol·min－1乙酸銨水溶液，B 為乙腈。柱溫45 ℃，流速300 μL·min－1， 進 樣 量2 μL。 液 相 梯 度： 0～18 min，90%～40% B； 18.0～18.1 min， 40%～90% B；18.1～23.0 min，90% B。

1.5.2 質(zhì)譜條件 在負離子模式下，質(zhì)譜分析采用5500 QTRAP 質(zhì)譜儀。ESI 條件：Gas1-45，Gas2-45，source temperature 450 ℃，ISVF-4500 V，CUR-30。MRM 模式檢測待測離子對。

1.6 統(tǒng)計學分析

Wiff 格式的原始數(shù)據(jù)經(jīng) ProteoWizard 轉(zhuǎn)換成mzXML 格式，采用 XCMS 軟件進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。采用Multiquant 軟件分析色譜峰的面積和保留時間，保留時間校正采用能量代謝物質(zhì)標準品。采用Prism 8.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。2 組研究對象血清中代謝物定量值均符合正態(tài)分布，以±s表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 非靶向能量代謝實驗數(shù)據(jù)質(zhì)量評級

2.1.1 總體樣本主成分分析（principal component analysis，PCA） 將收集到的血清樣本和 質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本（由ESCC 組和對照組研究對象血清樣本等量混合制成）提取得到的峰進行 PCA 分析，結(jié)果顯示：QC 樣本在正離子和負離子這2 種模式下均緊密聚集，表示本實驗重復性高。見圖1。

圖1 正（A）和負（B）離子模式下總體樣本的 PCA 分析Fig.1 PCA analysis on overall samples with positive (A) and negative (B) ion modes

2.1.2 QC 樣本Pearson 相關性 對QC 樣本進行Pearson 相關性分析。通常相關性系數(shù)（r）>0.9代表相關性較好。QC 樣本間的r均在0.9 以上，說明本實驗重復性較好。見圖2。

圖2 正（A）、負（B）離子模式 QC 樣本相關性圖譜Fig.2 Correlation maps of QC samples with positive (A) and negative (B) ion modes

2.2 代謝物等級鑒定結(jié)果

主要從相對分子質(zhì)量（誤差<25 ppm）、二級碎裂譜圖、保留時間和碰撞能等方面對代謝物與本地數(shù)據(jù)庫中的信息進行匹配，并鑒定代謝物結(jié)構(gòu)，經(jīng)過人工核對，等級至少為2 級。

2.3 非靶向代謝物鑒定數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果

正和負離子2 種模式合并后共鑒定到266 種代謝物，2 種模式分別鑒定到164 及102 種代謝物。

2.4 偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）模型

通過PLS-DA 模型，可以從數(shù)據(jù)集中篩選出與分組相關的差異代謝物，區(qū)分2 組樣本。在正、負離子模式下ESCC 組和對照組樣本均有一定的區(qū)分度，提示2 組血清樣本存在代謝差異。見圖3。

圖3 正（A）和負（B）離子模式 PLS-DA 得分圖Fig.3 Diagrams of PLS-DA scores with positive (A) and negative (B) ion modes

模型 Q2>0.5，可靠；0.3< Q2≤0.5，較好；若Q2<0.3，可靠性較低。模型評價參數(shù)結(jié)果顯示：正離子模式Q2=0.768，穩(wěn)定可靠，負離子模式Q2=0.478，穩(wěn)定性較好。見表1。

表1 PLS-DA 模型參數(shù)Tab.1 PLS-DA model parameters

2.5 正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）模型

OPLS-DA 模型結(jié)果顯示：在正、負離子模式下ESCC 組和對照組均具有一定的區(qū)分度，提示2 組血清樣本存在代謝差異。見圖4 和表2。

表2 PLS-DA 模型參數(shù)Tab.2 PLS-DA model parameters

圖4 正（A）和負（B）離子模式下OPLS-DA 得分圖Fig.4 Diagrams of OPLS-DA scores with positive (A) and negative (B) ion modes

2.6 單變量統(tǒng)計分析

對代謝物進行差異分析時基于單變量分析。采用火山圖對變異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C） < 0.05或 FC>1.50 的差異代謝物可視化展示見圖5。

圖5 正（A）和負（B）離子模式火山圖Fig.5 Volcano maps with positive (A) and negative (B) ion modes

2.7 非靶向代謝物化學分類

根據(jù)非靶向代謝物的化學分類歸屬將鑒定到的 266 種代謝物進行分類，可見脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子在有化學分類歸屬的代謝物中占比最高，為18.421%。見圖6。

圖6 代謝物在各化學分類中占比圖Fig.6 Diagram of proportions of metabolites in each chemical classification

2.8 靶向能量代謝物穩(wěn)定性評價

通過QC 樣本評價靶向能量代謝實驗的重復性和穩(wěn)定性。計算代謝物在QC 樣本中的相對標準偏差（relative standard deviation， RSD）。 RSD<30%說明本實驗所測能量代謝物在樣本中的數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。見圖7。

圖7 QC 樣 本 的RSD 分 布Fig.7 RSD distribution of QC samples

2.9 2 組血清樣本中能量代謝物水平

檢測氧化磷酸化、糖酵解和三羧酸循環(huán)過程中的重要能量代謝物。以P<0.05 為標準，通過MRM 技術(shù)篩選 ESCC 組和對照組研究對象血清樣本中差異能量代謝物。見表3。顯著性差異能量代謝物有環(huán)磷腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、L-蘋果酸和異檸檬酸3 種。

表3 MRM 技術(shù)篩選能量代謝物Tab.3 Energy metabolites sreened out by MRM technology

MRM 技術(shù)檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，ESCC 組患者血清中cAMP 水平降低，而L-蘋果酸和異檸檬酸水平升高（P<0.05），其他能量代謝物水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖8。

圖8 能量代謝物表達量趨勢圖Fig.8 Trend diagrams of expression amounts of energy metabolites

2.10 顯著性差異能量代謝物聚類分析結(jié)果

差異能量代謝物聚類熱圖顯示：ESCC 組和對照組研究對象能量代謝物存在差異。見圖9。

圖9 差異能量代謝物層次聚類熱圖Fig.9 Hierarchical clustering heat map of differential energy metabolites

2.11 差異能量代謝物京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析

采用MetaboAnalyst 在線網(wǎng)站對差異代謝物進行KEGG 信號通路富集分析確定受到能量代謝影響的通路有三羧酸循環(huán)和Warburg Effect 通路。見圖10。

圖10 差異能量代謝物KEGG 信號通路富集分析Fig.10 KEGG signaling pathway enrichment analysis on differential energy metabolites

3 討 論

代謝組學能夠更準確、更直接地反映生命體的變化［9］。從檢測方式上，代謝組學主要分為非靶向分析和靶向分析2 類。非靶向分析模式通常適合項目前期的基礎研究，能夠?qū)颖局械母黝惔x物進行無偏向、大規(guī)模和系統(tǒng)性檢測；靶向分析模式通常用于對目標代謝物進行目的性的檢測以及對非靶向代謝組篩選到的差異代謝物進行驗證。

本研究收集7 例ESCC 患者和7 名健康志愿者血清，鑒定樣本中代謝物的結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：正和負離子模式合并后鑒定到266 種代謝物。單變量統(tǒng)計分析結(jié)果顯示：ESCC 組和對照組研究對象血清代謝物存在顯著差異，且脂類分子在有化學分類歸屬的代謝物中占比最高。有研究通過LC-MS/MS技術(shù)確定甘油磷脂代謝是與ESCC 發(fā)生發(fā)展相關的輔因子［10］。氨基酸是癌癥中最常改變的代謝物，其與癌癥患者氧化代謝、糖異生和能量產(chǎn)生增加有關［11］。脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子是人體產(chǎn)能的三大營養(yǎng)素之一，因此本研究進一步對血清能量代謝物進行靶向代謝組學分析，從三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化和糖酵解過程中的重要代謝物中篩選出3 種差異能量代謝物。本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，ESCC組研究對象血清中L-蘋果酸和異檸檬酸水平升高，cAMP 水平降低。L-蘋果酸和cAMP 是氧化磷酸化途徑的重要代謝物，異檸檬酸與三羧酸循環(huán)相關。將這3 種差異性能量代謝物通過KEGG 通路富集分析， 結(jié)果顯示： 其顯著富集在三羧酸循環(huán)和Warburg Effect 通路。

ESCC 組織中L-蘋果酸和異檸檬酸表達上調(diào)。L-蘋果酸是生物體代謝過程中所產(chǎn)生的重要有機酸。在微生物中，其與多條重要的代謝途徑有關，出現(xiàn)于三羧酸循環(huán)及其支路乙醛酸循環(huán)中［12］。L-蘋果酸是生物體細胞內(nèi)存在的一種活性物質(zhì)，易于吸收，可以迅速通過細胞膜，進入線粒體內(nèi)可直接參與能量代謝［13］。異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）可催化異檸檬酸變成α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG） 以及可逆過程的還原羧化［14］。野生型IDH1 和IDH2 可以催化異檸檬酸的氧化脫羧，從而產(chǎn)生α-KG 和CO2［15］。迄今為止，多數(shù)關于IDH 在癌癥中的研究都集中在其突變狀態(tài)［16］。研究［17］顯示：與癌癥相關的IDH1 突變也導致催化異檸檬酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸的能力“簡單”喪失，從而導致異檸檬酸在體內(nèi)堆積。本實驗研究結(jié)果與上述研究結(jié)論一致，ESCC 異檸檬酸水平明顯升高。

三羧酸循環(huán)是能量代謝最為重要的途徑之一，其中間產(chǎn)物都被驗證可在腫瘤中發(fā)揮某些非代謝的功能［18］。研究［19］顯示：癌細胞利用三羧酸循環(huán)的方式不同于正常細胞，這使得癌細胞可能對三羧酸循環(huán)中重新編程的代謝途徑的抑制劑更敏感。另一項研究［20］顯示：某些癌細胞嚴重依賴三羧酸循環(huán)來產(chǎn)生能量和合成大分子。因此，探討ESCC 與三羧酸循環(huán)或其中間代謝產(chǎn)物的關系可能為ESCC 的靶向治療提供有效策略。

正常細胞依靠線粒體氧化磷酸化供能。但在氧氣充足的情況下，癌細胞也更依靠無氧糖酵解而非氧化磷酸化來產(chǎn)生能量［21-22］。糖酵解通量的增加是腫瘤細胞的代謝策略，以確保細胞在營養(yǎng)缺乏的環(huán)境中存活和生長。Warburg Effect 通路可能是一個適應性代謝的過程，其發(fā)生是為了避免當細胞被供給 大 量 葡 萄 糖 時 糖 酵 解 停 止［23］。研 究［24］顯 示：Warburg 效應促進了許多導致耐藥性的腫瘤特征，包括增加的藥物流出和DNA 損傷修復、藥物的代謝失活、表觀遺傳改變、藥物靶標的突變、存活途徑的激活和逃避細胞死亡。此外，Warburg Effect通 路 可 降 低 人ESCC 細 胞 對5-FU 的 敏 感 性［25］。Warburg Effect 通路可能對ESCC 能量代謝發(fā)揮關鍵作用。

本課題組采用非靶向代謝組學方法對 ESCC 患者和健康志愿者血清代謝物進行分析，檢測結(jié)果顯示：在有化學分類歸屬的代謝物中占比最高的代謝物是脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子，因此聚焦于能量代謝?；贛RM 技術(shù)進一步篩選ESCC 組和對照組研究對象血清中差異能量代謝物，KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)3 種差異性能量代謝物富集在三羧酸循環(huán)和Warburg Effect 通路。本研究結(jié)果為指導能量代謝物在ESCC 早期診斷中的應用提供了依據(jù)。