Fah－/－Rag2－/－IL2Rg－/－小鼠肝臟原位異種重建模型的建立及其評價

張 蒙, 周 琪, 胡 正

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院器官再造與移植教育部重點實驗室，吉林 長春130061）

原位肝移植是急性或晚期肝衰竭患者的最終治療方法，但受到成本高昂、手術(shù)復(fù)雜和供體肝臟缺乏等問題阻礙［1］。與全肝臟移植比較，肝細胞移植具有一定的優(yōu)越性，包括低致死率、低耗費和技術(shù)可行，有克服器官短缺的可能性及臨床應(yīng)用的潛能。然而，臨床肝細胞移植的發(fā)展仍然受到可用供肝的稀缺性和原代人肝細胞不易在體外擴增的限制。為了克服上述問題，研究者［2-3］成功地異種移植了豬肝細胞。因為人類與豬的生理學(xué)方面有相容性［4］，豬肝細胞可能是異種細胞移植的最佳來源，但原代豬肝細胞培養(yǎng)物在體外較難生長、壽命較短，且其失去表型表達和總細胞色素P450 蛋白［5］。目前已有研究［6-8］顯示：成功解決人肝細胞相關(guān)問題的肝重建模型小鼠有uPA-SCID 小鼠和TKNOG 小鼠等。但二者都有其固有缺陷：如uPASCID 小鼠有無法控制的嚴重肝損傷、低纖維蛋白血癥及其引起的腎功能損傷和出血傾向，導(dǎo)致小鼠極易夭折，需要早期移植，不適合進行長期研究，uPA 和SCID 基因均存在自發(fā)恢復(fù)的風(fēng)險；單純皰疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus thymidine kinase，HSVTK） 具有生殖毒性，可導(dǎo)致TKNOG 雄性小鼠不育， 繁殖效率低且繁瑣。Fah－/－Rag2－/－IL2Rg－/－（FRG） 小 鼠 擁 有 可 控 的肝損傷且不伴發(fā)其他系統(tǒng)病理改變，因此生殖效率高，移植窗口寬，壽命長。本研究首次在FRG 小鼠肝臟原位重建豬肝細胞，將豬肝細胞通過脾臟注射移植給FRG 小鼠，觀察豬肝細胞在FRG 小鼠體內(nèi)的長期擴增情況，探討無細胞免疫排斥條件下異種肝細胞植入和再生能力，為人源化小鼠模型的制備提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器雄性8 周齡FRG小鼠（中國科學(xué)院動物研究所李偉老師贈送），動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2017-0001，飼養(yǎng)于吉林大學(xué)人類疾病動物模型國家地方聯(lián)合工程實驗室實驗動物中心。出生后一直喂養(yǎng)16 g·L－14-羥基苯丙酮酸雙加氧酶抑制劑2-（2-硝基-4-三氟甲基苯甲?；?1，4-環(huán)己二酮［2-2-nitro-4-（trifluoromethyl）cyclohexane-1，3-dione，NTBC］。實驗巴馬小型豬采用常規(guī)動物飼養(yǎng)方式喂養(yǎng)，按照《實驗動物許可管理辦法》和《實驗動物管理條例》相關(guān)規(guī)定進行實驗。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT） 試劑盒購自南京建成生物工程研究所，威廉姆斯E （William’s E，WE） 培養(yǎng)基購自美國Life 公司，豬白蛋白ELISA 檢測試劑盒購自美國Bethyl 公司， 膠原酶Ⅳ購自美國Gibco 公司，Dispase Ⅱ購自美國Sigma 公司，兔抗延胡索酰乙酰 乙 酸 水 解 酶 （fumarylacetoacetate hydrolase，F(xiàn)AH）多抗克隆抗體購自上海玉博生物科技有限公司。多功能酶標(biāo)儀購自美國BioTek 公司，組織脫水機、組織包埋機和石蠟切片機購自美國Thermo Scientific 公司，倒置光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus 公司，流式細胞儀購自美國BD 公司。

1.2 動物分組和給藥將16 只FRG 小鼠隨機分為對照組、空白對照組、實驗組和GFP 基因?qū)嶒灲M，每組4 只。空白對照組：4 只小鼠停止給予NTBC，監(jiān)測體質(zhì)量。對照組：4 只小鼠注射豬肝細胞，移植前1 周停止給予NTBC，移植后監(jiān)測體質(zhì)量，當(dāng)體質(zhì)量下降20%時，給予NTBC 3 d；實驗組：4 只小鼠注射豬肝細胞，移植前1 周停止給予NTBC，移植后監(jiān)測體質(zhì)量，當(dāng)體質(zhì)量下降20%時，給予NTBC 3 d［9］；GFP 基 因 實 驗 組：4 只小鼠注射攜帶GFP 基因豬肝細胞，移植前1 周停止給予NTBC，移植后監(jiān)測體質(zhì)量，當(dāng)體質(zhì)量下降20%時，給予NTBC 3 d。

1.3 豬肝細胞分離和移植豬肝細胞分離①肝臟部分切除手術(shù)獲取豬肝；②采用蠕動泵采取兩步灌流方式消化分離豬肝細胞；③將分離的豬肝細胞收集至50 mL 離心管中加入WE 培養(yǎng)基；④重復(fù)轉(zhuǎn)速60 G 離心5 min 棄上清后再加入WE，清洗豬肝細胞3 次，灌注液將肝組織中血液沖洗干凈，待肝組織變?yōu)槿辄S色時改換消化液。肝組織呈現(xiàn)膠凍狀時停止灌注，灌注液和消化液使用超純水定容。配置消化灌注液，采用兩步灌注方式［10-11］分離豬肝細胞；⑤臺盼藍染色后采用細胞計數(shù)儀測定豬肝細胞活性和濃度，獲得>90%細胞活力1.7×107mL－1肝臟單細胞懸液用于移植注射；⑥根據(jù)所測濃度和活率配制細胞注射液濃度。豬肝細胞分離實驗流程見圖1。豬肝細胞移植實驗流程：采用異氟烷麻醉移植小鼠，采用鑷子抓住皮膚，在小鼠左側(cè)胸腔下方做1 個長度為0.5 cm 的小切口。打開切口，沿著皮膚切口的同一平面再做1 個長度為0.5 cm 肌肉層切口。小心地用鑷子從切口中夾出脾臟。將針插入脾臟幾毫米處，同時注意不要將針帶出脾臟。采用1 mL 注射器緩慢地將肝細胞注入脾臟以防止其破裂。待壓力平衡后緩慢取針。將脾臟滑回腹腔，重新縫合［12］。實驗組和GFP 基因?qū)嶒灲M小鼠經(jīng)脾臟移植注射70 μL 豬肝細胞懸液［13］，肝細胞數(shù)約為1.2×106個。對照組小鼠經(jīng)脾臟注射70 μL 生理鹽水。

圖1 豬肝細胞分離實驗流程Fig.1 Experimental process for separation of porcine hepatocytes

1.4 各組小鼠血清中ALT 水平檢測37 ℃條件下，ALT 與丙氨酸和α-酮戊二酸反應(yīng)生成丙酮酸及谷氨酸。反應(yīng)30 min 后加入2，4-二硝基苯肼（2，4-dinitrophenylhydrazine，DNPH） 鹽酸溶液，既終止反應(yīng)又相互作用生成丙酮酸苯腙。苯腙在堿性條件下呈紅棕色。于510 nm 波長處檢測吸光度（A）值并計算酶活力。根據(jù)標(biāo)準品濃度值和A 值繪制標(biāo)準曲線，再根據(jù)標(biāo)準曲線計算各組小鼠血清中ALT 表達水平。

1.5 流式細胞術(shù)檢測各組小鼠外周血中CD19+、CD3+和NK1.1+細胞表達情況按照流式細胞檢測試劑盒說明書，檢測各組小鼠外周血中CD19+、 CD3+ 和NK1.1+ 細 胞 表 達 情 況，CD19+ 表達情況反映B 淋巴細胞表達情況，CD3+ 表達情況反映T 淋巴細胞表達情況，NK1.1+表達情況反映NK 細胞表達情況。

1.6 各組小鼠血清中豬白蛋白表達水平檢測移植后第0、2、4、6、8 和10 周，采集實驗組和GFP 基因?qū)嶒灲M小鼠尾靜脈血（每次80 μL）并制備血清。根據(jù)試劑說明書，采用豬白蛋白ELISA檢測試劑盒檢測血清中豬白蛋白水平。根據(jù)標(biāo)準品的濃度和A 值繪制標(biāo)準曲線，根據(jù)標(biāo)準曲線計算血清中豬白蛋白表達水平。將血清稀釋10～1 000 倍，以獲得符合標(biāo)準曲線線性范圍［14］。

1.7 各組小鼠豬肝細胞再生效率檢測在移植后第10 周處死實驗組和GFP 基因?qū)嶒灲M小鼠，取肝組織。肝組織樣本置于4%中性緩沖多聚甲醛中固定過夜，執(zhí)行組織脫水機程序，采用組織包埋機石蠟包埋，采用石蠟切片機4 μm 厚度切片，置于載玻片上。切片進行HE 染色和免疫組織化學(xué)染色。采用免疫顯色試劑盒進行免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色試劑盒采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶和底物色素混合液測定細胞及組織中的抗原。免疫組織化學(xué)染色時，脫蠟和再水化的載玻片參照一抗說明書進行。冷卻至室溫后采用羊血清在磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 中堵塞。載玻片與稀釋的一抗免抗FAH 多克隆抗體（1∶500）于4 ℃孵育過夜。DAB 顯色試劑盒顯色。深色Fah+陽性細胞即為豬肝細胞，以細胞簇形式擴增。采用ImageJ 軟件計算Fah+面積比，確定豬肝細胞再生效率。每只小鼠取3～5 個肝區(qū)進行分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用 GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組小鼠體質(zhì)量、血清中ALT 水平、各組小鼠肝細胞中Fah+面積比和血清中豬白蛋白表達水平符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 豬肝細胞分離后形態(tài)表現(xiàn)與剪碎后再以膠原酶消化組織細胞的方式比較，兩步灌注法消化過程更溫和、對細胞損傷更小，細胞活性可以達到92%，豬肝細胞分離后形態(tài)表現(xiàn)見圖2。

圖2 豬肝細胞分離后形態(tài)表現(xiàn)Fig.2 Morphology of porcine hepatocytes after separation

2.2 FRG 小鼠肝損傷模型的建立停止給予NTBC 后，對照組小鼠體質(zhì)量進行性降低（圖3），生命活力逐漸降低。停藥2 周時開始出現(xiàn)弓背、刺毛和體質(zhì)量下降等癥狀。停藥4 周時，生命活力明顯下降、嗜睡。連續(xù)停藥第28 天開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象（圖4）。取停藥4 周的小鼠肝組織進行HE 染色可見肝細胞腫大、胞漿疏松透亮和細胞核溶解等不可逆細胞損傷（圖5）?？瞻讓φ战M小鼠停藥后血清中ALT 水平逐漸升高（圖6），停藥第4 周時血清中ALT 水平為（100±10）U·L－1，為停藥前正常水平的10 倍，說明肝細胞損傷隨著停藥時間的延長而加劇。對照組停藥小鼠重新給予NTBC 后，體質(zhì)量逐漸恢復(fù)至正常水平（圖3）。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：FRG 小鼠外周血中CD19+、CD3+和NK1.1+細胞完全缺失（圖7）。

圖3 停藥不同時間各組小鼠體質(zhì)量Fig.3 Body weights of mice in various groups at different time points after stopping administration

圖4 停藥不同時間各組小鼠生存情況Fig.4 Survival status of mice in various groups at different time points after stopping administration

圖5 各組小鼠肝組織形態(tài)表現(xiàn)Fig.5 Morphology of liver tissue of mice in various groups

圖6 停藥不同時間各組小鼠血清中ALT 水平Fig.6 ALT levels in serum of mice in various groups at different time points after stopping administration

圖7 流式細胞術(shù)檢測各組小鼠外周血中CD19+、CD3+和NK1.1+細胞表達情況Fig.7 Expressions of CD19+, CD3+, and NK1.1+cells in peripheral blood of mice in various groups detected by flow cytometry

2.3 各組小鼠血清中豬白蛋白表達水平未移植小鼠血清中豬蛋白表達水平為0 g·L－1，實驗組小鼠血清中豬白蛋白表達水平持續(xù)升高（圖8），第10 周時達到（1.05±0.67）g·L－1。GFP 基因?qū)嶒灲M小鼠血清中豬白蛋白表達水平數(shù)據(jù)未收集到。

圖8 各組小鼠血清中豬白蛋白表達水平Fig.8 Expression levels of porcine albumin in serum of mice in various groups

2.4 各組小鼠豬肝細胞再生效率實驗組小鼠第10 周免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：未移植小鼠肝組織中未見深色Fah+陽性細胞，移植小鼠肝組織中可見深色Fah+陽性細胞（即為豬肝細胞），見圖9。采用ImageJ 軟件計算Fah+面積比，確定豬肝細胞再生效率為（11±4）%。GFP 基因?qū)嶒灲M小鼠第10 周肝組織中可見同一視野經(jīng)三色激光分別激發(fā)，攜帶GFP 基因豬肝細胞經(jīng)藍色激光激發(fā)呈現(xiàn)綠色熒光，細胞核DAPI 染色后經(jīng)紫色激光激發(fā)呈現(xiàn)藍色，綠色激光激發(fā)排除細胞自發(fā)熒光結(jié)果，確定豬肝細胞再生效率為（10±2）%，見圖10。

圖9 移植前后實驗組小鼠肝組織中Fah+陽性細胞表達情況（FAH 抗體染色，Bar=100 μm）Fig.9 Expressions of Fah+positive cells in liver tissue of mice in experimental group before and after transplantation(FAH antibody staining,Bar=100 μm)

圖10 移植前后GFP 基因?qū)嶒灲M小鼠肝組織中Fah+陽性細胞表達情況Fig.10 Expression of Fah+positive cells in liver tissue of mice in GFP gene experimental group before and after transplantation

3 討 論

目前，肝供求嚴重失衡已成為制約肝移植應(yīng)用的主要瓶頸。雖然肝移植可以恢復(fù)肝功能并提高患者存活率，但供體短缺限制其應(yīng)用。肝細胞移植成為急性肝功能衰竭患者有希望的替代方案［15］。但缺乏捐助者是全球性問題［16］。豬異種肝和肝細胞臨床應(yīng)用仍然是緩解供體短缺的潛在解決方案。研究［17］顯示：經(jīng)移植異種肝細胞后，患者存活率和肝功能恢復(fù)有所改善，異種細胞移植已成為治療肝衰竭的替代方法。異種肝細胞易獲得，豬肝細胞是異種肝細胞的潛在來源，因其與人類生理學(xué)的相似性［4］且具有無限供應(yīng)的優(yōu)勢。但原代豬肝臟細胞培養(yǎng)物較難生長，在體外壽命較短。為解決上述問題，本課題組以FRG 小鼠作為研究對象，探討無細胞免疫排斥條件下豬異種肝細胞植入和再生能力。

研究［18］顯示：通過肝毒性轉(zhuǎn)基因表達或基因敲除，成功地產(chǎn)生了4 種以上小鼠模型，并實現(xiàn)了高效的肝臟人源化。其中，F(xiàn)ah 敲除具有可控的肝損傷和易于操作等優(yōu)勢。為了擴大Fah－/－小鼠模型在異種肝細胞擴增中的應(yīng)用。本課題組前期研究［13，19］通過將Fah－/－小鼠與Rag2 和IL2rg 免疫缺陷小鼠雜交，構(gòu)建了FRG 三重敲除（Fah－/－Rag 2－/－IL2Rg－/－）小鼠。Fah－/－小鼠的肝損傷原理同酪氨酸血癥Ⅰ型的發(fā)病機制。小鼠中Fah 缺失導(dǎo)致酪氨酸代謝最后一步產(chǎn)物分解受阻。有毒代謝產(chǎn)物大量堆積導(dǎo)致嚴重的肝細胞、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)損傷［19-20］。NTBC 可以有效維持Fah－/－小鼠生存［21］。Rag2 和IL2rg 缺失阻止了B 淋巴細胞、T 淋巴細胞和NK 細胞發(fā)育［22］。由于免疫系統(tǒng)的缺陷，F(xiàn)RG小鼠允許人肝細胞的有效繁殖［13，23］。

FRG 小鼠日常飼養(yǎng)過程中， NTBC 阻止Fah缺失后不良代謝產(chǎn)物的堆積從而實現(xiàn)對肝臟自發(fā)損傷的抑制作用，維持FRG 小鼠的正常繁育。而在需要移植異種肝細胞時配合NTBC 撤藥誘導(dǎo)肝損自然發(fā)生，進而通過NTBC 誘導(dǎo)肝損傷。本課題組采用停藥NTBC 方法誘導(dǎo)FRG 小鼠肝損傷，當(dāng)NTBC 停藥時，小鼠體質(zhì)量呈進行性下降。停藥1 周時小鼠活力未見明顯下降，但ALT 和體質(zhì)量變化表明此時小鼠肝組織已經(jīng)開始出現(xiàn)損傷。由于移植肝細胞擴增競爭力低于小鼠本身肝組織再生能力，移植后的3 周停藥期（不會危及小鼠生命）可以繼續(xù)為移植豬肝細胞提供適宜的擴增條件。為保持肝臟損傷環(huán)境與小鼠生命活力之間的平衡，選擇在小鼠體質(zhì)量下降20% 時給予正常劑量NTBC 3 d。重新給予NTBC 后，F(xiàn)RG 小鼠狀態(tài)較快恢復(fù)，從而維持正常生存。

盡管停藥第10 周重建效果時最高達到15%，但相對于10 周人源化肝臟小鼠重建約10%的擴增效率［6，13］仍有待提高。這顯然需要進一步提高異種肝臟重建的效率，更快地構(gòu)建效率有利于后續(xù)實驗的開展，如HBV 感染和藥物代謝［24-25］。至今，人肝細胞異種移植已取得許多階段性的成果。研究［26］顯示：增加移植的人肝細胞數(shù)可以促進高人肝嵌合水平。研究［27］顯示：70%～80%的移植供體肝細胞被肝臟中巨噬細胞清除。與C57BL/6J 菌株上的FRG 小鼠比較，NOD 菌株上的小鼠更快地建立了肝臟人源化［28］，其中信號調(diào)節(jié)蛋白α（signal-regulatory protein α，Sirp α） 與人肝細胞中的CD47 結(jié)合，通過CD47-Sirpα 相互作用降低小鼠巨噬細胞對人肝細胞的吞噬［26］。人類Sirpα 基因敲入可以提高FRG 小鼠人源化肝細胞重建水平。對于異種豬肝細胞同樣可以采用類似的策略改進移植效果。

本實驗成功在FRG 小鼠模型中構(gòu)建了豬-鼠嵌合肝臟模型，證實了豬肝細胞可以在免疫缺陷小鼠體內(nèi)長期定居、擴增并分泌重要功能蛋白。通過觀察豬肝細胞在FRG 小鼠體內(nèi)的擴增效率，進一步探討異種肝臟嵌合模型的生物學(xué)特征，為肝細胞功能和再生研究提供依據(jù)，也為探討人源化肝臟嵌合小鼠的異種肝細胞移植及大型動物模型內(nèi)重構(gòu)異源肝臟細胞提供依據(jù)。