小鼠各期卵母細胞中SGK3 mRNA 和蛋白的動態(tài)表達及其亞細胞定位

何文寧, 馮少青, 龐海垚, 孟 峻

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學臨床檢驗診斷教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

血清和糖皮質(zhì)激素誘導蛋白激酶（serum and glucocorticoid-inducible protein kinase，SGK） 是 一種Ser/Thr 雙重特異性蛋白激酶，與蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）等第二信使蛋白具有極高同 源 性， 且 均 受 磷 脂 酰 肌 醇 -3- 激 酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/磷酸肌醇依賴 性 蛋 白 激 酶 1 （phosphoinositide dependent protein kinase 1，PDK1）信號通路的調(diào)控，廣泛參與真核細胞中基因快速轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和細胞內(nèi)定位調(diào)節(jié)［1-3］。在海星卵母細胞中，SGK 可使細胞分裂周期 因 子25 （cell division cycle protein 25，Cdc25）和髓磷脂轉(zhuǎn)錄因子1 （myelin transcription factor 1，MYT1） 磷酸化， 從而誘導細胞周期蛋白B（Cyclin B，Cdc2） 去磷酸化和激活，導致減數(shù)分裂G2/M 期轉(zhuǎn)換［4］。哺乳動物細胞中存在SGK1、SGK2 和SGK3 亞型。其中SGK3 不同于其他2 種SGK 亞型和Akt 家族：其在N 端有1 個Phox（PX）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涞鞍准っ富钚苑浅Ｖ匾⒇撠煂GK3 靶向于囊泡樣結(jié)構(gòu)和內(nèi)體隔室［5-6］。TESSIER 等［7］研 究 顯 示：在 小 鼠 卵 母 細胞中，SGK3 在核內(nèi)體的特異性定位是其激活的關(guān)鍵，而SGK3 在核內(nèi)體的定位依賴于其PX 結(jié)構(gòu)域和一種Ⅱ類PI3K 酶 （PI3K-C2α）的存在，而不依賴于Ⅰ型PI3K 酶活性，且SGK3 和PDK1 在膜上的共定位不足以觸發(fā)SGK3 的磷酸化和激活。另外，與磷酸化后的Akt 不同，SGK3 一旦被激活就會留在細胞核內(nèi)，而Akt 的活化部位在漿膜，活化后轉(zhuǎn)位至細胞質(zhì)和細胞核［8-9］。DONG 等［10］研究顯示：SGK3 表達缺失會導致足細胞功能障礙和蛋白尿，且在阿霉素腎炎小鼠模型中，SGK3 表達下調(diào)與蛋白尿的嚴重程度呈負相關(guān)關(guān)系。在非洲爪蛙卵母細胞中，SGK3 可通過增加腎上皮細胞膜上鈣通路瞬時受體電位V 型5/6 （transient receptor potential vanilloid 5/6，TRPV5/6） 的數(shù)量而參與腎臟對鈣的重吸收，維持鈣的動態(tài)平衡［11］。研究［9］顯示：SGK3 廣泛地參與調(diào)控細胞增殖、存活、應急和離子轉(zhuǎn)運等多種生物學過程，目前已經(jīng)成為國內(nèi)外研究熱點。但關(guān)于小鼠卵母細胞是否存在SGK3 蛋白激酶、SGK3 和Cdc25B 蛋白在卵母細胞發(fā)育中的作用及SGK3 能否直接或間接激活Cdc2 尚不清楚。本研究以小鼠卵母細胞為研究對象，觀察小鼠卵母細胞中SGK3 蛋白激酶的表達水平和亞細胞定位情況，為哺乳動物卵母細胞早期生長發(fā)育的機制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器3～4 周SPF 級昆明系雌鼠購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK （蒙） 2015-0001。體質(zhì)量17～20 g。孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）（蘇州素仕公司），M16 培養(yǎng)液、MB 培養(yǎng)基和M2 培養(yǎng)液（美國Invitrogen 公司），SGK3 引物和β-actin 引物由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司合成，總RNA 極速抽提試劑盒（上海飛捷生物技術(shù)公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 試劑盒（北京全式金生物技術(shù)公司），SGK3 抗體和β-actin 抗體（美國SantaCruzbio technology 公司），SDS-PAGE 凝膠快速配制試劑盒和預染蛋白Marker （美國Thermo Fisher 公司），細胞裂解液和Hoechst33258染色液（廣州碧云天生物技術(shù)公司），Alexa Fluor 488 標記的驢抗山羊IgG （H+L） （貨號：705-545-147） 和Alexa Fluor 594 標 記 的 驢 抗 兔IgG（H+L）（貨 號： 705-585-152）（美 國Jackson ImmunoResearch 公司），SGK3 抗體（山羊抗兔）（貨號：ab150080）和β-actin 抗體（貨號：ab6276）（美國Abcam 公司）， 增強型化學發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）（美國Piece Biotechnology 公司）。臺式高速離心機（型號：LG16-WA，北京京立公司），高速微量冷凍離心機（型 號： AHCL-FZSW-LXJ-003， 美 國 Thermo Fisher 公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（德國Binder 公司），激光共聚焦掃描顯微鏡（德國Leica公司），HR30-Ⅱ級A2 型生物安全柜（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司），紫外-可見分光光度計（型號：Nano Drop 2000c，美國Thermo Fisher 公司），相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司）， RT-qPCR 儀（型號：CFX96，美國Bio-Rad 公司），垂直玻璃板和轉(zhuǎn)膜槽（北京六一生物科技公司），純水機（廣州天創(chuàng)公司）。

1.2 小鼠卵母細胞的采集和培養(yǎng)取3～4 周齡的SPF 級昆明級雌性小鼠，在明暗交替環(huán)境下喂養(yǎng)3～4 d。于當天13：00 小鼠腹腔內(nèi)注射PMSG（10 IU/只），48 h 后脫頸處死小鼠，剖開腹腔，取出卵巢置于含M2 培養(yǎng)液的平皿上。在體視顯微鏡下撕開卵巢，自然流出卵母細胞團，采用MB 培養(yǎng)液反復吹洗3 次以上去除顆粒細胞，清洗完成即得到完整的生發(fā)泡（germinal vesicle，GV）期裸卵母細胞，計數(shù)收集100 個細胞備用。將收集的GV 期裸卵母細胞移至已預平衡的MB 培養(yǎng)液中，表面覆蓋石蠟油，放入培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分數(shù)為5%、濕度為100%的CO2培養(yǎng)箱中進行體外培養(yǎng)。根據(jù)細胞培養(yǎng)時間和卵母細胞的形態(tài)表現(xiàn)區(qū)分細胞培養(yǎng)程度： ①生發(fā)泡破裂（germinal vesicle breakdown， GVBD） 期卵母細胞。GV 期卵母細胞培養(yǎng)3～4 h 后可獲得；②第1 次減數(shù)分裂 （first meiotic metaphase，M Ⅰ） 期卵母細胞。GV 期卵母細胞培養(yǎng)6～7 h 后可獲得；③第2 次減數(shù)分裂（second meiotic metaphase，MⅡ）期卵母細胞。

每只小鼠腹腔內(nèi)注射10 IU PMSG，48 h 后注射10 IU HCG，15～16 h 處死小鼠，取出兩側(cè)輸卵管，鏡下剖開輸卵管壺腹部自然流出卵團，充分清洗后即可獲得MⅡ期卵母細胞。

1.3 RT-qPCR 法檢測卵母細胞中SGK3 mRNA 表達水平取GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期收集到的卵母細胞各100 個，參照總RNA 極速抽提試劑盒說明書提取各期細胞中mRNA，采用微量紫外分光光度計檢測4 期卵母細胞中mRNA 的吸光度（A）值，若A（260）/A（280）比值在1.8～2.0，說明所提取的mRNA 純度較高、蛋白質(zhì)污染較少，可用作逆轉(zhuǎn)錄實驗。經(jīng)測定本實驗中獲取的各期卵母細胞中mRNA 的A（260）/A（280） 比值均在1.8～2.0，顯示mRNA 純度較高，可用于后期逆轉(zhuǎn)錄PCR 實驗。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，反應體系為20 μL，反應條件：42 ℃、15 min，85 ℃、5 s。根據(jù)試劑盒說明書進行RT-qPCR 反應，引物序列：SGK3（NM_001037759.1），正向引 物5'-TCCCAGCTCTGACGAACACA-3' 和 反向引物5'-TCAAACTCTGCGTATCTCCTGA-3'；β-actin（NM：007393.5），正向引物5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3' 和 反 向 引 物5'-GCCGGACTCATCGTACTCC-3'。 PCR 反 應體系為20 μL，反應條件：94 ℃、30 s，94 ℃、5 s，60 ℃、15 s，45 個循環(huán)；95 ℃、15 s，56 ℃、30 s，95 ℃、15 s，1 個循環(huán)。采用2－△△Ct法計算細胞中SGK3 mRNA 表達水平。

1.4 Western blotting 法檢測小鼠卵母細胞中SGK3 蛋白表達水平分別收集GV、 GVBD、MⅠ和MⅡ期小鼠卵母細胞各200 個。離心機4 ℃、3 000 r·min－1離 心10 min，棄 上 清。加 入50 μL RIPA 蛋白裂解液，反復凍融3 次，每次10 min，使所有卵母細胞完全裂解，離心機4 ℃預冷，12 000 r·min－1離心裂解卵母細胞10 min，棄上清，加入160 μL 細胞裂解液和40 μL 5×loading buffer，100 ℃水浴5～10 min 使蛋白變性，保存于－20 ℃?zhèn)溆谩Ｉ蠘硬⑦M行SDS-PAGE 電泳。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至0.45 μm 硝酸纖維素 （nitrocellulose，NC） 膜上。采用去離子水清洗NC 膜，剪出內(nèi)參蛋白條帶和檢測蛋白條帶，將膜移至盛有封閉液的平皿中，室溫下放置搖床上封閉60 min，TBST 緩沖液清洗3 次，每次10 min。將膜條移入含有SGK3 抗體稀釋液（稀釋倍數(shù)為1∶1 000）中4 ℃孵育過夜，次日室溫下TBST 溶液清洗3 次，每次5 min。將膜條移入含有HRP 偶聯(lián)的羊抗兔IgG 二抗的稀釋封閉液中室溫孵育2 h。將膜條置于按照Western blotting 試劑盒中的A、B 液按照1∶1 比例配制的混合液中，進行后續(xù)的化學發(fā)光顯影成像。SGK3蛋白表達水平=SGK3 蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.5 Western blotting 法檢測SGK3 底物磷酸化情況收集GV、GVBD 和MⅠ不同時期卵母細胞各200 個，經(jīng)胚胎裂解、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecy sulfate-polyacrylamide gel electrophoregram， SDS-PAGE）、轉(zhuǎn)移置NC膜 上， 分 別 采 用 phospho-Cdc25B-pSer30 和nonphospho-Cdc25B-Ser30 抗體檢測Cdc25B-Ser30的磷酸化狀態(tài)和非磷酸化狀態(tài)，采用ECL 法檢測SGK 底物磷酸化狀態(tài)。

1.6 細胞免疫熒光觀察小鼠卵母細胞中SGK3 的亞細胞定位將培養(yǎng)得到GV、GVBD、MⅠ和M Ⅱ期的卵母細胞分別采用含1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 的 磷 酸 鹽 緩 沖 液（phosphate buffer saline，PBS） 洗 滌3 次，每次3 min。室溫下4%多聚甲醛溶液固定30 min，磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered saline with Tween 20，PBST）（即PBS 緩沖液中加入0.01%Tween20）洗滌3 次，每次5 min。在0.1% Triton X-100（溶解于PBS 緩沖液中配制而成） 中打孔10 min，PBST 洗液洗滌3 次，每次3 min，室溫下在含5%BSA 的PBS 緩沖液中封閉40 min。轉(zhuǎn)入SGK3 抗體中4 ℃孵育過夜（SGK3 抗體∶封閉液=1∶1 000稀釋）。次日上午采用0.01 mol PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min。然后加入四甲基羅丹明異硫 氰 酸 酯 （tetramethylrhodamine isothiocyana，TRITC）標記的IgG（稀釋比為1∶500），避光室溫孵育1 h。PBST 洗液洗滌3 次，每次5 min。Hoechst33258（終濃度為20 mg·L－1） 熒光染料染色30 min，使核酸著色，在激光共聚焦掃描顯微鏡下分別于530、488 和260 nm 激發(fā)波長處觀察各期卵母細胞中SGK3 的亞細胞定位及核酸染色情況。

1.7 統(tǒng)計學分析采用GraphPad Prism 9.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。不同細胞周期小鼠卵母細胞中SGK3 mRNA 和蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠卵母細胞中SGK3 mRNA 表達水平在GV、GVBD、M Ⅰ和M Ⅱ期，卵母細胞中均有SGK3 mRNA 表達，表達水平分別為1.00±0.02、2.96±0.09、0.79±0.08 和6.94±0.09。與GV 期比較，GVBD 和M Ⅱ期卵母細胞中SGK3 mRNA表達水平升高（P<0.01）；與GVBD 期 比 較，M Ⅰ期卵母細胞中SGK3 mRNA 表達水平降低（P<0.01），MⅡ期卵母細胞中SGK3 mRNA 表達水平升高（P<0.01）；與MⅠ期比較，MⅡ期卵母細胞中SGK3 mRNA 表達水平升高（P<0.01）。

2.2 小鼠卵母細胞中SGK3 蛋白表達水平Western blotting 法檢測結(jié)果顯示：在小鼠各期卵母細胞中均有SGK3 蛋白表達，且表達趨勢與其mRNA 表達趨勢大致相同。與GV 期比較，GVBD和M Ⅱ期卵母細胞中SGK3 蛋白表達水平升高（P<0.01）；與GVBD 期比較，MⅠ期卵母細胞中SGK3 蛋白表達水平降低 （P<0.01），MⅡ期卵母細胞中SGK3 蛋白表達水平升高 （P<0.01）；與MⅠ期比較，MⅡ期卵母細胞中SGK3 蛋白表達水平升高（P<0.01）。見圖1。

圖1 小鼠各期卵母細胞中SGK3 蛋白表達電泳圖(A)和直條圖(B)Fig.1 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of SGK3 protein in oocytes of mice at different stages

2.3 SGK3 底物磷酸化狀態(tài)Western blotting 法檢測結(jié)果顯示：在GV 期觀測到非磷酸化Cdc25BSer30 條帶，在GVBDHE MⅠ期可見明顯的磷酸化Cdc25B-Ser30 條帶。見圖2。

圖2 小鼠各期卵母細胞中磷酸化和非磷酸化Cdc25B-Ser30 表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of phosphorylated and non-phosphorylated Cdc25BSer30 in oocytes of mice at different stages

2.4 在小鼠各期卵母細胞中SGK3 亞細胞定位情況免疫熒光法檢測結(jié)果顯示：SGK3 （紅色熒光）在GV 期小鼠卵母細胞中定位于細胞核膜，在GVBD 期前進入細胞核，在GVBD 期定位于細胞核，MⅠ期分布于整個細胞，在MⅡ期從細胞漿進入細胞核。見圖3。

圖3 免疫熒光法檢測小鼠各期卵母細胞中SGK3 蛋白亞細胞定位情況 (Bar=20 μm)Fig.3 Subcellular localization of SGK3 protein in oocytes of mice at different stages detected by immunofluorescence(Bar=20 μm)

3 討 論

GV 期和MⅡ期是小鼠卵母細胞發(fā)育成熟過程中必須經(jīng)歷的2 個停滯期，在生殖周期中，部分卵母細胞在激素作用下恢復第一次減數(shù)分裂，其標志是GVBD 期，伴隨著核質(zhì)的成熟，卵母細胞發(fā)育到M Ⅱ期，排卵、進入輸卵管，成為可受精的卵［10-11］。因此，如何超越GV 期阻滯，使卵母細胞恢復減數(shù)分裂，發(fā)生G2/M 期轉(zhuǎn)變對卵母細胞發(fā)育成熟至關(guān)重要［12］。

研究［1］顯示：當細胞暴露于血清或糖皮質(zhì)激素，或者同時暴露于二者時，SGK mRNA 表達水平在30 min 內(nèi)快速升高。目前通過對小鼠、海星和非洲爪蟾等真核生物的研究，證實了SGK3 是細胞磷酸化級聯(lián)反應的中心節(jié)點，具有調(diào)控細胞周期、細胞增殖、細胞凋亡和離子通道等功能［13-15］。細胞周期中分子蛋白表達水平改變是一種重要的細胞調(diào)控方式，研究小鼠卵母細胞中SGK3 表達和定位有助于了解其在G2/M 過渡期中的作用。SGK3在小鼠卵母細胞早期發(fā)育過程中的表達和亞細胞定位目前國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。本實驗從mRNA 和蛋白水平證實了小鼠卵母細胞中存在SGK3 蛋白激酶，即小鼠各期卵母細胞中SGK3 mRNA 均有表達，且表達水平不同，GV 期至GVBD 期SGK3 mRNA 表達水平升高，MⅠ期SGK3 mRNA 表達水平明顯降低且低于GV 期，而M Ⅱ期SGK3 mRNA 表達水平驟然升高，并達到峰值，各期卵母細胞中SGK3 蛋白表達水平趨勢與mRNA 表達水平趨勢基本一致，SGK3 蛋白主要在卵母細胞的GVBD 期和M Ⅱ期表達。在GV 期可見非磷酸化Cdc25B-Ser30 條帶，而在GVBD 期和MⅠ期可見明顯磷酸化的Cdc25B-Ser30 條帶。MⅠ期細胞的恢復是細胞發(fā)育、生長和增殖的重要節(jié)點，GVBD 期細胞中SGK3 蛋白表達水平升高表明其可能參與調(diào)控小鼠MⅠ期卵母細胞的恢復，進而實現(xiàn)G2/M 過渡期的轉(zhuǎn)換。

在減數(shù)分裂過程中，SGK3 蛋白定位的動態(tài)變化與其功能密切相關(guān)，間接免疫熒光實驗檢測結(jié)果顯示：SGK3 在小鼠卵母細胞的GV 期定位于細胞質(zhì)，而在GVBD 期前入核，GVBD 期和MⅠ期定位于整個細胞，在MⅡ期由細胞漿進入細胞核。表明SGK3 可能是通過在細胞核漿穿梭而實現(xiàn)G2/M 過渡期的轉(zhuǎn)換，猜測SGK3 可能參與了CyclinB-Cdc2激活。近年來研究［16-21］表明：SGK3 蛋白在多種腫瘤組織中表達水平較高，在骨肉瘤、腎細胞癌和鼻咽癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，并且與腫瘤細胞的遷移和侵襲呈正相關(guān)關(guān)系，可作為多種腫瘤的潛在標志物和治療靶點。未來研究的重點是確定PI3K-SGK3 信號通路是否參與了Cdc2 的激活。對SGK3 蛋白在小鼠卵母細胞分裂恢復中作用機制的研究，將為哺乳動物卵母細胞早期發(fā)育機制的研究提供依據(jù)。