過表達(dá)FOXO1 的BMSCs 對哮喘模型小鼠肺嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和氣道重構(gòu)的抑制作用及其機(jī)制

何小雙, 徐麗娜, 崔 梅, 辛雯艷

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，新疆 石河子 832008；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院病理科，新疆 烏魯木齊 830001）

哮喘作為一種常見的慢性疾病，是一種以氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重構(gòu)為特征的復(fù)雜炎癥性疾病，接觸常見氣源性過敏原的兒童可能導(dǎo)致哮喘，并發(fā)展持續(xù)至成年［1］。目前，哮喘影響著全球超過3 億人［2］，近年來哮喘的患病率還在急劇增加，現(xiàn)已成為嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病，亟須更有效的治療方法。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs） 是來源于骨髓的一類非造血干細(xì)胞，在組織再生和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。BMSCs 移植已在移植物抗宿主病、糖尿病、血液疾病、多發(fā)性硬化癥、克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎等疾病治療中顯現(xiàn)出良好應(yīng)用前景［3-5］。研究［6-7］顯示：BMSCs 移植可有效改善哮喘患者氣道炎癥程度，逆轉(zhuǎn)氣道重構(gòu)，從而緩解哮喘癥狀?；蚓庉嫺脑煺T導(dǎo)某些分子或旁分泌因子的表達(dá)可以增強(qiáng)BMSCs 治療多種疾病的效果。叉頭轉(zhuǎn)錄因子1（forkhead box transcription factor 1， FOXO1） 是FOXO 家族成員之一，其能夠調(diào)節(jié)各種細(xì)胞反應(yīng)，包括氧化應(yīng)激反應(yīng)、免疫穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡和新陳代謝，F(xiàn)OXO1 還通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮直接作用［8］。研究［9-10］顯示：FOXO1 通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向M2 型極化，從而有效緩解過敏性哮喘患者的炎癥反應(yīng)。此外，F(xiàn)OXO1 激活能夠調(diào)控BMSCs 向炎癥抑制方向發(fā)展。目前FOXO1 介導(dǎo)的BMSCs 在哮喘疾病中的作用尚不清楚。本研究采用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）和霧化激發(fā)的方法制備小鼠哮喘模型，將經(jīng)過FOXO1 基因編輯的BMSCs 作用于哮喘小鼠，觀察小鼠肺部病理形態(tài)表現(xiàn)和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤情況及FOXO1 對氣道重構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑和儀器45 只清潔級BALB/c 雌性小鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量為20～22 g，由新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2021-0001。小鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動物飼養(yǎng)籠內(nèi)，溫度為22 ℃～25 ℃，相對濕度為40%～60%，通風(fēng)良好，光照/黑暗各12 h 交替，期間正常飲水?dāng)z食，所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、氫氧化鋁、胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、DMEM培養(yǎng)液和嘌呤霉素（美國Sigma 公司），成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)科技有限公司），油紅O 染色和茜素紅染色（北京索萊寶科技公司），TRIzol 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量檢測試劑盒（日本TaKaRa 公司），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA） 裂解液、聚偏二氟乙烯［poly（vinylidene fluoride）， PVDF］ 膜、 增 強(qiáng) 型 化 學(xué) 發(fā) 光 試 劑（enhanced chemiluminescence， ECL） 試 劑 液 和4'， 6- 二 脒 基-2- 苯 基 吲 哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染料（上海碧云天生物研究所），HE 染色液（沈陽萬類生物科技有限公司），熒光防淬滅封片劑（上海歌凡生物科技有限公司）。攜帶FOXO1 基因的重組慢病毒及其陰性對照重組慢病毒由生工生物工程（上海） 股份有限公司構(gòu)建，并完成包裝和滴度測定等步驟。FITC 標(biāo)記的CD29、CD34、CD44、CD45、CD71、人 類 白 細(xì)胞Ⅱ類抗原（human leukocyte class Ⅱ antigen-DR，HLA-DR）、 基 質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶 9 （matrix metalloprotein-9，MMP-9 ）、基質(zhì)金屬蛋白酶12（matrix metalloprotein-12，MMP-12 ）、基質(zhì)金屬蛋 白 酶 抑 制 劑 1 （tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）、GAPDH、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 和異硫氰酸熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG（英國Abcam公司）。實(shí)時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 儀（美 國Applied Biosystems 公司），光學(xué)顯微鏡（德國Leica 公司），DYY-6B 型穩(wěn)壓流轉(zhuǎn)移電泳儀（北京市六一儀器廠）。

1.2 BMSCs 的分離和鑒定本研究中動物實(shí)驗(yàn)獲得石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)審核。在無菌環(huán)境下分離5 只小鼠的股骨和脛骨，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS） 清洗干凈，剪去骨骺端，暴露骨髓腔，采用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，收集沖洗液，以1 000 r·min－1離心5 min，棄去上清，加入新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以3×105cm－2的密度接種于培養(yǎng)瓶中，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d 換液1 次。當(dāng)細(xì)胞基本長滿瓶底壁時，采用0.25%胰蛋白酶消化，常規(guī)傳代培養(yǎng)。收集培養(yǎng)的第5 代BMSCs，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)，通過成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)14 d 后進(jìn)行油紅O 染色，成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)21 d 后進(jìn)行茜素紅染色，分別測定細(xì)胞的成脂和成骨分化能力。PBS 緩沖液清洗細(xì)胞后重懸，取適量細(xì)胞懸液移入干凈流式管中，加入FITC 標(biāo)記的CD29、CD34、CD44、CD45、CD71和HLA-DR，孵育完成后，采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表型。1.3 FOXO1 基因編輯BMSCs的構(gòu)建取對數(shù)生長期的BMSCs，按照每孔1×105個細(xì)胞的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。次日，按照病毒感染比值為50∶1，分別加入攜帶FOXO1 基因的重組慢病毒及其陰性對照重組慢病毒感染BMSCs，作為FOXO1-BMSCs 組和NC-BMSCs 組，另取正常培養(yǎng)的BMSCs 作為對照組。慢病毒感染時每24 h更換1 次培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h 后采用熒光顯微鏡觀察BMSCs 中綠色熒光表達(dá)情況；采用1 mg·L－1嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，并計(jì)算感染率。感染率＝熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4 RT-qPCR 法檢測BMSCs 中FOXO1 mRNA表達(dá)水平在BMSCs 中加入TRIzol 試劑裂解后提取總RNA，檢測RNA 濃度和純度，配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將RNA 合成cDNA，置于－20 ℃保存。RT-qPCR 法檢測細(xì)胞中FOXO1 mRNA 表達(dá)水平，以β-actin 作為內(nèi)參。設(shè)計(jì)合成引物序列，F(xiàn)OXO1上游引物5'-GGGTTAGTGAGCAGGTTACAC-3'，F(xiàn)OXO1下游引物5'-TCCAATGGCACAGTCCTTATC-3'； β-actin 上 游 引 物5'-CATCCACGAAACTACCTTCAACTCC-3'，β -actin 下 游 引 物5'-GAGCCGCCGATCCACACG-3'。 以cDNA 樣本為底物，根據(jù)熒光定量試劑盒說明書配制RTqPCR 上樣體系，每組設(shè)置6 個重復(fù)孔，將體系瞬時離心后，在Bio-CFX96 儀上進(jìn)行檢測。擴(kuò)增結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線得到Ct 值，采用2－△△Ct法計(jì)算BMSCs 中FOXO1 mRNA 表 達(dá) 水 平。

1.5 Western blotting 法檢測BMSCs 中FOXO1、MMP-9、MMP-12 和TIMP-1 蛋白表達(dá)水平將肺組織剪碎并研磨勻漿，在細(xì)胞或組織中添加RIPA裂解液，提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。制備10% SDS-PAGE 凝膠，將蛋白樣品和適量上樣緩沖液混勻，100 ℃水浴中煮沸5 min，取等量的蛋白上樣，通過電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，浸入5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，TBST 洗膜，加入一抗FOXO1、MMP-9、MMP-12 和TIMP-1，4 ℃孵育過夜。次日，加入對應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。TBST 溶液再次洗膜，滴加ECL 避光反應(yīng)30 min，紫外凝膠圖像采集系統(tǒng)拍攝蛋白圖像，采用Image-Pro Plus 軟件分析蛋白條帶灰度值， 以內(nèi)參GAPDH 為基準(zhǔn)，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.6 實(shí)驗(yàn)動物分組和模型構(gòu)建將40 只小鼠隨機(jī)分為4 組，分別為對照組、模型組、NC-BMSCs 組和FOXO1-BMSCs 組，每組10 只。對照組小鼠于第1、7 和14 天腹腔注射200 μ L 生理鹽水，其余3 組小鼠采用OVA 與霧化激發(fā)的方法制備哮喘動物模型，參考文獻(xiàn)［11］方法，于第0、7 和14 天腹腔注射200 μL 含2% OVA 與2%氫氧化鋁的致敏劑。于第28、29 和30 天，將小鼠置于密閉容器內(nèi)，霧化吸入1% OVA 進(jìn)行激發(fā)，每日1 次，每次30 min。在第27 天霧化激發(fā)前，對照組和模型組小鼠尾靜脈注射1 mL 生理鹽水，NC-BMSCs 組小鼠尾靜脈注射1 mL NC-BMSCs 懸液（每毫升1×107個細(xì)胞），F(xiàn)OXO1-BMSCs 組小鼠尾靜脈注射1 mL FOXO1-BMSCs 懸液（每毫升1×107個細(xì)胞）。第35 天進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，制備支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），然后剝離肺組織，以 4%多聚甲醛固定。

1.7 各組小鼠BALF 中細(xì)胞分類計(jì)數(shù)將收集的小鼠BALF 以2 000 r·min－1低溫離心15 min，棄上清，將細(xì)胞沉淀重懸于PBS 緩沖液中，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，將細(xì)胞液滴加至載玻片上并用玻璃蓋玻片覆蓋，固定干燥，進(jìn)行瑞氏染色后，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，隨機(jī)選擇6 個不同視野，分類計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)。

1.8 HE 染色檢測各組小鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)取固定好的小鼠肺組織，常規(guī)石蠟包埋，切片機(jī)上制成5 μm 厚度的切片，進(jìn)行HE 染色。切片進(jìn)行脫蠟脫水后，蘇木精染色5 min，流水沖洗，伊紅染色3 min，流水再次沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，晾干，在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.9 免疫熒光雙染實(shí)驗(yàn)檢測各組小鼠肺組織中細(xì)胞染色情況將制備的小鼠肺組織切片進(jìn)行脫蠟脫水和抗原修復(fù)后，甩干切片，滴加破膜工作液覆蓋組織，室溫孵育30 min，將玻片置于10%山羊血清中室溫封閉20 min，棄掉封閉液，根據(jù)組織塊大小滴加適量的一抗α-SMA （1∶100） 和PCNA（1∶100），置于4 ℃孵育過夜。次日，PBS 緩沖液洗滌后，將適量異硫氰酸熒光素標(biāo)記的二抗（1∶500）滴加至組織切片上，室溫避光孵育1 h。加入DAPI 室溫避光染色 10 min，采用防淬滅封片劑封片，晾干，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。

1.10 各組小鼠氣道形態(tài)參數(shù)測量取制備的各組小鼠肺組織切片，光學(xué)顯微鏡下獲取肺內(nèi)支氣管橫斷面，采用Image-Pro Plus 軟件分別測量支氣管管腔內(nèi)周長（Pi）、管壁面積（W）、支氣管平滑肌面積（S） 和支氣管平滑肌細(xì)胞核數(shù)目（N）。計(jì)算S/Pi、W/Pi 和N/Pi，評估氣道厚度。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。GraphPad Prism 8.30 繪制統(tǒng)計(jì)圖。BMSCs 中FOXO1 mRNA 表 達(dá) 水 平， FOXO1、MMP-9、MMP-12 和TIMP-1 蛋白表達(dá)水平，各組小鼠嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)，S/Pi、W/Pi 和N/Pi 均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組樣本均數(shù)間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs 形態(tài)表現(xiàn)鑒定結(jié)果通過倒置顯微鏡觀察到細(xì)胞呈紡錘形，形態(tài)均勻；經(jīng)油紅O 染色后觀察到明顯紅色脂滴形成，茜素紅染色后可見明顯的橘紅色沉淀，見圖1；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：CD29、CD44 和CD71 呈高表達(dá)，而CD34、CD45 和HLA-DR 呈低表達(dá)，見圖2。

圖1 BMSCs 形態(tài)表現(xiàn)(Bar=250 μm)Fig.1 Morphology of BMSCs(Bar=250 μm)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定 BMSCs 表型Fig.2 Phenotypes of BMSCs identificated by flow cytometry

2.2 FOXO1 基因編輯BMSCs 鑒定結(jié)果在倒置熒光顯微鏡下觀察到對照組BMSCs 中無明顯的綠色 熒 光， NC-BMSCs 組 和 FOXO1-BMSCs 組BMSCs 中可見大量綠色熒光，感染率分別為95.50% 和97.86%，見圖3；與對照組（1.00±0.05， 0.35±0.03） 和NC-BMSCs 組 （1.02±0.08， 0.32±0.03） 比 較， FOXO1-BMSCs 組（2.97±0.24， 1.24±0.12） BMSCs 中 FOXO1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）。見圖4。

圖3 熒光顯微鏡觀察各組BMSCs 中綠色熒光表達(dá)情況 (×100)Fig.3 Expressions of green fluorescence in BMSCs in various groups observed by fluorescence microscope (×100)

圖4 各組BMSCs 中FOXO1 mRNA 表達(dá)水平和FOXO1 蛋白表達(dá)情況Fig.4 Expression levels of FOXO1 mRNA and expressions of FOXO1 protein in BMSCs in various groups

2.3 各組小鼠BALF 中細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果模型組小鼠BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)均高于對照組（P<0.05）；與模型組比較，NC-BMSCs 組和FOXO1-BMSCs 組小鼠BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)減少（P<0.05）；與BMSCs 組比較，F(xiàn)OXO1-BMSCs 組BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)減少（P<0.05）。見表1。

表1 各組小鼠BALF 中細(xì)胞分類計(jì)數(shù)Tab.1 Counts of cell classification in BALF of mice in various groups (n=10,±s，×104 mL－1)

表1 各組小鼠BALF 中細(xì)胞分類計(jì)數(shù)Tab.1 Counts of cell classification in BALF of mice in various groups (n=10,±s，×104 mL－1)

Note：EOS， eosinophils； MAC， macrophage； LYM， lymphocyte； NEU，neutrophils.*P<0.05 compared with control group； △P<0.05 compared with model group； #P<0.05 compared with NC-BMSCs group.

NEU 6.79±1.16 16.83±2.47*12.82±1.97△9.62±1.86△#64.84<0.01 Group Control Model NC-BMSCs FOXO1-BMSCs FP EOS 8.36±1.24 73.25±6.82*43.75±5.24△20.18±3.39△#105.35<0.01 MAC 18.48±1.48 48.39±5.58*27.85±3.42△22.51±1.67△#89.35<0.01 LYM 17.32±1.86 26.18±3.84*21.06±3.51△18.62±3.16△#68.34<0.01

2.4 各組小鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞胞漿呈鮮紅色，與對照組比較，模型組小鼠氣道管腔變窄，基底膜變厚，氣道和肺泡均有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤；與模型組比較，NC-BMSCs 組和FOXO1-BMSCs 組小鼠氣道和肺泡內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤受到抑制，組織損傷減輕，嗜酸性粒細(xì)胞明顯減少；與NC-BMSCs 組比較，F(xiàn)OXO1-BMSCs 組小鼠氣道和肺泡周圍區(qū)域未見明顯炎性細(xì)胞浸潤。見圖5。

圖5 各組小鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×200）Fig.5 Pathomorphology of lung tissue of mice in various groups (HE, ×200)

2.5 各組小鼠肺內(nèi)支氣管參數(shù)與對照組比較，模 型 組 小 鼠S/Pi、 W/Pi 和N/Pi 均 升 高（P<0.05）；與模型組比較，NC-BMSCs 組和FOXO1-BMSCs 組 小 鼠S/Pi、 W/Pi 和N/Pi 降 低（P<0.05）；與NC-BMSCs 比 較，F(xiàn)OXO1-BMSCs 組小鼠S/Pi、W/Pi和N/Pi降低（P<0.05）。見表2。

表2 各組小鼠S/Pi、W/Pi 和N/PiTab.2 S/Pi, W/Pi ,and N/Pi of mice in various groups(n=10,±s)

表2 各組小鼠S/Pi、W/Pi 和N/PiTab.2 S/Pi, W/Pi ,and N/Pi of mice in various groups(n=10,±s)

*P<0.05 compared with control group； △P<0.05 compared with model group； #P<0.05 compared with NC-BMSCs group.

N/Pi(μm－1)Group S/Pi(μm2/μm)W/Pi(μm2/μm)0.02±0.01 0.05±0.02*0.03±0.01△0.02±0.01△#53.28<0.01 Control Model NC-BMSCs FOXO1-BMSCs FP 6.36±0.95 12.65±1.35*8.27±0.85△7.02±1.04△#72.31<0.01 2.94±0.56 6.82±1.25*4.32±1.17△3.15±0.63△#69.21<0.01

2.6 各組小鼠肺組織中α-SMA 和PCNA 表達(dá)情況免疫熒光雙染實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組小鼠肺組織中紅色和綠色熒光表達(dá)增加，說明α-SMA 和PCNA 表達(dá)升高；與模型組比較，NC-BMSCs 組和FOXO1-BMSCs 組小鼠肺組織中紅色和綠色熒光表達(dá)均減弱，說明α-SMA 和PCNA 表達(dá)降低，F(xiàn)OXO1-BMSCs 組小鼠肺組織中紅色和綠色熒光減弱更為明顯，說明α-SMA 和PCNA 表達(dá)更低。見圖6。

圖6 各組小鼠肺組織中α-SMA 和PCNA 表達(dá)情況（免疫熒光雙染，×100）Fig.6 Expressions of α-SMA and PCNA in lung tissue of mice in various groups (Immunofluorescence double staining,×100)

2.7 各組小鼠氣道重塑相關(guān)蛋白表達(dá)水平與對照組比較，模型組小鼠肺組織中MMP-9、MMP-12和TIMP-1 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）；與模型組比較，NC-BMSCs 組和FOXO1-BMSCs 組小鼠肺組織中MMP-9、MMP-12 及TIMP-1 蛋白表達(dá)水平 降 低 （P<0.05）； 與 NC-BMSCs 組 比 較，F(xiàn)OXO1-BMSCs組小鼠肺組織中MMP-9、MMP-12和TIMP-1 蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）。見表3。

表3 各組小鼠肺組織中MMP-9、MMP-12 和TIMP-1 蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of MMP-9,MMP-12,and TIMP-1 proteins in lung tissue of mice in various groups （n=10,±s）

表3 各組小鼠肺組織中MMP-9、MMP-12 和TIMP-1 蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of MMP-9,MMP-12,and TIMP-1 proteins in lung tissue of mice in various groups （n=10,±s）

*P<0.05 compared with control group； △P<0.05 compared with model group； #P<0.05 compared with NC-BMSCs group.

TIMP-1 Group MMP-9MMP-12 0.34±0.02 1.04±0.09*0.44±0.03△0.32±0.02△#74.73<0.01 Control Model NC-BMSCs FOXO1-BMSCs FP 0.35±0.03 0.96±0.08*0.41±0.04△0.34±0.03△#77.29<0.01 0.38±0.04 1.32±0.11*0.45±0.05△0.37±0.04△#86.84<0.01

3 討 論

哮喘是一種在兒童和成人中高發(fā)的慢性非傳染性疾病，主要臨床表現(xiàn)為氣促伴或不伴咳嗽及反復(fù)發(fā)作的喘息。BMSCs 作為種子細(xì)胞具有多項(xiàng)優(yōu)勢，主要包括獲取方便、對供體損傷和與生物支架的黏附性能好，并可通過誘導(dǎo)分化形成骨、軟骨、脂肪、肌肉和纖維等組織，具有很強(qiáng)的擴(kuò)展能力；此外，該細(xì)胞不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類，因此，其可以逃避免疫監(jiān)視，無須事先進(jìn)行免疫修飾即 可 使 用［6，12］。目 前，關(guān) 于BMSCs 移 植 對 哮 喘 及其并發(fā)癥的治療作用引起了研究者的廣泛關(guān)注，BMSCs 表達(dá)的多種細(xì)胞因子和趨化因子受體致使其遷移到發(fā)炎的組織中，組織中促炎細(xì)胞因子水平升高會導(dǎo)致BMSCs 分泌抗炎因子的增加，從而改善包括哮喘在內(nèi)的炎癥性疾病。FOXO1 在生理和病理過程中能夠響應(yīng)多種刺激來維持組織穩(wěn)態(tài)。有研究［13］顯示：FOXO1 是主要上游炎癥信號的介質(zhì)，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和與其他轉(zhuǎn)錄因子以組合的方式來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，在抗炎及促炎特性方面具有雙重功能，而其具體功能取決于調(diào)節(jié)的下游靶標(biāo)分子［13］。由此可見，F(xiàn)OXO1 的調(diào)控能力及其作用可能為炎性疾病的預(yù)防和治療提供重要途徑。HUANG 等［14］研 究 顯 示：FOXO1 在 糖 尿 病 腎 病小鼠模型中對腎臟組織起到保護(hù)作用，提高FOXO1 表達(dá)可防止糖尿病誘導(dǎo)的腎小管間質(zhì)纖維化和細(xì)胞凋亡；HUANG 等［15］研究顯示：FOXO1過表達(dá)保護(hù)人牙周膜干細(xì)胞免受氧化損傷，并具有抗炎作用，能夠增加炎癥環(huán)境中成骨標(biāo)志物Runx2和SP7 的表達(dá)。此外，F(xiàn)OXO1 能夠促進(jìn)BMSCs 分泌抗炎因子，從而起到免疫抑制作用［10］，提示過表達(dá)FOXO1 的BMSCs 有望進(jìn)一步緩解哮喘疾病。本研究結(jié)果顯示：與BMSCs 單獨(dú)作用的哮喘小鼠比較，使用過表達(dá)FOXO1 的BMSCs 作用的哮喘小鼠肺組織損傷減輕，氣道與肺泡內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤均受到抑制，提示FOXO1 可以增加BMSCs 對哮喘小鼠肺組織病理損傷的改善效果。

氣道炎癥是哮喘的重要病理特征，會引起氣道結(jié)構(gòu)組織學(xué)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致肺功能下降。哮喘氣道炎癥涉及多種細(xì)胞因子、黏附分子和炎癥介質(zhì)參與，如嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等［16］。其中，嗜酸性粒細(xì)胞被認(rèn)為是哮喘發(fā)展過程中的一種重要效應(yīng)細(xì)胞，氣道周圍大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤是哮喘發(fā)生的標(biāo)志［17］。此外，嗜酸性粒細(xì)胞也改變感覺神經(jīng)結(jié)構(gòu)和反射性支氣管收縮的調(diào)節(jié)作用，從而使支氣管收縮惡化［18］，提示嗜酸性粒細(xì)胞和氣道神經(jīng)之間的相互作用導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性和支氣管過度收縮，這突顯了抑制嗜酸性粒細(xì)胞釋放在緩解哮喘中的重要性。本研究結(jié)果顯示：與BMSCs 單獨(dú)作用的哮喘小鼠比較，過表達(dá)FOXO1 的BMSCs 作用的哮喘小鼠BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)均減少，并可見氣道及肺泡內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)明顯減少，說明過表達(dá)FOXO1 的BMSCs 可以進(jìn)一步緩解氣道炎癥，從而緩解哮喘疾病。

氣道重構(gòu)是呼吸道炎性反應(yīng)反復(fù)損傷和修復(fù)的結(jié)果，是造成哮喘不可逆性氣道阻塞及肺功能損害從而導(dǎo)致難治性哮喘的主要病理基礎(chǔ)［19］。目前，尋找有效控制氣道重構(gòu)的方法并闡明其分子機(jī)制是治療哮喘的關(guān)鍵。氣道中的上皮細(xì)胞隨著疾病進(jìn)展發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化，成纖維細(xì)胞被激活并分化為肌成纖維細(xì)胞，該細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，包括α-SMA、MMP-9、MMP-12和TIMP-1。α-SMA作為肌動蛋白異構(gòu)體，其表達(dá)升高與炎癥和組織纖維化均有關(guān)［20］。MMPs 作為細(xì)胞外蛋白質(zhì)水解酶，TIMP-1 能夠與其特異性結(jié)合，兩者影響氣道結(jié)構(gòu)的完整性。而當(dāng)MMPs 水平升高時，TIMP-1 抑制蛋白酶分解的速度未能與其達(dá)到動態(tài)平衡狀態(tài)，從而導(dǎo)致基質(zhì)被破壞，這與哮喘中肺部炎癥和氣道重構(gòu)密切相關(guān)［21］。本研究結(jié)果顯示：與BMSCs 單獨(dú)作用的哮喘小鼠比較，過表達(dá)FOXO1 的BMSCs作用的哮喘小鼠氣道厚度指標(biāo)小鼠S/Pi、W/Pi 和N/Pi 均降低，此外，肺組織中α-SMA、MMP-9、MMP-12 和TIMP-1 蛋白表達(dá)水平也降低，說明過表達(dá)FOXO1 的BMSCs 有助于緩解氣道重構(gòu)，從而緩解哮喘疾病。

綜上所述，過表達(dá)FOXO1 能夠提高BMSCs對哮喘小鼠的治療作用，抑制氣道和肺泡內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤與氣道重構(gòu)，從而對肺組織起到保護(hù)作用，這為哮喘的治療提供了新思路。但關(guān)于FOXO1 發(fā)揮功能的具體反應(yīng)機(jī)制還需后續(xù)進(jìn)行深入探討。