色甘酸二鈉對大鼠腦缺血/再灌注損傷的改善作用及其機(jī)制

朱 嫻, 陳薪旭, 陳奕斌, 黎昌炫, 劉 杰, 王 埮

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海南 海口 570102）

缺血性卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）是一種由大腦供血?jiǎng)用}狹窄或閉塞造成腦供血不足進(jìn)而引起腦組織壞死的腦血管?。?］。海馬神經(jīng)元易受CIS 影響而產(chǎn)生損傷，引起患者情緒失控，遠(yuǎn)期出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙等癥狀［2］。CIS 造成大量神經(jīng)元損傷的同時(shí)，也會(huì)啟動(dòng)病灶周圍組織再生反應(yīng)。有學(xué)者［3］認(rèn)為：內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞快速增殖并遷移至受損腦組織是發(fā)揮組織重構(gòu)和神經(jīng)修復(fù)作用的基礎(chǔ)。然而，這種內(nèi)源性修復(fù)功能不足以使神經(jīng)功能完全恢復(fù)。因此，如何快速恢復(fù)海馬區(qū)神經(jīng)元增殖是CIS 溶栓后治療的關(guān)鍵。

肥大細(xì)胞（mast cells，MCs）是血液中廣泛存在的一類粒細(xì)胞，能夠根據(jù)局部環(huán)境和激活狀態(tài)改變自身表型。既往研究［4］顯示：幼鼠圍手術(shù)期缺血后，MCs 經(jīng)血-腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)，造成幼鼠腦神經(jīng)元發(fā)育受阻。色甘酸二鈉（sodium cromoglycate，SCG）是一類抑制MCs 脫粒和遷移的藥物［5］，可減少CIS 溶栓大鼠模型中性粒細(xì)胞進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，降低模型大鼠死亡率，減輕大鼠海馬、丘腦及大腦皮質(zhì) 區(qū) 域 損 傷［6］。目 前，有 關(guān)SCG 對CIS 溶 栓 治 療后神經(jīng)元新生的影響尚不清楚。本研究采用線栓法構(gòu)建大鼠腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷模型模擬靜脈溶栓，探討SCG 對I/R 大鼠腦組織神經(jīng)元新生的作用，為研究SCG 在CIS 治療中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器80 只SD 大鼠由海南藥物研究所有限責(zé)任公司提供，無特定病原體動(dòng)物（specific pathogen free，SPF） 級，雄性，8 周齡，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK （瓊） 2020-0007，體質(zhì)量170～180 g；大鼠飼養(yǎng)于海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 動(dòng)物房中，飼養(yǎng)條件：溫度22 ℃～26 ℃，濕度30%～70%，12 h/12 h 固定晝夜循環(huán)，給予充足的食物和水。腦缺血模型線栓（型號：L3600，廣州佳靈生物技術(shù)公司），2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）（批號：133725，美國Sigma 公司），高爾基染色試劑盒（批號：103962，美國Thermo 公司）， 5-溴 脫 氧 尿 嘧 啶 核 苷（5-bromodeoxyuracil nucleoside， BrdU）（批 號：162290，美國Sigma 公司），抗鼠BrdU 抗體（批號：ab0753，英國Abcam 公司），抗鼠雙皮質(zhì)素抗體（doublecortin，DCX）（批號：5302，美國CST公司），抗鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、抗鼠抗酪氨酸激酶受體B （tyrosine kinase receptor B，TrkB），抗鼠神經(jīng)生長因子3（neurotrophins-3，NT-3） 和抗鼠抗酪氨酸激酶受體C （tyrosine kinase receptor C，TrkC） 抗體（批號：bs3728、bs2837、bs3822 和bs1535，北京博奧森生物科技公司），辣根氧化酶偶 聯(lián) 山 羊 抗 鼠/兔IgG （H+L） 抗 體（批 號：b183237/b277372，上海碧云天生物科技公司）。Y 型迷宮設(shè)備（型號：SA204，江蘇賽昂斯公司），倒置熒光顯微鏡（型號：EVOS M5000，美國Thermo 公司），凝膠電泳裝置（型號：Miniprotean Tetra，美國Bio-Rad 公司），化學(xué)發(fā)光成像儀（型號：1600/1600R，上海天能生物公司），膜片鉗系統(tǒng)（型號：MultiClamp 700B 和MultiClamp 1550B，瑞士Axon 公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（型號：CX7 Pro，美國Thermo 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、給藥和模型制備80 只大鼠分為假手術(shù)組和I/R 模型組，假手術(shù)組18 只，I/R模型組62 只。所有大鼠適應(yīng)環(huán)境喂養(yǎng)1 周，麻醉I/R 模型組大鼠，仰臥位姿勢固定在鼠板上，頸部備皮消毒，切開1 個(gè)長度約為2 cm 的切口。沿著肌肉組織分離出左側(cè)頸動(dòng)脈，分別結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈。在頸總動(dòng)脈結(jié)扎處穿刺開孔，插入腦缺血模型線栓，經(jīng)頸動(dòng)脈分叉前進(jìn)至頸內(nèi)動(dòng)脈，繼續(xù)推進(jìn)直至大腦中動(dòng)脈，深度約為16 mm。此時(shí)，大腦中動(dòng)脈血流被線栓阻塞。持續(xù)2 h 后取出線栓，縫合傷口，結(jié)扎頸總動(dòng)脈避免傷口出血。麻醉假手術(shù)組大鼠，頸部備皮消毒后分離頸動(dòng)脈，不進(jìn)行其他任何處理，縫合傷口，滴加青霉素避免感染。

1.3 改良的神經(jīng)功能缺損程度評分（modified neurological severity score，mNSS）法評估各組大鼠神經(jīng)功能建模后24 h 按參考文獻(xiàn)［7］中mNSS法評估大鼠神經(jīng)功能。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)包括提尾實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)、感覺實(shí)驗(yàn)、平衡木實(shí)驗(yàn)、反射喪失實(shí)驗(yàn)和不正常運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)，總評分為18 分，評分越高代表大鼠神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。剔除I/R 模型組神經(jīng)功能評分<6 分（2 只） 和≥15 分（8 只） 及死亡（7 只）大鼠，將造模成功的45 只大鼠隨機(jī)分為I/R組、I/R+低劑量（20 mg·kg－1） SCG 組和I/R+高劑量（60 mg·kg－1） SCG 組，每組各15 只。假手術(shù)組和I/R 模型組大鼠分別腹腔注射生理鹽水，劑量為10 mL·kg－1，連續(xù)腹腔注射2 周。各劑量SCG 組大鼠給予相應(yīng)劑量SCG，持續(xù)2 周。記錄各組大鼠mNSS 評分，評價(jià)不同劑量SCG 對大鼠神經(jīng)功能的影響。

1.4 Y 型迷宮實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力腹腔給藥2 周后，每組隨機(jī)選取12 只大鼠開展Y 型迷宮檢測，檢測期間持續(xù)給藥治療。Y 型迷宮各支臂裝有信號燈，設(shè)置安全區(qū)（無電刺激）與非安全區(qū)（電刺激）。隨機(jī)確定安全區(qū)，測試大鼠電擊回避學(xué)習(xí)和記憶能力。訓(xùn)練時(shí)，將大鼠置于Y 型迷宮中，以所在支臂為起點(diǎn)，安全區(qū)支臂信號燈亮，延遲5 s 啟動(dòng)電刺激。當(dāng)大鼠逃避至安全區(qū)，并且在信號燈持續(xù)時(shí)間（10 s） 內(nèi)不折返至電擊區(qū)，記為正確反應(yīng)，否則記為錯(cuò)誤反應(yīng)。大鼠共訓(xùn)練20 次，記錄正確反應(yīng)次數(shù)，并計(jì)算正確反應(yīng)率，正確反應(yīng)率=正確反應(yīng)次數(shù)/20×100%，正確反應(yīng)率可反映大鼠學(xué)習(xí)能力。將各組大鼠置入Y 型迷宮中，安全區(qū)亮燈，記錄各個(gè)大鼠到達(dá)安全區(qū)時(shí)間，記為正確反應(yīng)時(shí)間，代表大鼠的記憶能力。

1.5 2，3，5- 氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色法檢測各組大鼠腦梗死區(qū)面積完成“Y”型迷宮實(shí)驗(yàn)檢測后，各組隨機(jī)取3 只大鼠，取大鼠腦組織，冰箱冷凍成形后切片，約6 片。將切片浸于2%TTC 染色液中，水?。?7 ℃）中避光孵育，期間多次翻片保證染色充分，整個(gè)過程共30 min。取出染液中切片，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗后，將切片按順序排列后拍照，計(jì)算腦梗死區(qū)面積。腦梗死區(qū)面積＝白色梗死區(qū)域面積/腦組織區(qū)域面積。

1.6 長時(shí)程增強(qiáng)檢測各組大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力每組隨機(jī)選取3 只大鼠以CO2處死，采用PBS緩沖液（4 ℃預(yù)冷）經(jīng)心臟灌流沖盡全身血液后取出完整腦組織，置入冰浴人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF） 中。去除小腦，沿大腦中縫切開左右半球，取缺血側(cè)大腦，分離出海馬區(qū)組織，切斷海馬傘部，割斷下托，置于預(yù)備的瓊脂塊上，將海馬與瓊脂塊固定在切片機(jī)標(biāo)本托上，冰浴ACSF、持續(xù)供氧條件下，將海馬沿長軸切出厚度為400 μm 的切片。轉(zhuǎn)移切片至ACSF 中平衡，以聚四氟乙烯涂層的鎢絲電極為刺激電極，以充滿 ACSF 的玻璃微電極為記錄電極，插入腦組織海馬CA1 區(qū)謝氏側(cè)支或者CA3 區(qū)錐體細(xì)胞發(fā)出的軸突通路，通電刺激后引發(fā)場興奮性突觸后電位（field excitatory postsynaptic potential，fEPSP）。調(diào)整電極位置和刺激強(qiáng)度以誘發(fā)不同fEPSP，設(shè)基線為200 μA 下最大值信號強(qiáng)度的40%。固定電極和刺激強(qiáng)度，穩(wěn)定記錄20 min。更換更高頻率刺激誘發(fā)長時(shí)程電位增強(qiáng)（long term potentiation，LTP），連續(xù)給予20 串刺激，每串包含200 個(gè)脈沖，頻率為200 Hz，波寬200 μ s，串間隔30 s，穩(wěn)定記錄60 min。計(jì)算每分鐘神經(jīng)興奮性突觸后fEPSP 斜率和高頻刺激后fEPSP。

1.7 高爾基染色檢測各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區(qū)樹突棘密度每組隨機(jī)取3 只大鼠以CO2處死，采用PBS 緩沖液（4 ℃預(yù)冷）經(jīng)心臟灌流沖盡全身血液后取出完整腦組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h。取出腦組織，梯度乙醇脫水，浸泡入溶液1 與溶液2 的混合液中冷藏14 d（溶液1、2、3、4 和5 均為高爾基染色試劑盒中試劑）。取出腦組織浸入溶液3 冷藏48 h，置入異戊烷中包埋，冷凍后切成，片厚為10 μm，轉(zhuǎn)移至載玻片。載玻片上滴加溶液4 與溶液5 混合液反應(yīng)30 min。蒸餾水沖洗，最后采用不同濃度乙醇脫水，分別采用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ溶液透化，以中性樹膠封片。置于激光共聚焦顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)元每50 μm 長度的樹突上樹突棘數(shù)，即為樹突棘密度。

1.8 免疫熒光法檢測各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區(qū)5-溴脫氧尿苷（5-bromodeoxyuridine，BrdU）陽性細(xì)胞數(shù)和雙腎上腺皮質(zhì)激素（doublecortin，DCX）蛋白表達(dá)水平各組隨機(jī)選取3 只大鼠，連續(xù)腹腔注射50 mg·kg－1BrdU 3 d 后處死，取腦組織，采用冷凍液包埋后切成約10 μm 厚切片。將切片置于染缸中滴加丙酮甲醇混合溶液（1∶1）浸沒，固定20 min。取出切片貼于載玻片上，浸沒于山羊血清中封閉60 min。PBS 緩沖液清洗，切片上滴加兔源抗鼠BrdU 抗體與鼠源抗鼠DCX 抗體稀釋液，4 ℃孵育過夜。PBS 緩沖液清洗，滴加Alexa Fluor 555 山羊抗兔IgG（H+L）或Alexaflour 488山羊抗鼠IgG（H+L）二抗稀釋液。室溫避光孵育1 h，滴加DAPI 染色液孵育20 min，再滴加抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。采用Image Pro Plus 6.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算海馬齒狀回區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，掃描得到DCX 平均熒光強(qiáng)度，以DXC 平均熒光強(qiáng)度代表DCX蛋白表達(dá)水平。

1.9 Western blotting 法檢測各組大鼠大腦海馬組織 中BDNF、TrkB、NT-3 和TrkC 蛋 白 表 達(dá) 水 平

每組取3 只大鼠，處死后取缺血側(cè)基底節(jié)區(qū)，加入RIPA 裂解液勻漿，靜置30 min。4 ℃離心（12 000 r·min－1、30 min）吸取上清液，檢測蛋白濃度并加入上樣緩沖液，加熱10 min 使蛋白變性。取凝膠上樣并開啟電泳，通過濕法轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移凝膠條帶蛋白至PVDF 膜上。取出PVDF 膜，脫脂奶粉封閉，分別加入抗鼠BDNF、抗鼠TrkB、抗鼠NT-3 與抗鼠TrkC 抗體孵育過夜，次日PBS 緩沖液洗凈一抗，加入辣根氯化酶偶聯(lián)山羊抗鼠/兔IgG（H+L）抗體室溫孵育。條帶上滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色液，化學(xué)發(fā)光成像儀下獲得各個(gè)蛋白條帶，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠神經(jīng)功能評分和腦梗死面積，正確反應(yīng)率和正確反應(yīng)時(shí)間，fEPSP 斜率，腦組織中海馬齒狀回區(qū)樹突棘密度，腦組織中海馬齒狀回區(qū)BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)和DCX 蛋白表達(dá)水平，海馬組織中BDNF、TrkB、NT-3 和TrkC 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠正確反應(yīng)率和正確反應(yīng)時(shí)間與假手術(shù)組比較，I/R 組大鼠正確反應(yīng)率降低（P<0.05），正確反應(yīng)時(shí)間增加（P<0.05）。與I/R 組比較，I/R+低劑量SCG 組大鼠正確反應(yīng)率和正確反應(yīng)時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而I/R+高劑量SCG 組大鼠正確反應(yīng)率明顯增加（P<0.05）， 正 確 反 應(yīng) 時(shí) 間 明 顯 降 低（P<0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠正確反應(yīng)率（A）和正確反應(yīng)時(shí)間（B）Fig.1 Accurate reaction rate（A） and accurate reaction time （B）of rats in various groups

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能評分和腦梗死面積與假手術(shù)組比較，I/R 組大鼠神經(jīng)功能評分升高（P<0.05），缺血側(cè)出現(xiàn)明顯的梗死區(qū)域；與I/R 組比較，I/R+高劑量SCG 組大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低（P<0.05），且腦梗死面積明顯減少（P<0.05）；I/R+低劑量SCG 組大鼠神經(jīng)功能評分和腦梗死面積與I/R 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖2 和3。

圖2 各組大鼠神經(jīng)功能評分（A）和腦梗死面積（B）Fig.2 Neurological function scores(A) and cerebral infraction areas(B) of rats in various groups

圖3 TTC 染色法檢測各組大鼠腦梗死面積Fig.3 Cerebral infraction areas of rats in various groups detected by TTC staining method

2.3 長時(shí)程增強(qiáng)檢測各組大鼠電刺激后海馬神經(jīng)元fEPSP 斜率與假手術(shù)組比較，I/R 組大鼠fEPSP 斜率明顯降低（P<0.05）；與I/R 組比較，I/R+高劑量SCG 組大鼠fEPSP 斜率明顯升高（P<0.05）。見圖4 和5。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)電刺激后各組大鼠海馬神經(jīng)元fEPSP 斜率Fig.4 fEPSP slopes of hippocampus neurons of rats in various groups after electrical stimulation at different time points

圖5 各組大鼠海馬神經(jīng)元fEPSP 斜率Fig.5 fEPSP slopes of hippocampus neurons of rats in various groups

2.4 各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區(qū)樹突棘密度假手術(shù)組、I/R 組、I/R+低劑量SCG 組和I/R+高劑量SCG組大鼠腦組織中海馬齒狀回區(qū)樹突棘密度分別為（146.67±10.60）、（54.33±11.93）、（86.67±12.66） 和（119.00±16.46） 個(gè)/50 μm，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.792，P<0.001）。與假手術(shù)組比較，I/R 組大鼠腦組織中齒狀回區(qū)樹突棘密度明顯降低（P<0.05）；與I/R 組比較，I/R+高劑量SCG 組大鼠腦組織中海馬齒狀回區(qū)樹突棘密度明顯升高（P<0.05）。各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區(qū)樹突棘形態(tài)表現(xiàn)見圖6。

圖6 各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區(qū)樹突棘形態(tài)表現(xiàn)（高爾基染色，Bar=10 μm）Fig.6 Morphology of dendritic spines in dentate gyrus of hippocampus in brain tissue of rats in various groups (Golgi staining, Bar =10 μm)

2.5 各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區(qū)BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)和DCX 蛋白表達(dá)水平與假手術(shù)組比較，I/R 組大鼠腦組織中海馬齒狀回區(qū)BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)和DCX 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與I/R 組比較，I/R+高劑量SCG 組大鼠腦組織中海馬齒狀回區(qū)BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)和DCX 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）。見圖7 和表1。

表1 各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區(qū)BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)和DCX 蛋白表達(dá)水平Tab.1 Number of BrdU positive cells and expression levels of DCX protein in dentate gyrus of hippocampus in brain tissue of rats in various groups (n=3,±s)

表1 各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區(qū)BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)和DCX 蛋白表達(dá)水平Tab.1 Number of BrdU positive cells and expression levels of DCX protein in dentate gyrus of hippocampus in brain tissue of rats in various groups (n=3,±s)

*P<0.05 compared with I/R group.

Group Sham operation I/R I/R+low dose of SCG I/R+high dose of SCG Expression level of DCX protein 497.86±38.62 594.94±54.67 667.37±44.45 936.61±55.13*Number of BrdU positive cells 7.33±1.53 10.00±2.65 13.00±3.61 20.33±2.08*

圖7 免疫熒光法檢測各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區(qū)BrdU 陽性細(xì)胞和DCX 蛋白表達(dá)情況（Bar=100 μm）Fig.7 BrdU positive cells and expressions of DCX protein in dentate gyrus of hippocampus in brain tissue of rats in various groups detected by immunofluorescence method (Bar =100 μm)

2.6 各組大鼠大腦海馬組織中BDNF、TrkB、NT-3和TrkC 蛋白表達(dá)水平與假手術(shù)組比較，I/R 組大鼠大腦海馬組織中NT-3 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05），而BDNF、TrkB 和TrkC 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與I/R 組比較，I/R+高劑量SCG 組大鼠大腦海馬組織中BDNF、TrkB、NT-3 和TrkC 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）。見圖8 和表2。

表2 各組大鼠大腦海馬組織中BDNF、TrkB、NT-3 和TrkC 蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of BDNF,TrkB, NT-3， and TrkC proteins in hippocampus tissue of brain of rats in various groups(n=3,±s)

表2 各組大鼠大腦海馬組織中BDNF、TrkB、NT-3 和TrkC 蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of BDNF,TrkB, NT-3， and TrkC proteins in hippocampus tissue of brain of rats in various groups(n=3,±s)

*P<0.05 compared with sham operation group； △P<0.05 compared with I/R group.

Group Sham operation I/R I/R+low dose of SCG I/R+high dose of SCG TrkC 0.22±0.02 0.20±0.04 0.26±0.01 0.41±0.03△BDNF 0.23±0.04 0.30±0.03 0.36±0.05 0.82±0.07△TrkB 0.26±0.06 0.37±0.05 0.39±0.07 1.02±0.14△NT-3 0.08±0.01 0.14±0.03*0.17±0.03 0.62±0.07△

圖8 各組大鼠大腦海馬組織中BDNF、TrkB、NT-3 和TrkC 蛋白電泳圖Fig.8 Electrophoregram of expressions of BDNF,TrkB, NT-3， and TrkC proteins in hippocampus tissue of brain of rats in various groups

3 討 論

CIS 溶栓誘發(fā)再灌注會(huì)造成大腦海馬區(qū)神經(jīng)元死亡［8］。本研究結(jié)果顯示：I/R 大鼠腦組織中出現(xiàn)梗死灶和神經(jīng)功能損傷，Y 型迷宮實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示：I/R 組大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，表明I/R 構(gòu)建成功。I/R 模型可模擬臨床患者部分肢體運(yùn)動(dòng)受損及口眼歪斜等癥狀［9］和模擬CT 檢查呈現(xiàn)的缺血側(cè)低密度陰影信號的情況［10］。此外，I/R 模型易造成遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙情況，這與臨床患者CIS 溶栓后遠(yuǎn)期可能發(fā)展為血管性癡呆的病情相符［11］。

既往研究［12-13］顯示：SCG 具有治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的作用，給予癲癇大鼠SCG 可明顯改善大鼠癲癇癥狀；50 mg·kg－1SCG 可明顯降低圍術(shù)期腦卒中大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中MCs 數(shù)，減輕腦損傷嚴(yán)重程度。本研究采用20 和60 mg·kg－1SCG 觀察 SCG 對I/R 大鼠的影響，結(jié)果顯示：與I/R 組比較，I/R+高劑量SCG 組大鼠神經(jīng)功能評分明顯升高，腦梗死面積減少，大鼠認(rèn)知功能改善；I/R+低劑量SCG 組大鼠各項(xiàng)神經(jīng)功能評分和腦梗死面積等雖有改善趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

I/R 誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷機(jī)制復(fù)雜，但無論何種機(jī)制，其恢復(fù)治療機(jī)制均涉及提高神經(jīng)元狀態(tài)［14］。神經(jīng)元發(fā)生損傷后，腦組織產(chǎn)生代償性促進(jìn)神經(jīng)元新生的反應(yīng)，該過程是生物體的一種內(nèi)源性保護(hù)行為，神經(jīng)元新生與神經(jīng)功能恢復(fù)密切相關(guān)。有 研 究［15］顯 示： 海 馬 中BDNF/TrkB 和NT-3/TrkC 信號通路蛋白表達(dá)與神經(jīng)發(fā)育、突觸形成及學(xué)習(xí)記憶緊密相關(guān)。以基因技術(shù)編碼敲低BDNF 表達(dá)可能導(dǎo)致突觸功能障礙、突觸可塑性降低和學(xué)習(xí)及記憶功能受損［16］。增加BDNF和NT-3蛋白表達(dá)則有助于樹突棘的生長，調(diào)節(jié)軸突形態(tài)，促進(jìn)神經(jīng)元新生［17-18］。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，I/R 組大鼠大腦海馬組織中NT-3 蛋白表達(dá)水平升高，但BDNF、TrkB 和TrkC 蛋白表達(dá)水平無明顯變化。BrdU 是胸腺嘧啶核苷酸類似物，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶進(jìn)入正在復(fù)制的DNA 分子中，可通過熒光標(biāo)記準(zhǔn)確地反映細(xì)胞增殖情況，而DCX 則是未成熟新生的齒狀回顆粒細(xì)胞的可靠標(biāo)記物。在生物內(nèi)源性修復(fù)過程中，BrdU 陽 性 細(xì) 胞 數(shù) 和DCX 蛋 白 表 達(dá) 水 平 升 高［19-20］。本研究結(jié)果顯示：采用SCG 治療后大鼠腦組織中海馬齒狀回區(qū)DCX 表達(dá)水平和BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)升高。

樹突棘是信號傳遞基本單位，與個(gè)體認(rèn)知功能相關(guān)［18］。樹突棘數(shù)、密度和長度的變化可直觀反映突觸可塑性改變，可以通過電生理信號長時(shí)程增強(qiáng)電位顯示［21］。I/R 造成大鼠腦組織海馬區(qū)域樹突棘密度降低，長時(shí)程增強(qiáng)檢測中fEPSP 斜率降低，且Y 型迷宮實(shí)驗(yàn)中大鼠正確反應(yīng)率減少，正確反應(yīng)時(shí)間延長。這是由于大鼠腦組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，缺血區(qū)雖然恢復(fù)了血供，但較長時(shí)間缺血和復(fù)灌造成神經(jīng)元不可逆損傷，且腦組織自我修復(fù)能力較弱，無法完全逆轉(zhuǎn)I/R 造成的損傷［22］。因此深入探討發(fā)生I/R 損傷后如何采用藥物提高缺血區(qū)神經(jīng)元新生具有重要意義。本研究結(jié)果顯示：SCG干預(yù)后，I/R 大鼠腦組織中BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)增多，DCX 蛋白表達(dá)水平升高，且樹突棘密度明顯升高；與I/R 組比較，I/R+高劑量SCG 組大鼠腦組織海馬齒狀回區(qū)樹突棘密度明顯升高，且fEPSP 斜率升高。

綜上所述，SCG 具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過提高BDNF/TrkB 和NT-3/TrkC 信號通路蛋白表達(dá)，促進(jìn)腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元增殖，提高樹突棘密度，最終起到提高長時(shí)程電位和改善I/R 大鼠認(rèn)知功能的作用。此外，與自體生理修復(fù)比較，SCG 可以進(jìn)一步減少腦梗死區(qū)域，減輕大鼠神經(jīng)功能障礙。但本研究也存在一定局限性，未探討部分神經(jīng)元新生指標(biāo)（如轉(zhuǎn)化生長因子β1和血管內(nèi)皮生長因子）的變化及其意義。SCG 一方面調(diào)控了神經(jīng)元的分化和增殖［23］，另一方面在缺血區(qū)血管重構(gòu)過程中發(fā)揮了巨大作用［24］。