人lncRNA-GACAT2 過表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和干性的影響

倪 娜, 董洪亮, 高海洋, 陳微微, 孟新宇, 崔冰潔, 杜 靜

（1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，山東 濱州 256603；2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診重癥監(jiān)護(hù)室，山東 濱州 256603）

全世界每年有140 萬人死于肺癌，近80%的肺癌為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）［1-2］。目前手術(shù)切除是早期NSCLC 的唯一治療方法。然而，約50%手術(shù)患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)［3］。NSCLC 患者的預(yù)后較差，5 年生存率僅為15%［4］。因此，尋找更準(zhǔn)確的預(yù)測NSCLC 的生物標(biāo)志物對(duì)進(jìn)一步了解NSCLC 細(xì)胞生物學(xué)和開發(fā)新的治療策略有重要的臨床價(jià)值。長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度>200 個(gè)核苷酸的非編碼蛋白R(shí)NA 分子的總稱［5］。近年來，多項(xiàng)研究［6-8］顯示：lncRNA 參與基因表達(dá)和蛋白修 飾， 并 與 多 種 疾 病 有 關(guān)。 研 究［9-10］顯 示：lncRNA 部分與腫瘤轉(zhuǎn)移、細(xì)胞侵襲和不良預(yù)后有關(guān)。研 究［11］顯 示：NSCLC 組 織 和 血 液 循 環(huán) 中l(wèi)ncRNA 失調(diào)與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本課題組前期研究［12］顯示：lncRNA SOX2 重疊轉(zhuǎn)錄（SOX2 over lapping transcript，SOX2-OT） 可以通過人下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1 介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控人肺癌H520 細(xì)胞遷移。因此，探討lncRNA 參與NSCLC發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制可為NSCLC 患者早期診斷、靶向治療和改善預(yù)后提供依據(jù)。

lncRNA HNlincRNA717 被人類基因命名委員會(huì) （HUGO Gene Nomenclature Committee，HGNC） 命名為胃癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本2（gastric cancer related transcript 2，GACAT2）基因，該基因定位于人類18 號(hào)染色體p11.22，長度為818 bp［13］。該基因的表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，其在胃癌組織和胃癌相關(guān)細(xì)胞中呈低表達(dá)，且該基因表達(dá)下調(diào)與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、靜脈侵犯和神經(jīng)周圍侵犯有關(guān)。關(guān)于GACAT2 基因在肺癌中表達(dá)和作用的報(bào)道較少，XIE 等［14］發(fā) 現(xiàn)： NSCLC 組 織 和 細(xì) 胞 中GACAT2基因表達(dá)水平降低，且其表達(dá)水平下調(diào)與患者不良預(yù)后相關(guān)。目前，尚無采用基因修飾對(duì)GACAT2基因進(jìn)行細(xì)胞層面的功能和機(jī)制研究，本研究采用基因工程克隆技術(shù)，構(gòu)建了GACAT2 基因的真核表達(dá)載體pc3.1-GACAT2，并將其轉(zhuǎn)染至肺癌A549 及肺癌H1299 細(xì)胞中，建立了穩(wěn)定表達(dá)GACAT2 基因的A549 和H1299 細(xì)胞，并采用細(xì)胞增殖、克隆形成及干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)評(píng)價(jià)GACAT2基因?qū)?xì)胞增殖和腫瘤細(xì)胞干性的調(diào)節(jié)作用，旨在為研究GACAT2 基因在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人肺癌A549 和H1299 細(xì)胞由濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心平臺(tái)保存。DMEM （高糖） 培養(yǎng)基（以色列 BI 公司），LONSA 胎牛血清（山東增峰生物技術(shù)有限公司），細(xì)胞因子50×B27（美國Gibco 公司），表皮細(xì)胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）（美國PeproTech 公司），大腸埃希菌DH5α［天根生化（北京） 科技有限公司］、限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ（大連寶生物工 程 有 限 公 司）、 ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit 一步法克隆試劑盒（諾維贊生物科技股份有限公司），總RNA 提取試劑盒（普洛麥格生物技術(shù)有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］，Q5 超保真DNA 聚合酶［美國New England Biolabs （NEB） 公 司］， 2×Taq Master Mix 和SYBR qPCR 試劑盒（近岸蛋白科技有限公司）， Axygen 中量質(zhì)粒提取試劑盒［康寧生命科學(xué)（吳江） 有限公司］，凝膠回收試劑盒（美國 Omega 公司），表達(dá)載體pc3.1（+） 質(zhì)粒（ 美 國 Invitrogen Life Technologies 公 司），Lipofectamine 3000 （上海Invitrogen 生命技術(shù)公司），CCK-8 試劑盒（美國Med Chem Express 公司）?；驍U(kuò)增儀（德國Eppendorf 公司），倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTqPCR） 儀和凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司），引物DNA 合成和載體DNA 測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 RNA 提取和逆轉(zhuǎn)錄采用總RNA 提取試劑盒收集細(xì)胞中總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，置于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank 已發(fā)表的GACAT2基因保守序列，采用南京喏維贊生物科技公司官網(wǎng)提供的引物設(shè)計(jì)網(wǎng)頁進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，酶切位點(diǎn)分別為XhoⅠ和HindⅢ，引物序列：GACAT2 基因上游引物5'-CTAGCGTTTAAACTTAAGCTTACAATAAATAAAACAGTTGGTGTCAATACA-3'，GACAT2 基因下游引物5'-AACGGGCCCTCTAGACTCGAGAATATTTAAAATGTTTATTTCATAAGCACTG-3' （下劃線部分為酶切位點(diǎn)）。

1.4 pc3.1-GACAT2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建以制備 的cDNA 為 模 板， 采 用RT-qPCR 法 擴(kuò) 增GACAT2 基因，在微量離心管中加入下列試劑（50 μL 體系）：5×Q5 Reation Buffer 10 μL，dNTP（10 mol·L－1） 1.0 μ L， cDNA （200 ng） 5 μL，Q5 DNA polymerase （2 000 U·L－1） 0.5 μL，ddH2O 37.0 μL。PCR 反 應(yīng) 程 序： 94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，57 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min，4 ℃保存。通過電泳驗(yàn)證片段大小，瓊脂糖凝膠回收試劑盒將擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，空質(zhì)粒pc3.1（+）及擴(kuò)增出來的GACAT2 基因片段同時(shí)采用HindⅢ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，然后將酶切產(chǎn)物采用一步法克隆試劑盒進(jìn)行連接。將連接后的反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布于LB 固體培養(yǎng)基（含50 mg·L－1氨芐青霉素）上，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)。次日挑取生長的單個(gè)菌落置入LB 培養(yǎng)液（含50 mg·L－1氨芐青霉素）中進(jìn)行培養(yǎng)，菌液PCR 法進(jìn)行陽性克隆鑒定，并提取質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序后進(jìn)行DNA 序列比對(duì)分析。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染采用含10% 胎牛血清的DMEM（高糖）培養(yǎng)基培養(yǎng)肺癌A549 和H1299 細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。收集處于對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，使細(xì)胞密度達(dá)到1.0×105mL－1，按2 mL/孔的密度將細(xì)胞鋪于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待次日細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分為空載體組（轉(zhuǎn)染pc3.1 空載體） 和pc3.1-GACAT2 組（轉(zhuǎn)染pc3.1-GACAT2 重組質(zhì)粒），并按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.6 GACAT2 過表達(dá)穩(wěn)定株的篩選G418 最佳作用濃度篩選：將A549 和H1299 細(xì)胞傳代接種至24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使每孔細(xì)胞的覆蓋率達(dá)約60%，分為未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染pc3.1 空載體組和轉(zhuǎn)染pc3.1-GACAT2 組， 48 h 后每組分別加入G418，使其終濃度分別為0、200、400、600、800和1 000 mg·L－1，連續(xù)觀察4～7 d 后，選取能導(dǎo)致未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞完全死亡的G418 濃度作為后續(xù)篩選重組質(zhì)粒細(xì)胞克隆的最佳工作濃度，其中A549 細(xì)胞最佳工作濃度為200 mg·L－1，H1299 細(xì) 胞 最 佳 工 作 濃 度 為400 mg·L－1。

穩(wěn)定株的篩選：根據(jù)篩選出的最佳G418 作用濃度轉(zhuǎn)染pc3.1 空載體和pc3.1-GACAT2 重組質(zhì)粒的A549 和H1299 細(xì)胞直至獲得穩(wěn)定存活的細(xì)胞，并將細(xì)胞分別命名為空載體組（轉(zhuǎn)染pc3.1 空載體） 和pc3.1-GACAT2 組（轉(zhuǎn)染pc3.1-GACAT2重組質(zhì)粒）。

1.7 RT-qPCR 法檢測2 組A549 和H1299 細(xì)胞中GACAT2 mRNA 表達(dá)水平 分別收集“1.6”中空載體組和pc3.1-GACAT2 組細(xì)胞，按照“1.2”中步驟提取細(xì)胞中總RNA，然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用RT-qPCR法檢測A549 和H1299 細(xì)胞中GACAT2 mRNA 表達(dá)水平，以GAPDH 作為內(nèi)參基因。PCR 法反應(yīng)條件：95 ℃、10 s； 95 ℃、5 s，57 ℃、 30 s，38 個(gè)循環(huán)。引 物 序 列： GACAT2 上 游 引 物5'-TTATCCTGAACCGCCACGC-3'， GACAT2下游引物5'-TCCAGACAGCAGGAGGAAATG-3'；GAPDH 上 游 引 物5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3'， GAPDH 下 游 引 物5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和熒光曲線的Ct 值，采用2－ΔΔCt法計(jì)算A549 和H1299 細(xì)胞中GACAT2 mRNA 表達(dá)水平。

1.8 CCK-8 法檢測2 組細(xì)胞增殖活性將空載體組 和pc3.1-GACAT2 組 細(xì) 胞（A549 和H1299 細(xì)胞）采用胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)， 按照每孔3 000 個(gè)細(xì)胞的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)6 個(gè)平行復(fù)孔。采用CCK-8 法分別檢測細(xì)胞在12、24、36 和48 h 時(shí)的增殖活性。采用酶標(biāo)儀在450 nm 處測定各孔的吸光度（A）值，以僅加入培養(yǎng)液的空白孔為對(duì)照孔調(diào)零。以A 值代表各組細(xì)胞的增殖活性。

1.9 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞克隆形成數(shù)將空載體組和pc3.1-GACAT2 組A549 或H1299 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后重懸，按照每孔700 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)10 d 后取出棄掉培養(yǎng)基，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗后，以多聚甲醛固定15 min，PBS 緩沖液洗滌2 次然后采用結(jié)晶紫染色20 min，吸掉結(jié)晶紫溶液，最后采用流動(dòng)的清水洗掉結(jié)晶紫后晾干，采用凝膠成像系統(tǒng)Coomassie Blue 應(yīng)用程序?qū)ε囵B(yǎng)板進(jìn)行拍照。采用Image J 軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.10 干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)觀察2 組細(xì)胞成球數(shù)配制干細(xì)胞成球培養(yǎng)基，不含血清的DMEM （高糖）培養(yǎng)基中添加2% 50× B27、EGF 和bFGF，其中EGF 和bFGF 的終濃度均為20 μg·L－1，將空載體組和pc3.1-GACAT2 組A549 及H1299 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后懸浮在干細(xì)胞成球培養(yǎng)基中，并接種于低黏附性的12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種1 000 個(gè)細(xì)胞，每隔3 d 按照半量換液法更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)10 d 后觀察細(xì)胞成球情況并拍照，統(tǒng)計(jì)直徑>75 μm 的細(xì)胞球數(shù)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad Prism 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2 組細(xì)胞中GACAT2 RNA表達(dá)水平、克隆形成數(shù)和細(xì)胞成球數(shù)以±s表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中GACAT2 RNA 表達(dá)水平、細(xì)胞克隆形成數(shù)和細(xì)胞成球數(shù)比較采用雙因素方差分析，組間兩兩比較采用Turkey 檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GACAT2 基因擴(kuò)增和真核表達(dá)載體酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：擴(kuò)增得到長度為835 bp 的GACAT2 特異基因片段。真核表達(dá)載體pc3.1 經(jīng)雙酶切后產(chǎn)生1 個(gè)長度為5 400 bp 片段。將GACAT2 目的基因與pc3.1 酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收后，進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，涂布Amp 平板，挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)增后，行PCR 法鑒定，選擇GACAT2 擴(kuò)增陽性的單克隆菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序分析，通過測序并與GenBank 中序列進(jìn)行比對(duì)，確定重組質(zhì)粒pc3.1 中插入了GACAT2 完整開放閱讀框（open reading frame，ORF）基因片段。見圖1。

圖1 pc3.1 酶切產(chǎn)物、GACAT2 基因PCR 產(chǎn)物和菌落PCR 法鑒定電泳圖Fig.1 Electrophoregrams of enzyme digested products of pc3.1, PCR products of GACAT2 gene,and colony PCR identification

2.2 2 組A549 和H1299 細(xì) 胞中GACAT2 mRNA表達(dá)水平pc3.1-GACAT2 組 A549 細(xì) 胞 中GACAT2 mRNA 表達(dá)水平（8.12±0.23）明顯高于空載體組（1.00±0.04）（t=30.98，P<0.01）。pc3.1-GACAT2 組H1299 細(xì)胞中GACAT2 mRNA表達(dá)水平（4.60±0.06） 明顯高于空載體組（1.00±0.06）（t=44.57，P<0.01）。

2.3 2 組A549 和H1299 細(xì)胞增殖活性與空載體組比較，72 和96 h 時(shí)pc3.1-GACAT2 組A549 細(xì)胞增殖活性明顯低于空載體組（P<0.01）。與空載體 組 比 較， 48、72 和96h 時(shí)pc3.1-GACAT2 組H1299 細(xì)胞增殖活性降低（P<0.01）。見圖2 。

圖2 CCK-8 法檢測不同時(shí)間點(diǎn)2 組A549 細(xì)胞(A)和H1299 細(xì) 胞(B)增 殖 活 性Fig.2 Proliferation activities of A549 and H1299 cells in two groups detected by CCK-8 assay at different time points

2.4 2 組A549 和H1299 細(xì)胞克隆形成數(shù)與空載體組（40.00 個(gè)±1.00 個(gè)）比較，pc3.1-GACAT2組A549 細(xì)胞克隆較小，克隆形成數(shù)（21.00 個(gè)±3.22 個(gè)）減少（t=5.644，P<0.01）；與空載體組（91.00 個(gè)±7.55 個(gè)） 比 較，pc3.1-GACAT2 組H1299 細(xì)胞克隆較小，克隆形成數(shù)（57.67 個(gè)±5.67 個(gè)）減少（t=3.024，P<0.05）。2 組細(xì)胞克隆形成情況見圖3。

圖3 2 組A549 和H1299 細(xì)胞克隆形成情況Fig.3 Clone formation numbers of A549 and H1299 cells in two groups

2.5 各組A549 和H1299 細(xì)胞成球數(shù)與空載體組（9.67 個(gè)±1.20 個(gè)） 比 較， pc3.1-GACAT2 組A549 細(xì)胞成球能力降低，球體偏小，成球數(shù)（20.67 個(gè)±1.33 個(gè)）減少（t=6.128，P<0.01）；與空載體組（5.00 個(gè)±0.58 個(gè)） 比較，pc3.1-GACAT2 組H1299 細(xì)胞成球能力降低，球體偏小，成球數(shù)（7.67 個(gè)±0.67 個(gè)）減少（t=3.024，P<0.05）。2 組細(xì)胞成球情況見圖4。

圖4 顯微鏡觀察2 組A549 和H1299 細(xì)胞成球情況(×100)Fig.4 Sphere formations of A549 and H1299 cells in two groups observed under microscope（×100)

3 討 論

目前有關(guān)lncRNA-GACAT2 基因相關(guān)研究較少，其在腫瘤中的具體作用機(jī)制目前尚不清楚。相關(guān)研究［15-16］顯示：GACAT2 基因在胃癌組織和胃癌相關(guān)細(xì)胞系中呈低表達(dá)，該基因表達(dá)下調(diào)與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、靜脈侵犯和神經(jīng)周圍侵犯有關(guān)。有研究［17］顯示：胃癌患者血清中GACAT2 基因呈高表達(dá)，手術(shù)后患者血清中GACAT2 mRNA 表達(dá)水平與淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和神經(jīng)周圍侵犯呈正相關(guān)關(guān)系。最新的研究［18］顯示：GACAT2 是線粒體功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可以在炎癥環(huán)境中調(diào)節(jié)牙周膜干細(xì)胞的線粒體功能和牙骨質(zhì)形成。

本研究首先構(gòu)建了lncRNA-GACAT2 真核過表達(dá)載體，建立了GACAT2 穩(wěn)定過表達(dá)的肺癌A549 和H1299 細(xì)胞，CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示：GACAT2 過表達(dá)抑制A549 和H1299 細(xì)胞的增殖能力；克隆形成實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞獨(dú)立生存能力的一種實(shí)驗(yàn)方法，形成克隆的細(xì)胞是貼壁且有增殖活性的細(xì)胞，克隆形成數(shù)和大小可以反映腫瘤細(xì)胞群體依賴性和增殖能力，因拍照儀器不支持彩色成像，本實(shí)驗(yàn)獲取的克隆形成圖片為黑白色。本研究結(jié)果顯示：過表達(dá)GACAT2 基因可以增強(qiáng)細(xì)胞在增殖過程中的群體依賴性，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs） 又稱腫瘤起始細(xì)胞（tumor initiating cells，TICs），具有維持腫瘤生長的作用，是類似于胚胎干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群。目前研究對(duì)CSCs 的生物學(xué)特性有如下共識(shí)：①具有自我更新、無限增殖和多向分化能力；②表達(dá)某些表面標(biāo)志性蛋白或具有特異的酶活性；③具有高度致瘤性；④具有高轉(zhuǎn)移潛能；⑤對(duì)多種藥物高度耐受。因此，CSCs 被認(rèn)為是臨床腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和放化療失敗的主要原因［19］。靶向清除CSCs 已成為當(dāng)今癌癥治療的重要策略和最前沿方向［20］。研究［21-23］顯示：lncRNAs 在調(diào)節(jié)CSCs的生物學(xué)行為中起重要作用。有研究［24］顯示：lncRNA-DGCR5 在NSCLC CSCs 中呈高表達(dá)，敲低DGCR5 后抑制干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Nanog 和Oct4 表達(dá)，DGCR5 可以吸附微小RNA-330-5p（microRNA-330-5p，miR-330-5p），上調(diào)其靶基因CD44 的 表 達(dá)，從 而 調(diào) 節(jié)CSCs 的 干 性［24］。腫 瘤 細(xì)胞的成球?qū)嶒?yàn)是衡量腫瘤細(xì)胞干性的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果顯示：GACAT2 基因過表達(dá)后，A549 和H1299 細(xì)胞成球能力明顯降低，表明GACAT2 可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的干性，但其具體作用機(jī)制還需深入研究。

綜上所述，GACAT2 基因作為一種抑癌基因，在肺癌中發(fā)揮重要作用，但其具體作用機(jī)制尚不清楚，本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討lncRNA-GACAT2調(diào)控肺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制和靶向治療提供了依據(jù)。