MiR-491-5p 過表達(dá)對(duì)人鼻咽癌HONE-1 細(xì)胞增殖和遷移的影響

王丹丹, 周 寧, 劉冬芹, 趙 杰, 梁 超, 代娟娟, 武 艷

（1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 濱州 256600；2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，山東濱州 256600；3.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，山東 濱州 256600；4.山東省濱州市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 濱州 256600）

鼻咽癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，占所有頭頸部惡性腫瘤的50%；其具有獨(dú)特的地理分布特征，主要分布于我國南方和東南亞地區(qū)［1］。目前，鼻咽癌的治療方法主要有放療和化療。盡管在治療策略上取得了突破，但診斷不及時(shí)和耐藥可導(dǎo)致鼻咽癌患者的臨床結(jié)果不滿意［2-3］。因此，闡明鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制對(duì)探討鼻咽癌新的治療方法有重要意義。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一類短小的單鏈非編碼RNAs，由22～25 個(gè)核苷酸組成，通過直接與靶mRNAs 的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）結(jié)合來抑制蛋白質(zhì)翻譯，從而使mRNA降解或翻譯抑制。miRNAs 參與調(diào)控各種基本的生物過程，如細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋 亡、細(xì) 胞 侵 襲 和 代 謝［1，4-5］。微 小RNA-491-5p（microRNA-491-5p，miR-491-5p） 是 一 種 保 守 的miRNA，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、脂肪生成和細(xì)胞增殖等生理過程。研究［6］顯示：miR-491-5p 在實(shí)體腫瘤，特別是生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)腫瘤中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。然而，miR-491-5p 在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚不明確。本研究探討過表達(dá)miR-491-5p 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖和遷移的影響，為鼻咽癌的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒、主要試劑和儀器人鼻咽癌HONE-1 細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。對(duì)照質(zhì)粒和miR-491-5p 質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保存。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 購于江蘇依科賽生物科技股份有限公司，DMEM 培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購于美國BI 公司，MEM 培養(yǎng)基購于北京中科邁晨科技有限公司，LipofectamineTM3000 試劑盒購于美國Invitrogen 公司，TRIzol 試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑購于美國Thermo 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Thermo Fisher 公司。Flag 抗體、Tubulin 抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔的IgG 抗體購于美國Proteintech 公司，波形蛋白和上皮鈣黏素抗體購于武漢博士德生物工程有限公司，2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 購于江蘇近岸蛋白質(zhì)科技有限公司，CCK-8 試劑購于大連美侖生物技術(shù)有限公司。熒光顯微鏡購于日本Olympus 公司，CO2培養(yǎng)箱購于美國Thermo Fisher 公司，酶標(biāo)儀購于美國Bio-Tek 公司。

1.2 人鼻咽癌HONE-1 細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼻咽癌HONE-1 細(xì)胞采用含10%FBS 和1% 雙抗的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2飽和濕度。當(dāng)培養(yǎng)皿中細(xì)胞生長至約90%密度后，采用0.25%胰酶消化傳代。

將HONE1 細(xì)胞置于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞 密 度 達(dá) 到 約70% 時(shí) 開 始 轉(zhuǎn) 染。 將3 μL LipofectamineTM3000 加入至25 μL MEM 培養(yǎng)基中，然后將其加入至含3 μL P3000 和1.5 μg 質(zhì)粒（對(duì)照 組） 或miR-491-5p 質(zhì) 粒（miR-491-5p 組） 的MEM 培養(yǎng)基中，室溫下共孵育15 min，分別加入至對(duì)應(yīng)的6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h后采用熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率=綠色熒光細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3 CCK-8 法檢測(cè)2 組HONE-1 細(xì)胞增殖活性

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔1×103個(gè)的密度接種至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后設(shè)置為0 h，每孔加入5 μL CCK-8 試劑后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，采用酶標(biāo)儀于450 nm 處檢測(cè)2 組細(xì)胞吸光度（A）值，以A 值代表細(xì)胞增殖活性。在24、48和72 h 分別重復(fù)上述操作。以0 h 時(shí)平均A 值進(jìn)行歸一化處理后（將0 h 時(shí)平均A 值設(shè)為1），以歸一化處理后的A 值代表細(xì)胞增殖活性， 采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪圖。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。

1.4 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)2 組HONE-1 細(xì)胞遷移數(shù)收集2 組HONE-1 細(xì)胞， 采用無血清DMEM 培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞密度為3×104mL－1，將稀釋后的細(xì)胞混勻后，吸取100 μL 細(xì)胞懸液加入至Transwell 小室的上室，于Transwell 小室的下室中 加入800 μL 含20% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。采用鑷子取出小室后采用棉簽輕輕吸凈小室內(nèi)液體，結(jié)晶紫染色1 min 后采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS） 清洗，去除多余結(jié)晶紫，于顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值，并采用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪圖。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（ real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測(cè)HONE-1 細(xì)胞中波形蛋白和上皮鈣黏素mRNA 表達(dá)水平收集2 組細(xì)胞，分別加入500 μL TRIzol 試劑，室溫下充分裂解后加入100 μL 氯仿，4 ℃、12 000 r·min－1離心10 min，吸取上清于新管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻， 室溫下靜置10 min， 4 ℃、12 000 r·min－1離 心10 min，棄 上 清，加 入1 mL 75%乙醇，相同條件再次離心，棄上清，室溫干燥10 min，加入無核酸酶水溶解RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并檢測(cè)其濃度和完 整 性。 采 用2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。引物序列：E-cadherin正向引物 5'-GCCTCCTGAAAAGAGAGTGGAAG-3'， E-cadherin 反向引物5'-TGGCAGTGTCTCTCCAAATCCG-3'；Vimentin正向引物5'-CGCCAACTACATCGACAAGGTGC-3'， Vimentin反向引物5'-CTGGTCCACCTGCCGGCGCAG-3'；GAPDH 正向引物5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3'，GAPDH 反向引物5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'；反應(yīng)條件：95 ℃、15 s，53 ℃、30 s，72 ℃、20 s，共35 個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，以GAPDH 為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計(jì)算相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平。

1.6 Western blotting 法檢測(cè)HONE-1 細(xì)胞中波形蛋白和上皮鈣黏素蛋白表達(dá)水平收集2 組細(xì)胞，采用RIPA 細(xì)胞裂解液提取總蛋白。采用濕轉(zhuǎn)方式將蛋白從10% SDS-PAGE 凝膠電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用5%脫脂牛奶室溫下?lián)u床封閉1 h，分別采用抗波形蛋白抗體（1∶2 000）、抗上皮鈣黏素抗體（1∶1 000）和抗GAPDH 抗體（1∶3 000）于4 ℃搖床上孵育過夜。次日TBST 清洗3 次，置入稀釋好的HRP 標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠抗體（1∶2 000）中，室溫下?lián)u床孵育1 h，TBST 溶液洗膜3 次。采用極敏感增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（enhanced chemilumin escence，ECL）試劑盒進(jìn)行曝光成像，以 GAPDH 作為內(nèi)參蛋白，采用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶 灰度值/GAPDH 條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，過表達(dá)miR-491-5p 后2 組細(xì)胞增殖活性、遷移細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞中波形蛋白及上皮鈣黏素mRNA 和蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2 組HONE-1 細(xì)胞中質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率在熒光顯微鏡下觀察HONE1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒72 h 后，對(duì)照組和miR-491-5p 組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率均>70%，可初步判定轉(zhuǎn)染成功。見圖1。

圖1 熒光顯微鏡觀察2 組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率（Bar=100 μm）Fig.1 Transfection rates of cells in two groups detected by fluorescence microscope（Bar=100 μm）

2.2 2 組細(xì)胞增殖活性作用24、48 和72 h 時(shí)，與對(duì)照組比較， miR-491-5p 組HONE-1 細(xì)胞增殖活性明顯降低（P<0.05 或P<0.01）。見圖2。

圖2 CCK-8 法檢測(cè)2 組HONE-1 細(xì)胞增殖活性Fig.2 Proliferation activities of HONE-1 cells in two groups detected by CCK-8 method

2.3 2 組HONE-1 細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組（110 個(gè)±10 個(gè)）比較，miR-491-5p 組 侵襲細(xì)胞數(shù)（44 個(gè)±9 個(gè)） 明顯減少（t=9.639，P<0.01）。見圖3。

圖3 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)2 組HONE-1 細(xì)胞遷移情況（結(jié)晶紫，×400）Fig.3 Migration of HONE-1 cells in two groups detected by Transwell chamber assay (Crystal violet, ×400)

2.4 2 組HONE-1 細(xì)胞中波形蛋白和上皮鈣黏素mRNA 表達(dá)水平與對(duì)照組比較， miR-491-5p 組HONE1 細(xì)胞中波形蛋白mRNA 表達(dá)水平明顯降低（t=7.535，P=0.001 7），上皮鈣黏素mRNA 表達(dá)水平明顯升高（t=4.880，P=0.039 5）。見圖4。

圖4 RT-qPCR法檢測(cè)2組HONE1細(xì)胞中波形蛋白（A）和上皮鈣黏素（B） mRNA 表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of Vimentin （A） and E-cadherin（B） mRNA in HONE-1 cells in two groups detected by RT-qPCR method

2.5 2 組HONE-1 細(xì)胞中波形蛋白和上皮鈣黏素蛋白表達(dá)水平Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：miR-491-5p 組HONE-1 細(xì)胞中波形蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（t=7.219，P＝0.018 7）；上皮鈣黏素蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（t=5.754，P=0.028 9）。見圖5。

圖5 Western blotting 法檢測(cè)2 組HONE1 細(xì)胞中波形蛋白和上皮鈣黏素蛋白表達(dá)情況Fig.5 Expressions of Vimentin and E-cadherin proteins in HONE-1 cells in two groups detected by Western blotting method

3 討 論

在鼻咽癌中存在多種異常表達(dá)的miRNAs，如在鼻咽癌細(xì)胞中miR-663 通過靶向結(jié)合細(xì)胞周期抑制因子CDKN1A，抑制其表達(dá)水平，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的發(fā)生［7］。在鼻咽癌組織中miR-125b 表達(dá)升高，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖，抑制其 凋 亡［8］。miR-9 可 以 直 接 靶 向C-X-C 基 序 趨 化 因子 受 體4 （C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4），從而抑制鼻咽癌的發(fā)生［9］。上述研究結(jié)果顯示miRNAs 在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示：過表達(dá)miR-491-5p 抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和遷移，因此miR-491-5p 有望成為治療鼻咽癌的新靶點(diǎn)。

miR-491-5p 在不同的人類腫瘤中具有多效性，近年來，miR-491-5p 在各類癌癥中的作用機(jī)制得到廣 泛 關(guān) 注。在 食 管 鱗 癌［10］、胃 癌［11］、肝 細(xì) 胞癌［12］、結(jié) 直 腸 癌［13］和 乳 腺 癌［14］組 織 中，miR-491-5p 通過靶向特定的mRNA 發(fā)揮腫瘤抑制作用；而在肺腺癌［15］、急性淋巴細(xì)胞白血病［16］和急性髓系白血?。?7］中，miR-491-5p 促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前miR-491-5p 在鼻咽癌中的作用及其機(jī)制尚不明確，因此深入探討miR-491-5p 在鼻咽癌中的作用機(jī)制較重要。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，過表達(dá)miR-491-5p 組鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力和遷移能力降低，表明miR-491-5p 在鼻咽癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因的作用。

上 皮-間 質(zhì) 轉(zhuǎn) 化 （epithelial-mesenchymal transition，EMT） 是指在一定的生理或病理情況下，上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)細(xì)胞表型的生物學(xué)過程。這是一種可逆的細(xì)胞過程，EMT 將上皮細(xì)胞暫時(shí)置于準(zhǔn)間充質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)［18-20］。正常情況下，在人體不同組織中的上皮細(xì)胞具有極性，并通過緊密連接和黏附連接方式橫向連接在一起，后者由細(xì)胞表面的E-鈣黏素蛋白形成。當(dāng)腫瘤發(fā)生時(shí)，EMT 被激活，E-鈣黏素表達(dá)被抑制，導(dǎo)致典型上皮細(xì)胞形態(tài)喪失。細(xì)胞獲得紡錘形的間質(zhì)形態(tài)，并表達(dá)與間充質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)的標(biāo)記，特別是波形蛋白［21-23］。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，過表達(dá)miR-491-5p 的HONE-1 細(xì)胞中波形蛋白mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯降低，而上皮鈣黏素mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯升高，提示過表達(dá)miR-491-5p 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的EMT 有一定抑制作用。本研究存在一定局限性：①僅從細(xì)胞增殖、遷移和EMT 關(guān)鍵蛋白表達(dá)方面證明了miR-491-5p 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖及遷移的影響，未涉及miR-491-5p對(duì)鼻咽癌細(xì)胞抑制作用的具體調(diào)控機(jī)制；②僅從細(xì)胞水平探討miR-491-5p 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的抑制作用，尚未涉及動(dòng)物層面。本課題組后續(xù)將從上述2 個(gè)層面入手，深入剖析miR-491-5p 在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

本研究通過在鼻咽癌HONE1 細(xì)胞中過表達(dá)miR-491-5p，驗(yàn)證了miR-491-5p 表達(dá)上調(diào)可以抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和EMT，表明miR-491-5p可能是鼻咽癌治療的潛在靶點(diǎn)，為鼻咽癌發(fā)病機(jī)制和治療方式研究提供依據(jù)。