二氧化硫?qū)Υ笫蠹毙孕募∪毖獡p傷后心肌纖維化的改善作用及其機(jī)制

劉 星, 劉佳麗, 聶連桂, 劉茂軍, 趙俊雄, 汪劉洋, 楊 軍

（南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科， 湖南 衡陽(yáng) 421001）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是冠心病最嚴(yán)重的表現(xiàn)，也是全世界最常見(jiàn)的致死原因之一［1］。盡管溶栓治療和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI） 血 運(yùn) 重建等治療手段明顯提高了MI 患者的早期存活率，但發(fā)生MI 時(shí)，心肌急性缺血損傷導(dǎo)致的病理性心肌重構(gòu)可導(dǎo)致患者心功能下降，嚴(yán)重影響MI 患者的 遠(yuǎn) 期 預(yù) 后［2］。心 肌 纖 維 化（myocardial fibrosis，MF） 是心肌重構(gòu)的主要病理表現(xiàn)形式，與MI 后患者的預(yù)后不良有密切關(guān)聯(lián)，然而目前對(duì)MF 和心肌重構(gòu)尚無(wú)針對(duì)性干預(yù)手段。

二氧化硫（sulfur dioxide ，SO2） 是一種新型內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，內(nèi)源性SO2具有多種生物學(xué)功能，對(duì)心血管系統(tǒng)具有重要作用。SO2可拮抗高血壓、抑制肺動(dòng)脈高壓、改善動(dòng)脈粥樣硬化和降低心臟缺血再灌注損傷，其內(nèi)在機(jī)制可能與維持鈣穩(wěn)態(tài)、抑制氧化應(yīng)激、抗炎、調(diào)節(jié)自噬和細(xì)胞凋亡有關(guān)聯(lián)［3-4］。WANG 等［5］研究顯示： SO2可以通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而改善MI 后MF，但其機(jī)制尚未完全闡明。自噬是一種通過(guò)溶酶體降解途徑自我吞噬的生理過(guò)程，在不同的細(xì)胞環(huán)境和條件下發(fā)揮促生存或促死亡的作用［6］，研究［7］顯示：自噬與MF 和心肌重構(gòu)具有緊密聯(lián)系，但SO2能否通過(guò)調(diào)控自噬改善急性心肌缺血損傷后MF 尚不清楚。本研究以自噬為切入點(diǎn)，探討外源性SO2對(duì)大鼠急性心肌缺血損傷后MF 的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器于南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心挑選24 只SPF 級(jí)雄性成年SD 大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘） 2015-0002，動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK（湘）2015-0001，將其飼養(yǎng)于SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室，保持恒溫（22 ℃±2 ℃）和恒濕狀態(tài)，人工照明，晝夜交替各12 h，自由攝食攝水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵守南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法。亞硫酸鈉（Na2SO3）和亞硫酸氫鈉（NaHSO3） 均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，異丙腎上腺素（isoprenaline， ISO）購(gòu)自大連美倫生物科技有限公司，兔抗大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶8 （matrix metalloproteinase-8，MMP-8）、基質(zhì)金屬 蛋 白 酶 抑 制 劑 2 （tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9 （aspartate proteolytic enzyme containing cysteine-9，Caspase-9）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 3（aspartate proteolytic enzyme containing cysteine-3，Caspase-3）、自噬相關(guān)蛋白3（autophagy related protein 3，Atg3）、自噬相關(guān)蛋白5（autophagy related protein 5，Atg5）、自噬相關(guān)16 樣蛋白1（autophagy related 16 like protein 1，ATG16L1）、GAPDH 抗體和辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） 標(biāo)記的山 羊抗兔IgG 二抗均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒和 SDSPAGE 凝膠制備試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Masson 染色試劑盒由上海威奧生物科技有限公司提供， Tunel 試劑盒（KGA704） 由江蘇凱基生物技術(shù)有限公司提供。電源、電泳槽和轉(zhuǎn)膜槽均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和急性心肌缺血損傷動(dòng)物模型的制備先將所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨后采用隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為對(duì)照組、ISO 組（給予ISO）、ISO+SO2組（給 予ISO+SO2） 和SO2組（給予SO2），每組6 只。ISO 組和ISO+SO2組大鼠連續(xù)2 d 腹腔注射ISO（50 mg·kg－1·d－1）構(gòu)建急性心肌缺血損傷大鼠模型，對(duì)照組和SO2組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，完善心電圖及血漿肌鈣蛋白T水平檢測(cè)確定造模成功后，ISO+SO2組和SO2組大鼠腹腔注射SO2供體Na2SO3溶液（0.54 mmol·kg－1·d－1）和NaHSO3溶 液（0.18 mmol·kg－1·d－1）［8］，注射4周，同時(shí)對(duì)照組和ISO 組大鼠給予等量生理鹽水腹腔注射。

1.3 各組大鼠心電圖檢查和血漿肌鈣蛋白T 水平檢測(cè)麻醉大鼠，麻醉后迅速將其擺為平臥位并固定體位，通過(guò)導(dǎo)聯(lián)線固定，記錄標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖。隨后立即采集尾靜脈血，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)各組大鼠血漿超敏肌鈣蛋白T 水平。

1.4 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組大鼠心功能各組大鼠稱體質(zhì)量，麻醉大鼠，除去大鼠前胸體毛，固定于檢測(cè)臺(tái)上，采用M 型超聲檢測(cè)左心室運(yùn)動(dòng)情況，取心率穩(wěn)定的3 個(gè)心動(dòng)周期進(jìn)行測(cè)量，檢測(cè)各組大鼠左心室短軸縮短率（left ventricular short axis shortening rate，LVFS） 和左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.5 標(biāo)本采集和處理麻醉大鼠后開(kāi)胸取出心臟，剪取部分左心室肌組織以4%多聚甲醛固定，剩余大鼠心肌組織－80 ℃保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 Masson 染色觀察各組大鼠心肌組織中膠原沉積情況4%多聚甲醛固定的心室肌組織以梯度乙醇浸泡脫水，石蠟包埋、切片，將石蠟切片脫蠟至水化，以 Masson 試劑盒染色，按照試劑盒說(shuō)明書操作，顯微鏡下觀察，采用Image J 軟件進(jìn)行纖維化定量分析，計(jì)算各組大鼠心肌組織中膠原體積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）。CVF=膠原藍(lán)染部分面積/總面積×100%。

1.7 TUNEL 染色檢查各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率

心肌組織制成石蠟切片后，按照TUNEL 染色試劑盒說(shuō)明書操作步驟檢測(cè)心肌組織細(xì)胞凋亡率，熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率。心肌細(xì)胞凋亡率=細(xì)胞凋亡數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8 Western blotting 法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中目的蛋白表達(dá)水平取保存于－80 ℃的心肌組織，濾紙吸凈水分后剪取0.1 g，加入900 μL 細(xì)胞裂解緩沖液、9 μL 苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF），于冰上充分研磨，離心提取上清，采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，煮沸變性后冷凍保存。制備適當(dāng)濃度的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate， SDS）- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）凝膠，嚴(yán)格按照 Western blotting 實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，于4 ℃孵育一抗（稀釋比例 1∶1 000）過(guò)夜，TBST 洗膜后孵育二抗（稀釋比例1∶ 5 000） 1 h，將 PVDF 膜再次漂洗后均勻涂布顯影液，在顯影儀下顯影，將GAPDH 作為內(nèi)參，采用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH 條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠血漿肌鈣蛋白T 水平、LVFS、LVEF、心肌組織中CVF 和心肌細(xì)胞凋亡率及心肌細(xì)胞中MMP-8、TIMP-2、Caspase-3、Caspase-9、Atg3、Atg5 和Atg16L1 蛋 白 表 達(dá) 水 平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心電圖改變和血漿肌鈣蛋白T 水平與對(duì)照組比較，ISO 組和ISO+SO2組大鼠心電圖ST 段呈現(xiàn)明顯抬高，且血漿肌鈣蛋白T 水平明顯升高（P<0.05），而SO2組大鼠心電圖及血漿肌鈣蛋白T 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示ISO 組和ISO+SO2組大鼠急性心肌缺血損傷模型制備成功。見(jiàn)表1 和圖1。

圖1 各組大鼠心電圖結(jié)果Fig.1 Electrocardiogram results of rats in various groups

表1 各組大鼠血漿肌鈣蛋白T 水平Tab.1 Levels of troponin T in plasma of rats in various groups [n=6，±s，ρB/（ng·L－1）］

表1 各組大鼠血漿肌鈣蛋白T 水平Tab.1 Levels of troponin T in plasma of rats in various groups [n=6，±s，ρB/（ng·L－1）］

*P<0.05 vs control group.

Group Control ISO ISO+SO2 SO2 Plasma troponin T level 32.86±5.97 307.12±84.06*346.73±27.38*32.65±4.73

2.2 各組大鼠LVFS 和LVEF與對(duì)照組比較，ISO 組大鼠LVFS 和LVEF 明顯降低（P<0.05）；與ISO 組比較，ISO+SO2組大鼠LVFS 和LVEF明顯升高（P<0.05），提示SO2可以改善大鼠急性心肌缺血損傷后的心功能。見(jiàn)表2 和圖2。

圖2 各組大鼠超聲心動(dòng)圖結(jié)果Fig.2 Echocardiogram results of rats in various groups

表2 各組大鼠LVFS 和LVEFTab.2 LVFS and LVEF of rats in various groups(n=6，±s，η/%）

表2 各組大鼠LVFS 和LVEFTab.2 LVFS and LVEF of rats in various groups(n=6，±s，η/%）

*P<0.05 vs control group； △P<0.05 vs ISO group.

Group Control ISO ISO+SO2 SO2 LVEF 72.80±3.27 56.09±10.79*65.41±5.24△71.59±7.67 LVFS 42.26±3.20 29.86±7.33*36.17±4.19△41.45±6.85

2.3 各組大鼠心肌組織中膠原沉積情況與對(duì)照組比較，ISO 組大鼠心肌組織中CVF 明顯升高（P<0.05）；與ISO 組比較，ISO+SO2組大鼠心肌組織中CVF 明顯降低（P<0.05），見(jiàn)圖3 和4。

圖3 各組大鼠心肌組織纖維化情況（Masson 染色，×400）Fig.3 Fibrosis of myocardium tissue of rats in various groups （Masson staining，×400）

圖4 各組大鼠心肌組織中CVFFig.4 CVF in myocardium tissue of rats in various groups

2.4 各組大鼠心肌組織中MMP-8 和TIMP-2 蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，ISO 組大鼠心肌組織中MMP-8 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05），TIMP-2蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）；與ISO 組比較，ISO+SO2組大鼠心肌組織中MMP-8 蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05），TIMP-2 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織中MMP-8 和TIMP-2 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖(B)Fig.5 Eletropohregram(A) and histogram(B) of expressions of MMP-8 and TIMP-2 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

2.5 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較，ISO 組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.05）；與ISO 組比較，ISO+SO2組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低（P<0.05）。見(jiàn)圖6 和7。

圖6 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況 （TUNEL 染色，Bar=50 μm)Fig.6 Apoptosis of cardiomyocyte of rats in various groups（TUNEL staining，Bar=50 μm)

圖7 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率Fig.7 Apoptotic rates of cardiomyocytes of rats in various groups

2.6 各組大鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9 表達(dá)水平與對(duì)照組比較，ISO 組大鼠心肌組織中Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）；與ISO 組比較，ISO+SO2組大鼠心肌組織中Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）。見(jiàn)圖8。

圖8 各組大鼠心肌組織中Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.8 Eletropohregram(A) and histogram(B) of expressions of Caspase-3 and Caspase-9 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

2.7 各組大鼠心肌組織中自噬相關(guān)蛋白Atg3、Atg5 和Atg16L1 表達(dá)水平與對(duì)照組比較，ISO 組大鼠心肌組織中 Atg3、Atg5 和 Atg16L1 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）；與ISO 組比較，ISO+SO2組大鼠心肌組織中Atg3、Atg5 和 Atg16L1 蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）。見(jiàn)圖9。

圖9 各組大鼠心肌組織中Atg3、Atg5 和 Atg16L1 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.9 Eletropohregram(A) and histogram(B) of expressions of Atg3, Atg5， and Atg16L1 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

3 討 論

近年來(lái) MI 患者的早期生存率提高較多，但心肌的急性缺血性損傷多引起嚴(yán)重心肌負(fù)性重構(gòu)導(dǎo)致患者遠(yuǎn)期預(yù)后不良［9］。作為MI 后心肌重構(gòu)的主要病理表現(xiàn)，MF 也是導(dǎo)致心室順應(yīng)性下降、心力衰竭和引起各種類型的心律失常的主要原因，而拮抗心肌缺血損傷后MF 可能是改善MI 患者長(zhǎng)期預(yù)后的關(guān)鍵策略。SO2是一種無(wú)色但具有刺激性氣味的有毒氣體，近年來(lái)研究［3-4］顯示：SO2在哺乳動(dòng)物體內(nèi)可由含硫氨基酸代謝途徑內(nèi)源性產(chǎn)生，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)心血管系統(tǒng)疾病具有多種調(diào)節(jié)功能。ZHAO 等［10］研 究 顯 示：SO2可 以 調(diào) 節(jié) 自 噬 改 善 糖尿病大鼠MF，但SO2能否通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬和凋亡拮抗急性心肌缺血損傷后MF 目前尚不清楚。

注射大劑量ISO 誘發(fā)急性心肌缺血壞死是一種常用的心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ蜆?gòu)建方法，有研究［11］顯示：該方法在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心臟組織中所引起的病理生理學(xué)和形態(tài)學(xué)改變與人類MI 中觀察到的變化較為相似。本研究以腹腔注射大劑量ISO 構(gòu)建急性心肌缺血損傷大鼠模型［12］，并檢測(cè)大鼠心電圖和血漿肌鈣蛋白水平的變化。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，腹腔注射大劑量 ISO 后，ISO 組和ISO+SO2組大鼠心電圖ST 段明顯抬高，血漿肌鈣蛋白 T 水平升高，提示急性心肌缺血損傷大鼠模型構(gòu)建成功。在給予內(nèi)源性SO2連續(xù)干預(yù)4 周后， ISO 組大鼠心功能較對(duì)照組明顯降低， ISO+SO2組大鼠心功能較ISO 組明顯改善，提示SO2可以改善急性心肌缺血損傷后大鼠的心功能。

MF 主要由心肌細(xì)胞丟失、心肌成纖維細(xì)胞增殖活化和心肌細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積過(guò)度所誘發(fā)［13］，其中基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和金屬蛋白酶組織抑制物（tissue inhibitors metalloproteinases，TIMPs） 相互影響，對(duì) ECM 的穩(wěn)定進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控，而心肌成纖維細(xì)胞活化在釋放大量ECM 蛋白的同時(shí)還分泌MMPs，對(duì)ECM 進(jìn)行分解和重塑促進(jìn)纖維化的發(fā)生［14］。有研究［15-16］顯示：纖維化的發(fā)展與MMPs 上調(diào)和TIMPs 下調(diào)有密切關(guān)聯(lián)，含有TIMP-2 的外泌體可以抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖和活化。其中MMP-8 主要由中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可以有效地降解Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型膠原蛋白及蛋白聚糖和纖連蛋白等［17］，TIMP-2 能抑制多 數(shù)MMPs 的 活 性［18］。本 研 究 結(jié) 果 顯 示：ISO 組大鼠發(fā)生明顯的MF，而SO2組大鼠MF 情況得到了改善。與對(duì)照組比較，ISO 組大鼠心肌組織中MMP-8 蛋白表達(dá)水平升高、TIMP-2 蛋白表達(dá)水平降低；與ISO 組比較，ISO+SO2組大鼠心肌組織中MMP-8 蛋白表達(dá)水平降低、TIMP-2 蛋白表達(dá)水平升高，提示SO2可以減輕ISO 誘導(dǎo)的急性心肌缺血損傷后的MF，且其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs 比值有關(guān)。

研究［19］顯示：細(xì)胞凋亡是MI 期間導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的主要過(guò)程。心肌細(xì)胞的過(guò)度凋亡可導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)急劇下降，并刺激心肌成纖維細(xì)胞增殖活化、促進(jìn)ECM 沉積，誘發(fā)MF；相反，有效抑制心肌細(xì)胞凋亡可以改善MF［20］。Caspase 家族在細(xì)胞凋亡中起重要作用［21］，在缺血缺氧等促凋亡刺激下，心肌細(xì)胞中的Caspase 家族級(jí)聯(lián)通路被激活，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，ISO 組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率升高、心肌組織中Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達(dá)水平升高；與ISO 組比較，ISO+SO2組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低，且Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達(dá)水平降低，提示SO2改善急性心肌缺血損傷后MF可能與減少心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

自噬是降解細(xì)胞質(zhì)成分和功能失調(diào)的細(xì)胞器的重要過(guò)程，在正常生理?xiàng)l件下，自噬在維持心肌細(xì)胞功能和存活方面起重要作用。然而，過(guò)度的自噬可導(dǎo)致功能性細(xì)胞器和重要蛋白質(zhì)降解，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡［22］。有研究［23］顯示：嚴(yán)重的缺血缺氧等損傷應(yīng)激可導(dǎo)致心肌細(xì)胞過(guò)度自噬，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡和心臟功能障礙。REN 等［24］研究顯示：抑制過(guò)度自噬可以預(yù)防大鼠MI 后心功能不全和MF。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，ISO 組大鼠心肌組織中Atg3、Atg5 和Atg16L1 蛋白表達(dá)水平升高，提示存在過(guò)度激活的細(xì)胞自噬；與ISO 組比較，ISO+SO2組 大 鼠 心 肌 組 織 中Atg3、 Atg5 和Atg16L1 蛋白表達(dá)水平明顯降低，表明SO2可拮抗急性心肌缺血損傷大鼠心肌組織中的過(guò)度自噬，而SO2可能通過(guò)抑制過(guò)度自噬拮抗細(xì)胞凋亡而改善MI 后的MF。

綜上所述， SO2干預(yù)后急性心肌缺血損傷大鼠MF 得到明顯改善，同時(shí)心肌細(xì)胞凋亡明顯減少，細(xì)胞自噬水平明顯降低，表明SO2可以改善急性心肌缺血損傷后MF，其機(jī)制可能與抑制過(guò)度自噬并減少心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，而調(diào)控SO2氣體微環(huán)境可能成為拮抗急性心肌缺血損傷后MF 的新思路和新策略。